第五章 固定化酶与固定化细胞
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第五章 固定化酶和细胞
制备固定化酶的依据
1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、 1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化 固定化酶必须能保持酶原有的专一性 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 固定化酶应能回收 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作 固定化酶应用于机械化和自动化操作， 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体 常有一定的机械强度。 常有一定的机械强度。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性 固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即 要保护活性中心基团。 要保护活性中心基团。 5.固定化酶应能最大程度与底物接近 固定化酶应能最大程度与底物接近， 5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产 具有最小的空间位阻。 量。具有最小的空间位阻。 6.固定化酶应有最大的稳定性 固定化酶应有最大的稳定性。 6.固定化酶应有最大的稳定性。 7.固定化酶应易与产物分离 固定化酶应易与产物分离。 7.固定化酶应易与产物分离。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 1973年 随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日 本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L 天门冬氨酸。 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 固定化细胞技术 技术。 1976年 固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年 日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 固定化原生质体生产谷氨酸 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 更有利于胞内物质的分泌， 更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的 变革提供了新的方向。 变革提供了新的方向。
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
酶和细胞的固定化
交联法
交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶 分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化 方法。采用不同的交联条件和在交联体系中添 加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定 化酶。
交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定 酶，所不同的是它不使用载体。交联法制备较 难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法 的辅助手段。常用的双功能试剂有戊二醛、己 二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用 最广泛的是戊二醛。
共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定 化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载 体表面反应基团进行共价结合的方法。一般先 用化学方法将载体活化，再与酶分子表面的某 些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价 键。
共价结合法的优缺点
共价结合法所得的固定化酶与载体结合比较牢 固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前 研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较 其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更 加严重。
缺点：但酶和载体之间结合力弱，pH、温度、 离子强度等条件的变化都易使酶从载体脱落， 并且污染催化反应产物。
离子结合法
离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交 换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载 体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换 树脂，如DEAE-纤维素 、AmberliteCG-50 、 XE-97和Dowex-50等。
物理吸附法：是利用酶和载体间的非特异性物 理吸附作用将酶固定在载体表面，这些物理吸 附作用包括范德华力、氢键、疏水作用、静电 作用等。
物理吸附法的优缺点
优点：条件温和，工艺简便，载体选择范围很 大，吸附时既可实现酶的固定化又可以达到纯 化的目的，吸附后酶的构象变化较小或基本不 变，因此对酶的催化活性影响小。
如光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化 酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于 条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。
酶与蛋白质工程固定化酶与固定化细胞演示文稿
(3) 偶联反应
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和 的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行 现已有多种偶联反应能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定作用，必须考
虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素
如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用
DEAE-纤维素载体有效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附
此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及
酶和载体的特性相关
➢ pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附
酶与蛋白质工程固定化酶与固 定化细胞演示文稿
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（优选）酶与蛋白质工程固定 化酶与固定化细胞
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固定化酶
固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点：
(1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化 了提纯工艺
(2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化 (3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化 (4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性
(5) 较能适应于多酶反应
(6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低
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固定化酶
砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每一葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可 与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶
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例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和 的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行 现已有多种偶联反应能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定作用，必须考
虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素
如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用
DEAE-纤维素载体有效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附
此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及
酶和载体的特性相关
➢ pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附
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（优选）酶与蛋白质工程固定 化酶与固定化细胞
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固定化酶
固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点：
(1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化 了提纯工艺
(2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化 (3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化 (4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性
(5) 较能适应于多酶反应
(6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低
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固定化酶
砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每一葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可 与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶
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例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。
（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。
（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。
（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。
（5）应用实例：生产高果糖浆①原料：葡萄糖②原理：葡萄糖果糖③生产过程及示意图：a.反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。
b.提高了果糖的产量和品质。
2、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。
（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。
二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2、方法：①物理吸附法 ：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里③化学结合法：将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。
葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
〖思考〗活化是指什么？在缺水状态下，微生物处于休眠状态。
活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
注：加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中注：1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。
固定化酶与固定化细胞 ppt课件
• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系 统。
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4
优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度；
②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
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5
第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
缺点：结合力弱，易解吸 附。
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17
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
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18
1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差
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23
戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
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24
交联反应既能发生在分子间，也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
11
优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。
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12
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
第五章固定化酶和细胞
缺点： 1.固定化过程中往往会引起酶的失活 2.固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。
在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素 主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的 性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物 分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载 体的空间位阻作用引起的。
本章 目录
5 固定化酶的应用
中通CO2气体进行反应 实现了辅酶的内部循环 该固定化系统表现出较好的
循环使用的稳定性
酶和辅酶 共固定化
（ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ）
E2 E1
环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒 石酸
江苏 常茂生化
底 物
产 物
常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的
DL-乙酰氨基酸拆分
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。
在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素 主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的 性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物 分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载 体的空间位阻作用引起的。
本章 目录
5 固定化酶的应用
中通CO2气体进行反应 实现了辅酶的内部循环 该固定化系统表现出较好的
循环使用的稳定性
酶和辅酶 共固定化
（ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ）
E2 E1
环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒 石酸
江苏 常茂生化
底 物
产 物
常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的
DL-乙酰氨基酸拆分
固定化酶与固定化细胞
世界上第一种工业化生产的固定化
酶 乙酰 -DL — Ala
L — Ala +乙酸
乙酰 -D — Ala
.
