第5章 第三节、酶与固定化酶的生产

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有机溶剂提取：常用乙醇、丙酮等。
四、 固定化酶
1、概述
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
• 酶固定化后一般稳定性增加，易从反 应系统中分离，且易于控制，能反复 多次使用。便于运输和贮存，有利于 自动化生产。固定化酶是近十余年发 展起来的酶应用技术，在工业生产、 化学分析和医药等方面有诱人的应用 前景。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
凝胶
天然凝胶
包埋条件 酶活性
不变
强度
差
琼脂、海藻酸钙、 温和 角叉菜胶、明胶
合成凝胶
聚丙烯酰胺、光 聚合反应 部分失活 高 交联树脂
2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法
• 第二步：采用适当的沉淀手段将酶 沉淀分离 • 第三步：收集沉淀，干燥，研磨成 粉，加入适当的稳定剂、填充剂等 做成粉末制剂。
1、酶的提取(extraction)

酶的提取液中含有微生物菌体杂质、蛋白、
多糖、脂类和无机盐等许多杂质，必须除去这 些杂质来提高酶的纯度。
利用酶的蛋白质的性质。

（1） 提取目标：
（1）载体结合法
根据吸附剂的特点分: 1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻 璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。 此种方法得到的固定化酶，酶的活力损失少， 但酶与载体的结合力相当弱，酶容易脱落， 实用价值很小。
• 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-纤维素。 此法处理条件温和，酶活力损失少，结合力 较物理吸附法牢固。
固定化后酶性质的变化 ① 固定化对酶活性的影响：酶活性下降， 反应速度下降 原因是：酶结构的变化－－空间位阻
② 固定化对酶稳定性的影响 A 贮存稳定性比游离酶大多数提高 B 操作稳定性提高 C 对热稳定性，大多数升高，有些反而 降低 D 对分解酶的稳定性提高 E 对变性剂的耐受力升高
• 2、酶的固定化方法
*固定化酶（细胞）的评价指标
(一)酶(细胞)的活力
固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然
酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。
(二) 蛋白总量
1.双辛可宁酸法(BCA法)
2.考马斯亮蓝法
(三)半衰期
在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活 力下降为最初活力一半所经历的连续工作时 间，以t1/2表示。
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。

