5第五章--酶的固定化

3、固定化后酶的考察项目：
（1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过 程的活力回收率。
（2） 考察固定化酶稳定性。
（ 3） 考察固定化酶最适反应条件。
35
二、酶的固定化方法
（一） 吸附法 （二）结合法 （三）交联法 （四） 包埋法（entrapping method）
36
（一） 吸附法
应用实例1：固定化乳糖酶-连续生产低乳糖奶
增加了固定化的成 本，使工厂开始投 资大
只能用于可溶性的底
物和小分子底物，对
大分子底物不适宜
11
固定化酶的优缺点：
优点：
多次使用 可以装塔连续反应 纯化简单 提高产物质量 应用范围广
缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难
12
第二节 固定化酶的性质及其影响因素 一、影响固定化酶性质的因素 二、固定化后酶性质的变化 三、评价固定化酶的指标
51
B 、叠氮法
对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体 ，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物，最后与酶偶联 。
52
C、烷基化反应法
含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活 化，形成含有卤素基团的活化载体。
53
D、硅烷化法（APTS氨化法）
用于含有羟基载体的活化，可在二氧化硅表面引 入氨基，活化的表面可以利用一些中间分子进一步和 酶分子发生连接反应。 一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。 多孔玻璃特点： ① 机械强度好，表面积大。 ② 耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长
32
一、一般方法及特点
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体 以及稳定性研究、改进。 1． 四大类方法： 吸附法（包括电吸附法） 结合法（无机多孔材料） 交联法（双功能试剂） 包埋法（微胶囊法）
33
2、选择方法依据：
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
34
26
三、评价固定化酶的指标：
3、
酶结合效率，又称为酶结合率，是指酶与载体 结合的百分率。
4、
酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固 定化的总酶活力的百分率。
27
5、相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量 的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对 酶活力。
6、固定化酶的操作半衰期：在连续测定条件下， 固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的 连续工作的时间。
液发生化学反应； （6）成本要低。
9
固定化酶的优点
长时间使用，
在绝大多数情
况下提高了酶 的稳定性，有
1
利用工艺的连
续化和管道化
优点
极易将固定
化酶与底物、
2
产物分开
酶反应过程可
以严格控制，
有利于工艺自
3
动化和微电脑
化
酶的使用效
率提高，适
4
合于多酶反
应
10
酶固定化时酶 的活力有所损 失.
固定化酶的缺点
28
四、固定化酶的活力测定方法介绍
1、间歇测定：在搅拌或震荡反应中，在与溶液 酶相同测定条件下进行，然后间隔一段时间取 样，过滤后按常规方法测定产物生成量或底物 的消耗量。 此法操作简单。
29
四、固定化酶的活力测定方法介绍
2、 连续测定法 利用连续分光光度法等测定方法可以对固
定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化 酶的酶活力。
57
交联法是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间 交联的固定化方法。此法与共价结合法一样也是 利用共价键固定酶，所不同的是它不使用载体。
常选用的惰性蛋白主要有牛血清白蛋白、卵 清蛋白、明胶、胶原以及血红蛋白等。
58
（三）交联法常用试剂
常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺等。应 用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白 质的游离氨基形成席夫碱(shiff)，而使蛋白发生交联。
-
-
++++++-++ -
--
-
-+-+++++++
载体：DEAE-纤维素、 TEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶
……
45
2、共价键结合法
（1）概念：酶分子与载体之间以共价键作用而实现 结 合的固定化方法。
（2）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧 基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效
率高、专一性强、作用条件温和等特点。
3
游离酶的缺陷：
大多数游离酶的稳定性比较差 ； 游离酶的使用成本较高； 一些游离酶存在自水解作用； 产物的分离提纯困难。
4
固定化酶的发展史
在20世纪20年代，就出现了酶工程，以自然酶制 剂在工业上大规模应用的特征，原料以动植物为主
结合后不能生成产物。
21
pH对固定化酶的影响：
1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动;载体带正 电荷，pH向酸性方向移动。
22
3、pH的变化
2）产物性质对体系pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH
值比游离酶的pH值高；反之则低
23
4、最适温度变化 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
第五章 酶和细胞的固定化
1
主要内容
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用
2
第一节 概述
什么是酶？
催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。
是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反 应速度，但不改变反应的平衡点。
61
2、酶辅助蛋白交联（共交联法）
为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰 而引起酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（ 即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等 ）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交 联。
62
注意与共价结合法的区别
活化方法基本相同； 共价结合法：载体首先活化，然后除去游离
等。
54
E 、溴化氰法
本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质 。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂 糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化 氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用 很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。
55
E 、溴化氰法
56
（三）交联法
应用实例：白色污染的消除
酸、脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷 酸等 要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯 度。