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化 酶柱子
消
泵
离心机
旋
反
应
器
反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
.
2.葡萄糖异构酶 世界上生产规模
最大, 应用最为成功 的一种固定化酶。
.
固定化方法
吸附法
包埋法 共价结 交联法
物理吸附法 离子吸附法
合法
制备难易 易
易
较难 难
较难
结合程度 活力回收
弱
中等
高，酶易流失 高
强
强
强
高
低
中等
再生
可能
可能
不能 不能 不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
不变
.
不变 可变 可变
三 细胞的固定化方法
• 1.固定化细胞的分类 • 2.固定化方法
.
1.固定化细胞的分类
.
3.固定化原生质体
意义:
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩
散障碍，有利于氧的传递，营养成分
的吸收和胞内产物的分泌。
(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定
化后，由于载体的保护作用，稳定性
提高。
.
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 (二) 蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法) 2.考马斯亮蓝法 .
固定化酶和固定化细胞课件
硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。
11
离子吸附法 ?离子吸附法 (ion adsorptio是n)通过离子键使酶与含
有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化 方法。 ?此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、 β-淀粉 酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。
12
? 离子吸附法常用的载体： ?阴离子交换剂： DEAE纤- 维素、四乙氨基乙基
响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反 复使用。 ? （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固 定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中 不易破坏或受损。
6
? （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 ? （5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，
所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反 应。 ?1）凝胶包埋法 ?将聚合物的 单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂 )的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ?凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等 天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等 合成 凝胶或树脂 。
15
? （2）微胶囊包埋法 ?微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的 半 透膜微胶囊 内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
21
?（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
? 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
22
?（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
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离子吸附法 ?离子吸附法 (ion adsorptio是n)通过离子键使酶与含
有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化 方法。 ?此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、 β-淀粉 酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。
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? 离子吸附法常用的载体： ?阴离子交换剂： DEAE纤- 维素、四乙氨基乙基
响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反 复使用。 ? （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固 定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中 不易破坏或受损。
6
? （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 ? （5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，
所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反 应。 ?1）凝胶包埋法 ?将聚合物的 单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂 )的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ?凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等 天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等 合成 凝胶或树脂 。
15
? （2）微胶囊包埋法 ?微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的 半 透膜微胶囊 内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
21
?（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
? 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
22
?（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
