第5章 第三节、酶与固定化酶的生产

H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛有两个 醛基，均可与酶 或蛋白质的游离 氨基反应,使酶蛋 白交联。
此法与共价结合法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
交联法
交联反应既能发生在分子间，也可发生
在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保
持溶解状态。
对剪切力
敏感
色素、药物、香精、 酶等
大多数不敏感
醇、有机酸、氨基酸、 抗生素、核苷酸、 酶
敏感
疫苗、激素、 抗体、酶
主要产物
• 固定化细胞的特点
类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞 生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器） 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞） 形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。 最多使用：颗粒状珠体 使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的 全部活性，只要载体不解体，不污染就可以长期使用。
常用的偶联反应有：重氮化法、
叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻
易脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶
的空间构象而影响酶的催化活性。回 收率低。
(2)交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的
固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛 O O
吸附法
3）共价结合法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
偶联方法：
偶联成功与否取决于： •载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。 •酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚基，咪唑基。
• 微生物生产酶的发酵工艺十分复杂，设计 技术路线时要考虑菌种性能、酶系特点、 使用要求生产成本来合理选择。 • 对于工业化的大规模生产，对各个环节： 培养基消毒灭菌 种子培养及接种量 发酵罐的形式 工程管 理等步骤都要进行详细的研究，增加酶产 量。
*产酶微生物的分离和选育的基本原理
优良产酶菌种应具备的条件
固定化后酶性质的变化 ① 固定化对酶活性的影响：酶活性下降， 反应速度下降 原因是：酶结构的变化－－空间位阻
② 固定化对酶稳定性的影响 A 贮存稳定性比游离酶大多数提高 B 操作稳定性提高 C 对热稳定性，大多数升高，有些反而 降低 D 对分解酶的稳定性提高 E 对变性剂的耐受力升高
• 2、酶的固定化方法
（1）固定化酶的优缺点 多次使用 可以装塔连续反应 优点： 纯化简单 提高产物质量 应用范围广 缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难
（2）固定化酶的性质及其影响因素
影响固定化酶性质的因素 ① 酶本身的变化：主要是由于活性中心的氨基 酸残基，高级结构和电荷状态发生了变化。 ② 载体的影响 分配效应 空间障碍效应 扩散限制效应 ③ 固定化方法的影响
（1）酶产量高 （3）遗传性能稳定，不易退化
（2）易培养（生长速率高、营养要求低）
（4）易分离提纯
（5）安全可靠（不是致病菌）
*产酶微生物的分离和筛选
1)样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样
品
2)富集培养: 投其所好，取其所抗
3)分离获得微生物的纯培养（pure culture）。
4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。
80
60
细胞 浓 度(OD)
40
20
0
0
2
4
6
8
时 间(h)
• 2、发酵条件的控制
固体培养:特别适合于霉菌培养 液体培养:目前酶发酵生产的主要方式 固定化细胞 :需要特殊的固定化细胞反应器 条件控制参数主要有：温度、pH、通气，搅 拌、消泡剂等。 这些条件间的相互关系要配合恰当才能使微 生物对酶的生物合成达到最佳状态
• 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为
不溶态。
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交 联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来 不便。
(3) 包埋法（entrapment）
将酶用物理的方法包 埋在各种载体（高聚物） 内。分为： 网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为 主。
一、微生物酶的类型
1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境 中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度
很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控
制少。
2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的
酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调
• 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命
活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正
常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细
胞或固定化增殖细胞。
• 最常用的细胞固定化方法----包埋固定法
聚丙烯酰胺，琼 脂等
包埋法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学 键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒 （或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大 优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力， 可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。
将一定量酶液包在半透性的高分子微 孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百 微米，厚约25nm。 半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜 孔径的小分子底物和产物可以自由进出， 被称为“人工细胞”。
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：
1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入 体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免 遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。
与固定化酶相比，固定化细胞的情况 比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。
（4）与固定化酶相比，固定化细胞省去了破 碎细胞提取胞内酶的过程，降低了制备成 本。 （5）保持了胞内原有的多酶体系，对于某些 需要多步催化的过程，一步即可完成。 如用固定化短杆菌细胞连续生产丙烯酰胺。
（1）温度 发酵过程中的吸热和放热反应 合成菌体的细胞物质和酶 吸热反应 菌体生长时分解培养基营养物质 放热反应 菌体繁殖旺盛时：放热和搅拌的机械热决定了必 须降温； 而在发酵初期，需要保温 发酵罐的热交换装臵：排管、蛇管、夹套等。
（2）pH值的控制 缓冲溶液或者改变培养基组分的比例。 （3）溶解氧： 通风和搅拌。
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。

注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶
失活，

一般采用低温下（0~10℃）操作。
（2）提取原则
• a. 相似相溶。 • b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
（3）提取方法：
A 盐溶液提取（盐析）
常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 B 酸、碱溶液提取
（1）载体结合法
根据吸附剂的特点分: 1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻 璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。 此种方法得到的固定化酶，酶的活力损失少， 但酶与载体的结合力相当弱，酶容易脱落， 实用价值很小。
• 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-纤维素。 此法处理条件温和，酶活力损失少，结合力 较物理吸附法牢固。
先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产 生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二 次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。
这一现象又称葡萄糖效应， 产生的原因是由于葡萄糖降解 物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 此调节基因的产物是环腺苷酸 受体蛋白（CRP）,亦称降解物 基因活化蛋白（CAP）。
• 第二步：采用适当的沉淀手段将酶 沉淀分离 • 第三步：收集沉淀，干燥，研磨成 粉，加入适当的稳定剂、填充剂等 做成粉末制剂。
1、酶的提取(extraction)

酶的提取液中含有微生物菌体杂质、蛋白、
多糖、脂类和无机盐等许多杂质，必须除去这 些杂质来提高酶的纯度。
利用酶的蛋白质的性质。

（1） 提取目标：
*固定化酶（细胞）的评价指标
(一)酶(细胞)的活力
固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然
酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。
(二) 蛋白总量
1.双辛可宁酸法(BCA法)
2.考马斯亮蓝法
(三)半衰期
在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活 力下降为最初活力一半所经历的连续工作时 间，以t1/2表示。
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，
与其它固定化方法相比：
•优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变
酶的高级结构，酶活回收率高。
•缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。
五、微生物、植物和动物细胞固定化
细胞种类 细胞大小/um 倍增时间/h 营养要求 光照要求 植物细胞 20-300 >12 简单 大多数要光照 微生物细胞 1-10 0.3-6 简单 不要求 动物细胞 10-100 >15 复杂 不要求
C
有机溶剂提取：常用乙醇、丙酮等。
四、 固定化酶
1、概述
什么是固定化酶？
水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
• 酶固定化后一般稳定性增加，易从反 应系统中分离，且易于控制，能反复 多次使用。便于运输和贮存，有利于 自动化生产。固定化酶是近十余年发 展起来的酶应用技术，在工业生产、 化学分析和医药等方面有诱人的应用 前景。