第五章--酶的固定化解析讲解
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酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
《酶的固定化》课件
稳定性等
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
稳定性评估可 以帮助选择合 适的固定化方 法，提高酶的
固定化效果
稳定性评估还 可以帮助优化 固定化酶的生 产工艺，降低
生产成本
固定化酶的使用寿命
固定化酶的稳定性：在固定化过程中，酶的活性和稳定性得到提高
固定化酶的寿命：固定化酶的寿命通常比游离酶长，可以延长酶的使用寿命
固定化酶的再生：固定化酶可以通过再生技术恢复活性，延长使用寿命
添加标题
酶的固定化可以减少污染，提高环 保性能
酶的固定化可以简化生产工艺，提 高生产效率
酶的固定化未来 发展展望
新技术的开发与应用
酶固定化技术的发展：从传统的物理吸附到新型的化学键合 新型酶固定化技术的应用：在生物催化、生物制药、环境保护等领域的应用 酶固定化技术的挑战：如何提高酶的活性和稳定性，降低成本 酶固定化技术的未来：开发新型酶固定化材料，提高酶的固定化效率和稳定性，拓展应用领域
酶的固定化应用
环境保护：酶的固定化可以用 于污水处理、废气处理等领域
生物催化：酶的固定化可以 提高反应速率和选择性
食品加工：酶的固定化可以用 于食品加工，如酿酒、制糖等
医药工业：酶的固定化可以用 于药物合成、药物分析等领域
酶的固定化技术
吸附法
原理：利用酶与载体之间的物理或化学作用力，使酶固定在载体上 优点：操作简单，成本低，固定化效果好 缺点：酶活性易受载体影响，固定化后酶活性降低 应用：广泛应用于生物催化、生物制药等领域
提高固定化酶的稳定性与活性
改进固定化技术：提高酶的固 定化效率和稳定性
优化酶分子结构：提高酶的活 性和稳定性
筛选和优化固定化载体：提高 酶的固定化效率和稳定性
研究酶的固定化机制：为提高 酶的稳定性与活性提供理论支 持
第五章固定化酶和细胞
缺点： 1.固定化过程中往往会引起酶的失活 2.固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。
在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素 主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的 性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物 分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载 体的空间位阻作用引起的。
本章 目录
5 固定化酶的应用
中通CO2气体进行反应 实现了辅酶的内部循环 该固定化系统表现出较好的
循环使用的稳定性
酶和辅酶 共固定化
（ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ）
E2 E1
环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒 石酸
江苏 常茂生化
底 物
产 物
常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的
DL-乙酰氨基酸拆分
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。
在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素 主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的 性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物 分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载 体的空间位阻作用引起的。
本章 目录
5 固定化酶的应用
中通CO2气体进行反应 实现了辅酶的内部循环 该固定化系统表现出较好的
循环使用的稳定性
酶和辅酶 共固定化
（ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ）
E2 E1
环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒 石酸
江苏 常茂生化
底 物
产 物
常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的
DL-乙酰氨基酸拆分
第五章-固定化酶..
理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此空间 进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化酶或细 胞。 固定化酶:固定在载体上，并在一定范围内进行催化反 应的酶。
2
一、固定化酶发展简史
3
一、固定化酶发展简史
1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定 化研究，并第一次实现了酶的固定化。
2、空间障碍效应
固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的 空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位 造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易与底物或效应 物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所 造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效 应。
34
三、固定化酶的性质
酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适 pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的 话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。
40
三、固定化酶的性质
4、固定化酶的最适温度的变化
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度 的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提 高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的 结果。
41
三、固定化酶的性质
5、米氏常数Km的变化
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 由于酶高级结构变化及载体影响，引起酶与底物亲和力 变化，从而使Km变化。 这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高， 载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至 消失。
三、固定化酶的性质
（二） 固定化酶性质的改变
1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下 降，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因：
2
一、固定化酶发展简史
3
一、固定化酶发展简史
1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定 化研究，并第一次实现了酶的固定化。
2、空间障碍效应
固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的 空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位 造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易与底物或效应 物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所 造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效 应。
34
三、固定化酶的性质
酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。 一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适 pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的 话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。
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三、固定化酶的性质
4、固定化酶的最适温度的变化
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度 的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提 高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的 结果。
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三、固定化酶的性质
5、米氏常数Km的变化
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 由于酶高级结构变化及载体影响，引起酶与底物亲和力 变化，从而使Km变化。 这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高， 载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至 消失。
三、固定化酶的性质
（二） 固定化酶性质的改变
1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下 降，其专一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因：
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
《酶固定化和修饰》课件
酶固定化技术的优缺点
优点：提高酶的稳定性和活性，延长酶的使用寿命 优点：降低酶的流失和污染，提高反应效率 缺点：固定化过程可能导致酶的活性降低 缺点：固定化酶的回收和再利用难度较大
04
酶修饰技术
酶修饰技术的分类
化学修饰：通过化学反应改变酶的活性、稳定性和选择性
物理修饰：通过物理方法改变酶的结构和性质，如加热、冷冻、辐射等
酶修饰在药物合成中的应用
酶修饰在药物代谢中的应用
添加标题
添加标题
酶修饰在药物筛选中的应用
添加标题
添加标题
酶修饰在药物分析中的应用
酶固定化和修饰在其他领域的应用案例
生物医药领域：用于药物合成、生物检测等 食品工业领域：用于食品加工、食品添加剂等 环保领域：用于污水处理、废气处理等 化学工业领域：用于化学反应、催化剂等 生物能源领域：用于生物燃料生产等 生物技术领域：用于基因工程、生物制药等
和效率问题
机遇：酶固定 化技术在生物 催化领域的应
用前景
机遇：酶修饰 技术在药物研 发和生物医学 领域的应用前
景
07
总结与展望
对酶固定化和修饰技术的总结
酶固定化技术：将酶固定在载体上，提高酶的稳定性和活性 酶修饰技术：通过化学修饰改变酶的结构和性质，提高酶的稳定性和活性 应用领域：生物催化、生物制药、环境保护等领域 发展趋势：酶固定化和修饰技术的发展将更加注重环保、高效和低成本
生物修饰：通过生物技术手段改变酶的活性、稳定性和选择性，如基因工程、蛋白质工程 等
复合修饰：结合多种修饰方法，实现对酶的精确调控和优化
酶修饰技术的原理
酶修饰技术是通过化学或生物方法对酶进行修饰，以提高酶的活性、稳定性和选择性。
酶修饰技术主要包括化学修饰和生物修饰两种方式。
酶工程原理及应用-04 05 酶的工程化改造(分子修饰和固定化)
-OH
20K
100
10
mPEGCOOH5
-COOH
5K
100
10
mPEGCOOH10
-COOH
10K
100
10
mPEGCOOH20
-COOH
20K
100
10
MPEG-NHS5
-N-羟基琥珀酰亚 胺
5K
100 10
5
MPEGNHS10
-N-羟基琥珀酰亚 胺
10K
100 10 5
MPEGNHS20
-N-羟基琥珀酰亚 胺
20K
100 10 5
3500 700
7000 1400
7000 1400
10000 2000
15000 3000
20000 4000
20000 4000 2000
30000 6000 3000
35000 7000 3500
IEF和SDS-PAGE鉴定PEG修饰蛋白
Comassie blue stain Iodine stain
b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合 剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成 螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从 酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。
c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子， 酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经 过金属离子置换后的酶。
1 2 34 5
45
1
2
3
4+
94.0 66.2 43.0
31.0
-
20.1
酶的固定化
3、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。
1) 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法所用载体是某些不溶于水的离子交换剂。
常用的有：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
2) 共价键结合法载体基质通常是水不溶性的，这些载体包括：(1 )天然载体：琼脂、琼脂糖、几丁质、纤维素、胶原蛋白等；(2)有机合成聚合物：聚亚胺酯、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、尼龙等(3 )无机载体：玻璃、氧化铝、硅胶、磁铁矿、氧化镍等。
用于连接载体的酶蛋白氨基酸残基上的反应功能基团有：Asp Glu 侧链的一COOH、C-末端的一COOH ; Tyr 的苯酚基；Cys 的一SH; Lys 的&NH2、N-末端一NH2；Thr、Ser 的一OH ; His 的咪唑基。
在酶的固定化过程中，由于疏水性氨基酸通常被掩藏在酶蛋白分子的内部，所以疏水性氨基酸通常不参与形成共价键。
载体活化方法：(1 )重氮化法(2)叠氮法(3 )溴基化法(4)烷基化法等。
4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子之内、酶与惰性载体间进行相互交联，制成网状结构的固定化酶的方法，称为交联法。
常用的双功能试剂有戊二醛、已二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮联苯等。
其中戊二醛最为常用，酶表面含有不止一个一NH2,戊二醛与酶上的-NH2发生Schiff反应，形成席夫碱，形成一个复杂的酶交联网络。
交联酶法借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。
可视为一种无载体的固定化方法。
如木瓜蛋白酶在0.2%酶蛋白浓度，2.3%戊二醛，pH5.2〜7.2, 0C下交联24h，可制成固定化酶。
共交联法共交联法是指酶分子在双功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶载体之间发生交联，可降低单纯酶分子之间交联反应所引起的活性丧失。
通常选用的惰性蛋白有牛血清蛋白、卵清蛋白、明胶、胶原蛋白、血红蛋白等。
第五章固定化酶及固定化技术 ppt课件
能对底物产生立体影响的 扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。
载体与酶的相互作用：
载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结 构、封闭酶活性部位等。
改变之一：构象改变、立体屏蔽
构象改变： 酶分子构象发生某种扭曲，导致
酶与底物结合能力或催化能力下降
4.包埋法
是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。 网格型； 微囊型。
网格法