第五章-固定化酶..
理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此空间 进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化酶或细 胞。 固定化酶:固定在载体上，并在一定范围内进行催化反 应的酶。
2
一、固定化酶发展简史
3
一、固定化酶发展简史
1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定 化研究，并第一次实现了酶的固定化。
2、空间障碍效应
固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的 空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位 造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易与底物或效应 物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所 造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效 应。
34
三、固定化酶的性质
酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适 pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的 话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。
40
三、固定化酶的性质
4、固定化酶的最适温度的变化
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度 的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提 高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的 结果。
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三、固定化酶的性质
5、米氏常数Km的变化
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 由于酶高级结构变化及载体影响，引起酶与底物亲和力 变化，从而使Km变化。 这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高， 载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至 消失。
三、固定化酶的性质
（二） 固定化酶性质的改变
1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下 降，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因：
2
一、固定化酶发展简史
3
一、固定化酶发展简史
1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定 化研究，并第一次实现了酶的固定化。
2、空间障碍效应
固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的 空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位 造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易与底物或效应 物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所 造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效 应。
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三、固定化酶的性质
酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适 pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的 话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。
40
三、固定化酶的性质
4、固定化酶的最适温度的变化
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度 的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提 高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的 结果。
41
三、固定化酶的性质
5、米氏常数Km的变化
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 由于酶高级结构变化及载体影响，引起酶与底物亲和力 变化，从而使Km变化。 这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高， 载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至 消失。
三、固定化酶的性质
（二） 固定化酶性质的改变
1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下 降，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因：
固定化酶与固定化细胞
固定化多酶反应
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
第五章 固定化酶
Immobilization of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption: Comparison with the free enzyme
第三节辅酶的固定化
1.需辅酶的酶的固定化 ① 直接将酶蛋白共价结合于载体，向反应 系统补充辅酶。
• 外扩散限制：指上述物质从宏观体系穿 过包围在固定化酶颗粒周围的近乎停滞 的液膜层(Nernst层)到颗粒表面所受的限 制。
• 内扩散限制：指上述物质从颗粒表面到 颗粒内部酶所在位点所受到的限制。
第二节评价固定化酶(细胞)的指标
一、固定化酶(细胞)的活力 • 固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的
第四节细胞的固定化
1.优点： ① 固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态和天然 环境，因而更稳定； ② 省去酶的分离纯化工作，减少酶的活性损失， 固定化细的酶发挥作用，也可利用它所 包含的复合酶系完成一部分代谢乃至整个发酵过 程，特别适合需要辅助因子参与的合成代谢过程；
三、固定化酶的性质 (一)固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小。 原因：