43
选择适宜载体，使之ห้องสมุดไป่ตู้过共价键或离子键与酶结合 在一起的固定化方法称为结合法。
1、离子键结合法 2、共价键结合法☆
44
（1）离子结合法：通过离子键使酶与载体 结合的固定化方法。
+ -+
+-+ -
48
A、重氮法
反应示意式如下：
49
A、重氮法
目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯 磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚 糖凝胶和琼脂等
该方法需要载体具有芳香族氨基
50
B、叠氮法
例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白 酶，步骤如下： （1）酯化 （2） 肼解 （3） 叠氮化 （4） 偶联
5、底物特异性变化 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
24
6、米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （1） 载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶
降低了酶的亲和力。 （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km‘ < Km
的多功能试剂后再加入酶与载体共价偶联； 共交联法是将酶和载体以及交联剂同时加入
到同一反应体系中实现共价偶联。
19
2 、固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
20
3、pH的变化
pH对酶活性的影响：
（1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或
40
活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多 孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石。 优点：操作简单、条件温和、
载体廉价易得、可反复使用。 缺点：结合力不劳、容易脱落。
41
（二）结合法
应用实例：生活中的酶电极：血糖试纸
42
酶电极： 特点：快速、方便、灵敏、精确 范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机
1953年，Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚 苯乙烯树脂对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定， 产生了固定化酶技术。
5
1969年，千田一郎等用固定化氨基酰化酶技 术拆分了DL-氨基酸，生产L-氨基酸，随后固定 化天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸等，开创了固定化 酶应用的局面。
1971年，第一次国际酶工程会议在美国召开，会议 主题是固定化酶的研制和应用,确定固定化酶 （Immobilized Enzyme）统一名称
酶蛋白分子彼此交叉连接 起来，形成网络结构
59
（三）交联法的形式
酶直接交联法 交联法有2种形式 酶辅助蛋白交联法
60
1、酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶 性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液 pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。
操作简单，但固定化过程条件控制相对比较困 难、制备的固定化酶活力回收率相对较低、形 成的固定化酶机械强度不足。
16
（5）扩散限制效应 外扩散限制 内扩散限制
17
二、固定化后酶性质的变化
1、固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反 应速度下降
原因：酶结构的变化
空间位阻
18
二、固定化酶的性质
固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高。
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高。
13
一、影响固定化酶性质的因素 1、酶本身的变化，主要是由于活性中
心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。
14
一、影响固定化酶性质的因素
2、载体的影响
（1） 构象效应 （2） 空间屏蔽效应
15
（3） 微扰效应 （4）分配效应：载体
与底物带相同电荷-底 物少；反之则多。
30
总结：固定化酶的性质及其影响因素提要
酶本身的变化
影响固定化酶性质的因素 载体的影响
固定化酶的性质
固定化对酶活性的影响 固定化对酶稳定性的影响 最适pH的变化 最适温度变化 底物特异性与游离酶不同 米氏常数Km的变化
评价固定化酶的指标 评价指标
活力测定方法
31
第三节 固定化酶的制备
一、一般方法及特点 二、酶的固定化方法
奶子糖粳米粥
乳糖不耐症
固定化乳糖酶
37
利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶
38
应用实例2：污水的生物净化
39
吸附法是利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体 吸附在其表面上而使酶固定化的方法。
选择载体的原则： （1）要有巨大的比表面积； （2） 要有活泼的表面； （3） 便于装柱进行连续反应。
6
1973年，日本首次在工业上固定化大肠杆菌菌体中天门冬 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸 固定化死菌体
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精 固定化细胞
1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功 固定化植物细胞
1982年日本固定化黄色短杆菌原生质体生产谷氨酸 固定化原生质体
7
什么是固定化酶？
固定化酶（Immobilized Enzyme）：通过物理的 或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或 将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流 动，但能使酶充分发挥催化作用
水溶性酶
水不容性的载体
固定化技术
固定化酶 8
固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性； （2）有利于生产自动化、连续化； （3）应有最小的空间位阻； （4）酶与载体必须结合牢固； （5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反应
25
三． 评价固定化酶的指标：
1、酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催 化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个 酶活单位。 1 Kat =1 mol/s = 60 mol/min = 60*106 umol/min = 6*106 IU
2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA （DNA)所具有的酶活力单位
（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、 无机载体
46
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
首先载体上引进活泼基团 然后活化该活泼基团
关键
最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共 价键
47
（4）载体活化的方法： A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 D．硅烷化法 E．溴化氰法