注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶
失活，

一般采用低温下（0~10℃）操作。
（2）提取原则
• a. 相似相溶。 • b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
（3）提取方法：
A 盐溶液提取（盐析）
常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 B 酸、碱溶液提取
第六节、酶与固定化酶的生产
• 1949年,用液体深层培养法进行细菌 α淀粉酶的发酵生产,揭开了近代酶 工业的序幕。 • 目前工业上应用的酶大多采用微生 物发酵生产。
• 采用微生物发酵法进行酶的生产的优 点： 1、微生物品种繁多、生产不受季节、气 候和地域的限制 2、容易培养，繁殖快、产量高 3、易变异，通过改变培养条件使酶的性 能更适合生产的需要。
控。
酶发酵生产的一般工艺流程
试管菌种培养
茄瓶菌种培养 孢子（菌体）悬液制备 种子罐菌种培养 发酵罐发酵 发酵液预处理 酶的分离纯化精制
摇瓶菌种培养
二、酶发酵过程中的一些简单技术问题
1、培养基的选择 （1）诱导剂的影响 在某些酶的生产中，当培养基中不存在诱 导物时，酶的合成便受阻。如淀粉、蔗糖、 纤维素分别是淀粉酶、蔗糖酶和纤维素酶 的诱导物。 当诱导物存在时，酶的生成量可以是原来 的几倍到几百倍。
常用的偶联反应有：重氮化法、
叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻
易脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶
的空间构象而影响酶的催化活性。回 收率低。
(2)交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的
固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛 O O
（1）温度 发酵过程中的吸热和放热反应 合成菌体的细胞物质和酶 吸热反应 菌体生长时分解培养基营养物质 放热反应 菌体繁殖旺盛时：放热和搅拌的机械热决定了必 须降温； 而在发酵初期，需要保温 发酵罐的热交换装臵：排管、蛇管、夹套等。
（2）pH值的控制 缓冲溶液或者改变培养基组分的比例。 （3）溶解氧： 通风和搅拌。
• 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为
不溶态。
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交 联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来 不便。
(3) 包埋法（entrapment）
将酶用物理的方法包 埋在各种载体（高聚物） 内。分为： 网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
• 研究热点——光交联树脂包埋法
例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯 预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成 一定浓度，加热至50℃，然后与一定浓度的细 胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用 紫外照射3min，就可制得。
研究热点————无载体固定化法
靠细胞的自身絮凝作用
固定化细胞的性质
先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产 生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二 次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。
这一现象又称葡萄糖效应， 产生的原因是由于葡萄糖降解 物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 此调节基因的产物是环腺苷酸 受体蛋白（CRP）,亦称降解物 基因活化蛋白（CAP）。
（1）酶产量高 （3）遗传性能稳定，不易退化
（2）易培养（生长速率高、营养要求低）
（4）易分离提纯
（5）安全可靠（不是致病菌）
*产酶微生物的分离和筛选
1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样
品
2)富集培养: 投其所好，取其所抗
3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）。
4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛有两个 醛基，均可与酶 或蛋白质的游离 氨基反应,使酶蛋 白交联。
此法与共价结合法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
交联法
交联反应既能发生在分子间，也可发生
在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保
持溶解状态。
是衡量稳定性的一项重要指标。
六、酶的修饰
1、酶化学修饰的目的 1.限制酶大规模应用的原因：
1)细胞外稳定性差；
2)酶活性不够高； 3)具有抗原性。
2. 改变酶特性有两种主要的方法：
1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来 的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的 基因而达到改造酶的目的。
对剪切力
敏感
色素、药物、香精、 酶等
大多数不敏感
醇、有机酸、氨基酸、 抗生素、核苷酸、 酶
敏感
疫苗、激素、 抗体、酶
主要产物
• 固定化细胞的特点
类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞 生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器） 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞） 形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。 最多使用：颗粒状珠体 使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的 全部活性，只要载体不解体，不污染就可以长期使用。
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，
与其它固定化方法相比：
•优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变
酶的高级结构，酶活回收率高。
•缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。
五、微生物、植物和动物细胞固定化
细胞种类 细胞大小/um 倍增时间/h 营养要求 光照要求 植物细胞 20-300 >12 简单 大多数要光照 微生物细胞 1-10 0.3-6 简单 不要求 动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求
80
60
细胞 浓 度(OD)
40
20
0
0
2
4
6
8
时 间(h)
• 2、发酵条件的控制
固体培养:特别适合于霉菌培养 液体培养:目前酶发酵生产的主要方式 固定化细胞 :需要特殊的固定化细胞反应器 条件控制参数主要有：温度、pH、通气，搅 拌、消泡剂等。 这些条件间的相互关系要配合恰当才能使微 生物对酶的生物合成达到最佳状态
将一定量酶液包在半透性的高分子微 孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百 微米，厚约25nm。 半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜 孔径的小分子底物和产物可以自由进出， 被称为“人工细胞”。
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：
1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入 体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免 遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。
（2）、分解代谢产物的阻遏影响 解决办法：采用利用较慢的碳源，低浓度补 料分批流加。 （3）、表面活性剂 可以提高酶产量： ① 在细胞膜的周围增大了细胞膜的通透性 ② 改善了氧的传递速率而提高酶的产量 要求：无毒。 常用：TW80、聚乙烯醇、EDTA等
分解代谢物阻遏现象：
实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优
吸附法
3）共价结合法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
偶联方法：
偶联成功与否取决于： •载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。 •酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚基，咪唑基。
• 微生物生产酶的发酵工艺十分复杂，设计 技术路线时要考虑菌种性能、酶系特点、 使用要求生产成本来合理选择。 • 对于工业化的大规模生产，对各个环节： 培养基消毒灭菌 种子培养及接种量 发酵罐的形式 工程管 理等步骤都要进行详细的研究，增加酶产 量。
*产酶微生物的分离和选育的基本原理
优良产酶菌种应具备的条件
（1）固定化酶的优缺点 多次使用 可以装塔连续反应 优点： 纯化简单 提高产物质量 应用范围广 缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难
（2）固定化酶的性质及其影响因素
影响固定化酶性质的因素 ① 酶本身的变化：主要是由于活性中心的氨基 酸残基，高级结构和电荷状态发生了变化。 ② 载体的影响 分配效应 空间障碍效应 扩散限制效应 ③ 固定化方法的影响
• 三、酶的工业提取
工业用酶制剂的型式：液体酶制剂和粉剂。 工业上以粉剂为主。 粉剂酶的工业提取简要概括为以下3个步骤
• 第一步: 对于胞外酶，一般可直接利用过滤或离 心方法，将菌体或其它悬浮杂质分离除 去。 对于胞内酶，则应首先收集细胞或菌体， 经细胞破碎使生化物质释放到液相中， 再将细胞碎片分离除去。
与固定化酶相比，固定化细胞的情况 比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
（4）与固定化酶相比，固定化细胞省去了破 碎细胞提取胞内酶的过程，降低了制备成 本。 （5）保持了胞内原有的多酶体系，对于某些 需要多步催化的过程，一步即可完成。 如用固定化短杆菌细胞连续生产丙烯酰胺。
5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为 主。
一、微生物酶的类型
1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境 中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度
很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控
制少。
2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的
酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调
• 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命
活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正
常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细
胞或固定化增殖细胞。
• 最常用的细胞固定化方法----包埋固定法
聚丙烯酰胺，琼 脂等
包埋法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学 键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒 （或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大 优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力， 可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。