① 酶分子在固定化过程中，空间构象会有 所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
② 固定化后，空间位阻会直接影响到活性 中心对底物的定位作用；
③ 扩散阻力使底物分子与酶的接近受阻；
(二)固定化对酶稳定性的影响 1．固定化酶表现在热稳定性提高； 2．对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提
a. 降低 ：传质限制引起的；微环境的变化 , 也可能导致微生物生长速率降低。
b.增加 ：固定化载体对微生物提供的保护作 用。免受高剪切力的作用 ，限制抑制性底 物的局部浓度
2. 固定化对微生物活性的影响 • 激活代谢活性；提高微生物次级代谢产
第三节辅酶的固定化
1.需辅酶的酶的固定化 ① 直接将酶蛋白共价结合于载体，向反应 系统补充辅酶。
• 外扩散限制：指上述物质从宏观体系穿 过包围在固定化酶颗粒周围的近乎停滞 的液膜层(Nernst层)到颗粒表面所受的限 制。
• 内扩散限制：指上述物质从颗粒表面到 颗粒内部酶所在位点所受到的限制。
第二节评价固定化酶(细胞)的指标
一、固定化酶(细胞)的活力 • 固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的
第四节细胞的固定化
1.优点： ① 固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态和天然 环境，因而更稳定； ② 省去酶的分离纯化工作，减少酶的活性损失， 固定化细的酶发挥作用，也可利用它所 包含的复合酶系完成一部分代谢乃至整个发酵过 程，特别适合需要辅助因子参与的合成代谢过程；
三、固定化酶的性质 (一)固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小。 原因：
① 酶分子在固定化过程中，空间构象会有 所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
② 固定化后，空间位阻会直接影响到活性 中心对底物的定位作用；
③ 扩散阻力使底物分子与酶的接近受阻；
(二)固定化对酶稳定性的影响 1．固定化酶表现在热稳定性提高； 2．对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提
a. 降低 ：传质限制引起的；微环境的变化 , 也可能导致微生物生长速率降低。
b.增加 ：固定化载体对微生物提供的保护作 用。免受高剪切力的作用 ，限制抑制性底 物的局部浓度
2. 固定化对微生物活性的影响 • 激活代谢活性；提高微生物次级代谢产
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。
一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。
目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
第五章酶的固定化
纯化倍数 Purification
收率 Yield (%)
(fold)
2736.9
13080.2 23314.100
30 10 9
Sepharos
e柱层析 HiTrap19 42218 0.3
Q柱层析
实验 木瓜蛋白酶的固定化
实验原理：
载体：尼龙
固定化方法：共价结合法
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺
引发剂－－inactiation
2）半透膜包埋法（微囊型）
将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和
疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体
而将酶包裹起来。
（3）结合法
1）共价结合法 ☆ 通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法（网格型） 包埋法 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
1）凝胶包埋法（网格型）
将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称
为凝胶包埋法。
首先被采用的网格包埋法是：
固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为 1个酶单位(U)(以下同)。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶活力测定：
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶， 加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
收率 Yield (%)
(fold)
2736.9
13080.2 23314.100
30 10 9
Sepharos
e柱层析 HiTrap19 42218 0.3
Q柱层析
实验 木瓜蛋白酶的固定化
实验原理：
载体：尼龙
固定化方法：共价结合法
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺
引发剂－－inactiation
2）半透膜包埋法（微囊型）
将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和
疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体
而将酶包裹起来。
（3）结合法
1）共价结合法 ☆ 通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法（网格型） 包埋法 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
1）凝胶包埋法（网格型）
将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称
为凝胶包埋法。
首先被采用的网格包埋法是：
固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为 1个酶单位(U)(以下同)。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶活力测定：
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶， 加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
第五章固定化酶
一、固定化细胞的概念和目的
概念
细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约 束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留 其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力
目的
生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶 的发酵生产。具产酶率高、发酵周期短、可连续 发酵等优点
➢ 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成 固定化细胞
6、相 对 活 力 ＝ 加 入 酶 的 总 活 固 力 定 - 化 上 酶 清 总 液 活 中 力 未 结 合 酶 活 力 1 0 0 ％
第二节结束 优点 固定化酶的优缺点
性固 质定 及化 其酶 评的 价特 指点 标、
缺点
固定化酶的性质变化
酶活力的变化 酶稳定性的变化 最适温度的变化 最适pH的变化 米氏常数(Km)的变化
4、最适pH的变化
➢ 最适pH、酶活力－pH曲线发生偏移
➢ 带负电荷载体(阴离子聚合物)，最适pH偏高， 向碱性偏移
- --
-
--
-
---
--------------------------------
+ H+ +
+++ +
H+
H+
+
+
+
+ H+
+
-
OH-
-
-
OH-
-
OH- -
-OH-
-
-
-
-
5、米氏常数(Km)的变化
（2） 考察固定化酶稳定性 （3） 考察固定化酶最适反应条件
第三节提要
固定化酶的制备原则
尽可能地保持自然酶的催化活性 载体与酶结合牢固 空间位阻较小 成本尽可能低
第五章固定化酶及固定化技术
➢ 固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制 在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发 挥催化作用的酶制剂。
➢ 酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合（ 化学偶联）及包埋等多种方法。
第六页，编辑于星期二：十九点 十一分。
酶生物反应器
✓与固定化酶技术相配套的是酶 生物反应器
✓同一般的化工容器一样，需要对酶反应器 温度和pH等条件进行严格的控制；不同的是， 酶反应器必须进行无菌操作。
选择载体的原则
（1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面
（3） 便于装柱进行连续反应。
有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶 无机载体：氧化铅、皂土、白土、 高岭土、多孔玻璃、 硅藻土、二氧化钛等
SMS:一种硅酸盐载体
第十六页，编辑于星期二：十九点 十一分。
2. 结合法
离子键结合法
➢ 是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的 方法。
结果如图所示: 固定化酶的活力基本保持稳定活力损失15% , 由此可见该固定化酶具有良好的操作稳定性
第四页，编辑于星期二：十九点 十一分。
一、固定化酶（immobilized enzyme）
什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
第五页，编辑于星期二：十九点 十一分。
第七页，编辑于星期二：十九点 十一分。
简史
1916年，Nelson & Griffin “酶不溶于水而具有活性” 1948年，Sumner 尿素酶制成非溶性酶 1953年，Grubhofer & Schleith 第一次实现了酶的固定化 1960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究 1969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于DL-AA
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第五章
固定化酶与固定化细胞
5.1
固定化酶的发展历史
发展早期 （1916年～20世纪50年代）
1916年，Nelson和Griffin首次发现氧化铝和焦炭上结 合的蔗糖酶仍具有蔗糖酶催化性。 该技术在此后40年却无人尝试， 直到在20世纪50年代后 才被接受，并主要开发研究了一些物理吸附固定酶的技术。
通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷， 能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程 的解吸。 用水溶性乙烯—顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE—纤维素和 DEAE—Scphadex载体有效的固定。 这种固定几乎是不可逆的吸附。
3 疏水性吸附固定化酶 疏水性吸附是基于载体上的疏水基团与酶的疏 水区域相互作用而发生的。 将现成的载体共价结合上长链的疏水性基团，或芳 环等，也可将疏水性化合物直接涂布在载体上。 例： 棕榈基取代的琼脂糖凝胶4B, 可以通过疏水相互作 用固定溶菌酶、胰岛素等。
吸附法
酶通过非共价键结合到水不溶性载体上的过程。
酶通过非共价键结合到载体上
非共价 键
非特异性 结合
离子键
疏水性
生物特 异性
亲和吸附
1 非特异性物理吸附固定化酶
酶通过非特异性的疏水、亲水或静电作用吸附在载体上。
物理吸附载体的分类
◇按几何形状分： 珠状、薄膜、膜、不规则形状、丝（纤维）状泡沫 ◇按结构分： 微孔（0.1-10m）、 中孔（3-10nm）、 大孔（8-1000nm）、非孔
固定化酶和水溶性酶比较具有以下优点：
◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆
极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有 酶的残留，简化了提纯工艺. 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、 管道化。 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微 电脑化。 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 较能适应于多酶反应。 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障， 成本低。
通过预聚物交联形成凝胶包埋酶
用可溶性预聚物如聚丙烯酰胺、PVA、PEI 、PAA 和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、带光致交联基团的PEG, 聚 氨酯预聚物，代替单体聚合包埋酶。 在化学交联剂、光照或放射线辐射的作用下交联。 酶的包埋用预聚体代替单体的好处在于可以减弱单体 对酶的毒害作用，尤其是对整个细胞的毒性作用。 例：用聚丙烯酰胺-酰肼预聚物，在乙二醛的作用下交联各 种酶和细胞，不会对酶分子造成伤害。
包埋法的优缺点
◆ 包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到 化学反应影响，可以制得较高活力的固定化酶．对 大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适 用的。 ◆ 但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络， 而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩 散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降 低。此外，传统的包埋方法，可能会有酶的泄漏。
固定化酶也存在一些缺点：
◆
酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化 的成本，使工厂开始投资大。
◆ 比较适应水溶性底物和小分子底物。 ◆ 与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子 的反应，同时对胞内酶需经分离后．才能固定化。
固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的。 它的优点如下:
◆ 省去了酶的分离手续．为多酶系统，无须辅因子再生。 ◆ 细胞生长快、而且多、反应快。 ◆ 可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用 分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除 了产物抑制和消耗。 ◆ 保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是 对污染因子的抵抗力增加。
应用微胶囊技术固定化天门冬酰胺酶
L-天门冬酰胺酶是一种抗白血病的酶制剂，将其静 注入人体内以后可以水解白血病细胞必需的营养源-天冬 酰胺，从而呈现出抗癌作用。
M
En
COOH
载体上的螯合基团：
OH
HN
COOH COOH
IDA
5 亲和吸附固定化酶
酶分子上的金属结合基团： 基因工程酶的标签如为多个组氨酸连成的长链 酶分子表面暴露的组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等 例： 螯合Ni2+的琼脂糖树脂亲和固定6-组氨酸标签的-RNA酶， 该固定化酶可耐受反复改变缓冲液，酶活基本不变。
物理方法形成凝胶包埋酶
温度调节的凝胶化 热可逆凝胶如异丙基丙烯酰胺随着温度的升高或降低 也有相的转变，可以用于包埋用作药物的酶或蛋白质， 控制释放药物。 pH调节的凝胶化 带有酸性基团如羧基的聚电解质，或带有碱性基团如 氨基的聚电解质，可以制备pH敏感凝胶。 如壳聚糖凝胶。
物理方法形成凝胶包埋酶 物理方法包埋酶
影响离子吸附固定酶的因素
酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温 度，载体的性质等有关。 pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载 体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附将 明显减少，但也有个别例外。 盐对吸附的影响较为复杂．在一些特殊事例中， 盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。 对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。 载体的表面积、多孔性等都影响对酶的吸附。
发展期（ 20世纪60年代） 开发了共价结合、包埋法、交联法固定酶的技术， 扩大了酶与载体的研究范围。
发展期（ 20世纪60年代）
20世纪60年末，日本田边制药公司开发利用固定化 酶(离子吸附结合的L-氨基酸酰化酶)拆分外消旋氨基酸 衍生物生产L-氨基酸获得成功。这是固定化酶的首次 工业化应用。 发展中后期（ 20世纪70年代～80年代） 淀粉酶、青霉素现化酶等固定化酶技术的进一步 工业化的应用。 固定化酶技术的改进：塑性酶、具有手臂的固定 化酶、包埋与交联技术的共用。
利用螯合的变价金属离子亲和固定酶的优缺点
◆ 固定化酶的同时可以纯化酶 ◆ 酶的附载量比其他方法高 ◆ 载体可以通过简单的处理，再重复使用 ◆ 酶的泄漏与固定化酶低的再循环能力 ◆开发配基及载体上固定配基的成本较高
5.2.2 包埋法
包埋法的定义
包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚 合促进剂(包括交联剂，引发剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。
微囊化包埋酶
将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存 在于类似细胞内的环境中，微囊一般直径约1～100um，膜厚 约100 nm，膜上孔径约3.6 nm，表面积与体积之比极大，物 质能很快达到平衡，能有效的包埋许多种酶。 同时可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物或细 胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞. 因此， 此法在医疗上极为有用。 例：
物理吸附载体的分类 ◇按材质分： 凝胶、带触须的载体、合成载体、天然载体 （如硅藻土）、无机的(如氧化铝、分子筛)、半合 成的、复合物。 例： 1)非孔硅土吸附固定化青霉素酰化酶(亲水相互作用) 2)丙烯酸-二乙烯基苯共聚物固定化脂肪酶（CRL）
2 离子吸附固定化酶 载体上的带电荷基团与酶的氨基酸残基上的电荷 相互作用的结果。 通过对用于非特异性吸附的载体进行化学修饰， 引入离子基团。 用于离子吸附的载体分类 ◇合成载体： 丙烯酰胺/顺丁烯二酸共聚物凝胶 ◇衍生的合成聚合物：如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的 衍生的离子交换树脂，如Dowex树脂等商品化树脂
例 ：聚丙烯酰胺凝胶包埋法。
将 1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有 750mg 丙 烯酰胺(单体)和40 mg N，N’—甲叉双丙烯酰胺(交联剂) 的3ml溶液中，再加0.5ml 15％的二甲氨基丙腈(加速剂)， 同时，加入1％过硫酸钾(引发剂)，混合，于25℃：保温 10min，便得含酶凝胶。 将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒．于低温储存或冷 冻干燥。 为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时， 立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度) 的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。
包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。
通过单体的聚合形成凝胶包埋酶 ◆ 常用的单体： 丙烯酰胺、丙烯酸缩水甘油酯、 N-乙 烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羟基乙酯等。 ◆ 常用的交联剂： 双丙烯酰胺 ◆ 常用的引发剂：过硫酸钾 酶的特性（如活力、稳定性或选择性）在很大程度上取 决于单体的性质、交联剂与引发剂的浓度 通过加入保护剂如惰性聚合物（如PVA）、致孔剂 (PEG 1500)等提高固定化酶的活性。
4） DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶具体操作步 骤：
将DEAE-SephadexA25充分溶胀．用0．5mol/L Na0H和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗 酶液充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温 下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L 醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，臵4℃备用。固定化酶 活力回收50-60％。 最早应用于工业化过程的固定化酶是将氨基酰化酶 吸附在DEAE-纤维素上。
4 生物特异性吸附固定化酶
利用载体上固定的①酶的抗体；②生物大分子如伴 刀豆蛋白A(专一性结合糖蛋白)；③酶的底物或抑制剂 等，与酶分子间固有的生物特异性相互作用，吸附固 定化酶。
生物分子
En
生物特异性相互作用
例： 1）Con-A-琼脂糖凝胶固定漆酶，与游离酶相比，酶 活性基本无变化。
2）生物素-玻璃珠固定CRL脂肪酶，固定化酶是游离 酶活性的4倍。
生物素是多种羧化酶的辅基,带有一长链羧与酶的定向固定化有关。 ◆ 固定化酶的稳定性增强，有可能是因为酶与载体上的 分子发生了互补性相互作用。
◆ 该技术最早用于酶的分离与纯化。
5 亲和吸附固定化酶
变价金属离子 染料分子 En
亲和相互作用
5 亲和吸附固定化酶
形成复合物的凝胶化
通过聚合物-聚合物、聚合物-盐、聚合物-无机金属 氧化物相互作用，形成凝胶。
例： 将溶解有柚皮苷酶的海藻酸钠溶液滴入CaCl2溶液中，可 形成包埋酶的凝胶小球。 该固定化酶的热稳定性增加了40%，最适pH范围加宽 它是通过盐固化的凝胶。
物理方法形成凝胶包埋酶 物理方法包埋酶
固定化酶与固定化细胞
5.1
固定化酶的发展历史
发展早期 （1916年～20世纪50年代）
1916年，Nelson和Griffin首次发现氧化铝和焦炭上结 合的蔗糖酶仍具有蔗糖酶催化性。 该技术在此后40年却无人尝试， 直到在20世纪50年代后 才被接受，并主要开发研究了一些物理吸附固定酶的技术。
通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷， 能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程 的解吸。 用水溶性乙烯—顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE—纤维素和 DEAE—Scphadex载体有效的固定。 这种固定几乎是不可逆的吸附。
3 疏水性吸附固定化酶 疏水性吸附是基于载体上的疏水基团与酶的疏 水区域相互作用而发生的。 将现成的载体共价结合上长链的疏水性基团，或芳 环等，也可将疏水性化合物直接涂布在载体上。 例： 棕榈基取代的琼脂糖凝胶4B, 可以通过疏水相互作 用固定溶菌酶、胰岛素等。
吸附法
酶通过非共价键结合到水不溶性载体上的过程。
酶通过非共价键结合到载体上
非共价 键
非特异性 结合
离子键
疏水性
生物特 异性
亲和吸附
1 非特异性物理吸附固定化酶
酶通过非特异性的疏水、亲水或静电作用吸附在载体上。
物理吸附载体的分类
◇按几何形状分： 珠状、薄膜、膜、不规则形状、丝（纤维）状泡沫 ◇按结构分： 微孔（0.1-10m）、 中孔（3-10nm）、 大孔（8-1000nm）、非孔
固定化酶和水溶性酶比较具有以下优点：
◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆
极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有 酶的残留，简化了提纯工艺. 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、 管道化。 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微 电脑化。 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。 较能适应于多酶反应。 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障， 成本低。
通过预聚物交联形成凝胶包埋酶
用可溶性预聚物如聚丙烯酰胺、PVA、PEI 、PAA 和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、带光致交联基团的PEG, 聚 氨酯预聚物，代替单体聚合包埋酶。 在化学交联剂、光照或放射线辐射的作用下交联。 酶的包埋用预聚体代替单体的好处在于可以减弱单体 对酶的毒害作用，尤其是对整个细胞的毒性作用。 例：用聚丙烯酰胺-酰肼预聚物，在乙二醛的作用下交联各 种酶和细胞，不会对酶分子造成伤害。
包埋法的优缺点
◆ 包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到 化学反应影响，可以制得较高活力的固定化酶．对 大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适 用的。 ◆ 但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络， 而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩 散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降 低。此外，传统的包埋方法，可能会有酶的泄漏。
固定化酶也存在一些缺点：
◆
酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化 的成本，使工厂开始投资大。
◆ 比较适应水溶性底物和小分子底物。 ◆ 与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子 的反应，同时对胞内酶需经分离后．才能固定化。
固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的。 它的优点如下:
◆ 省去了酶的分离手续．为多酶系统，无须辅因子再生。 ◆ 细胞生长快、而且多、反应快。 ◆ 可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用 分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除 了产物抑制和消耗。 ◆ 保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是 对污染因子的抵抗力增加。
应用微胶囊技术固定化天门冬酰胺酶
L-天门冬酰胺酶是一种抗白血病的酶制剂，将其静 注入人体内以后可以水解白血病细胞必需的营养源-天冬 酰胺，从而呈现出抗癌作用。
M
En
COOH
载体上的螯合基团：
OH
HN
COOH COOH
IDA
5 亲和吸附固定化酶
酶分子上的金属结合基团： 基因工程酶的标签如为多个组氨酸连成的长链 酶分子表面暴露的组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等 例： 螯合Ni2+的琼脂糖树脂亲和固定6-组氨酸标签的-RNA酶， 该固定化酶可耐受反复改变缓冲液，酶活基本不变。
物理方法形成凝胶包埋酶
温度调节的凝胶化 热可逆凝胶如异丙基丙烯酰胺随着温度的升高或降低 也有相的转变，可以用于包埋用作药物的酶或蛋白质， 控制释放药物。 pH调节的凝胶化 带有酸性基团如羧基的聚电解质，或带有碱性基团如 氨基的聚电解质，可以制备pH敏感凝胶。 如壳聚糖凝胶。
物理方法形成凝胶包埋酶 物理方法包埋酶
影响离子吸附固定酶的因素
酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温 度，载体的性质等有关。 pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载 体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附将 明显减少，但也有个别例外。 盐对吸附的影响较为复杂．在一些特殊事例中， 盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。 对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。 载体的表面积、多孔性等都影响对酶的吸附。
发展期（ 20世纪60年代） 开发了共价结合、包埋法、交联法固定酶的技术， 扩大了酶与载体的研究范围。
发展期（ 20世纪60年代）
20世纪60年末，日本田边制药公司开发利用固定化 酶(离子吸附结合的L-氨基酸酰化酶)拆分外消旋氨基酸 衍生物生产L-氨基酸获得成功。这是固定化酶的首次 工业化应用。 发展中后期（ 20世纪70年代～80年代） 淀粉酶、青霉素现化酶等固定化酶技术的进一步 工业化的应用。 固定化酶技术的改进：塑性酶、具有手臂的固定 化酶、包埋与交联技术的共用。
利用螯合的变价金属离子亲和固定酶的优缺点
◆ 固定化酶的同时可以纯化酶 ◆ 酶的附载量比其他方法高 ◆ 载体可以通过简单的处理，再重复使用 ◆ 酶的泄漏与固定化酶低的再循环能力 ◆开发配基及载体上固定配基的成本较高
5.2.2 包埋法
包埋法的定义
包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚 合促进剂(包括交联剂，引发剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。
微囊化包埋酶
将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存 在于类似细胞内的环境中，微囊一般直径约1～100um，膜厚 约100 nm，膜上孔径约3.6 nm，表面积与体积之比极大，物 质能很快达到平衡，能有效的包埋许多种酶。 同时可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物或细 胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞. 因此， 此法在医疗上极为有用。 例：
物理吸附载体的分类 ◇按材质分： 凝胶、带触须的载体、合成载体、天然载体 （如硅藻土）、无机的(如氧化铝、分子筛)、半合 成的、复合物。 例： 1)非孔硅土吸附固定化青霉素酰化酶(亲水相互作用) 2)丙烯酸-二乙烯基苯共聚物固定化脂肪酶（CRL）
2 离子吸附固定化酶 载体上的带电荷基团与酶的氨基酸残基上的电荷 相互作用的结果。 通过对用于非特异性吸附的载体进行化学修饰， 引入离子基团。 用于离子吸附的载体分类 ◇合成载体： 丙烯酰胺/顺丁烯二酸共聚物凝胶 ◇衍生的合成聚合物：如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的 衍生的离子交换树脂，如Dowex树脂等商品化树脂
例 ：聚丙烯酰胺凝胶包埋法。
将 1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有 750mg 丙 烯酰胺(单体)和40 mg N，N’—甲叉双丙烯酰胺(交联剂) 的3ml溶液中，再加0.5ml 15％的二甲氨基丙腈(加速剂)， 同时，加入1％过硫酸钾(引发剂)，混合，于25℃：保温 10min，便得含酶凝胶。 将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒．于低温储存或冷 冻干燥。 为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时， 立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度) 的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。
包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。
通过单体的聚合形成凝胶包埋酶 ◆ 常用的单体： 丙烯酰胺、丙烯酸缩水甘油酯、 N-乙 烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羟基乙酯等。 ◆ 常用的交联剂： 双丙烯酰胺 ◆ 常用的引发剂：过硫酸钾 酶的特性（如活力、稳定性或选择性）在很大程度上取 决于单体的性质、交联剂与引发剂的浓度 通过加入保护剂如惰性聚合物（如PVA）、致孔剂 (PEG 1500)等提高固定化酶的活性。
4） DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶具体操作步 骤：
将DEAE-SephadexA25充分溶胀．用0．5mol/L Na0H和水洗涤后，加入pH7.0—7.5的米曲霉3042粗 酶液充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温 下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L 醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，臵4℃备用。固定化酶 活力回收50-60％。 最早应用于工业化过程的固定化酶是将氨基酰化酶 吸附在DEAE-纤维素上。
4 生物特异性吸附固定化酶
利用载体上固定的①酶的抗体；②生物大分子如伴 刀豆蛋白A(专一性结合糖蛋白)；③酶的底物或抑制剂 等，与酶分子间固有的生物特异性相互作用，吸附固 定化酶。
生物分子
En
生物特异性相互作用
例： 1）Con-A-琼脂糖凝胶固定漆酶，与游离酶相比，酶 活性基本无变化。
2）生物素-玻璃珠固定CRL脂肪酶，固定化酶是游离 酶活性的4倍。
生物素是多种羧化酶的辅基,带有一长链羧与酶的定向固定化有关。 ◆ 固定化酶的稳定性增强，有可能是因为酶与载体上的 分子发生了互补性相互作用。
◆ 该技术最早用于酶的分离与纯化。
5 亲和吸附固定化酶
变价金属离子 染料分子 En
亲和相互作用
5 亲和吸附固定化酶
形成复合物的凝胶化
通过聚合物-聚合物、聚合物-盐、聚合物-无机金属 氧化物相互作用，形成凝胶。
例： 将溶解有柚皮苷酶的海藻酸钠溶液滴入CaCl2溶液中，可 形成包埋酶的凝胶小球。 该固定化酶的热稳定性增加了40%，最适pH范围加宽 它是通过盐固化的凝胶。
物理方法形成凝胶包埋酶 物理方法包埋酶