——将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。 天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等 合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。
网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。
微囊型
半透膜包埋法（微囊化法）： 将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，
固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题 ：
酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低 酶固定化后多了空间屏障,增加了传质阻力 酶和载体结合不牢固,容易脱落,酶活力损失大 固定化颗粒成型困难
固定化技术的改进
定点固定化技术 抗体偶联、生物素－亲和素亲和、氨基酸置换（Cys）
质量转移效应:
分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给 出了游离酶在合适反应条件下的效率。
稳定性:
操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性
效能:
生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）
包括：
酶本身的变化:
主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生变化;
但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种 类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应 时，酶往往会从载体上脱落。
共价结合法
载体与酶的相互作用：
载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结 构、封闭酶活性部位等。
改变之一：构象改变、立体屏蔽
构象改变： 酶分子构象发生某种扭曲，导致
酶与底物结合能力或催化能力下降
4.包埋法
是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。 网格型； 微囊型。
网格法
——将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。 天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等 合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。
网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。
微囊型
半透膜包埋法（微囊化法）： 将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，
固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题 ：
酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低 酶固定化后多了空间屏障,增加了传质阻力 酶和载体结合不牢固,容易脱落,酶活力损失大 固定化颗粒成型困难
固定化技术的改进
定点固定化技术 抗体偶联、生物素－亲和素亲和、氨基酸置换（Cys）
质量转移效应:
分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给 出了游离酶在合适反应条件下的效率。
稳定性:
操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性
效能:
生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）
包括：
酶本身的变化:
主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生变化;
但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种 类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应 时，酶往往会从载体上脱落。
共价结合法
第五章酶固定化
(3) 制备方法： 制备方法：
a. 静态法 (statia procedure) ： 在没有搅拌、振摇的情况下，将载体直接加入酶溶液， 在没有搅拌、振摇的情况下，将载体直接加入酶溶液， 通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。 通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。 该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。 该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。 b.电沉积法 (electrodeposition procedure) ： 在酶溶液中放置两个电极，在电极邻近加入载体， 在酶溶液中放置两个电极，在电极邻近加入载体，接通 电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定化酶。 电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定化酶。 该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量， 该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量，但要注意酶 在电场中的稳定性。 在电场中的稳定性。
包埋法的类型：主要有胶格包埋、微囊型包埋、 (3) 包埋法的类型：主要有胶格包埋、 微囊型包埋、 脂 质体包埋。 质体包埋。
a. 胶格包埋(gel(latlic)emtrapment)或称凝胶包埋： 胶格包埋(gel(latlic)emtrapment)或称凝胶包埋： (gel(latlic)emtrapment)或称凝胶包埋 ① 常用凝胶： 常用凝胶：
纤维素 琼脂糖胶 常 用 载 体 葡聚糖凝胶 甲壳质氨基 酸共聚物 甲基丙烯醇 共聚物
脂质体包埋的特点： 具有一定的机械性能， 具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体 内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此， 内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此，其在药物应用 方面受到重视。 方面受到重视
3、结合法： 结合法： (1) 基本概念： 基本概念： 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键， 选择适宜的载体 ， 使之通过共价键或离子键 ， 与酶结合 在一起的固定化方法，称为结合法。 在一起的固定化方法，称为结合法。
第五章固定化酶
一、固定化细胞的概念和目的
概念
细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约 束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留 其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力
目的
生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶 的发酵生产。具产酶率高、发酵周期短、可连续 发酵等优点
➢ 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成 固定化细胞
6、相 对 活 力 ＝ 加 入 酶 的 总 活 固 力 定 - 化 上 酶 清 总 液 活 中 力 未 结 合 酶 活 力 1 0 0 ％
第二节结束 优点 固定化酶的优缺点
性固 质定 及化 其酶 评的 价特 指点 标、
缺点
固定化酶的性质变化
酶活力的变化 酶稳定性的变化 最适温度的变化 最适pH的变化 米氏常数(Km)的变化
4、最适pH的变化
➢ 最适pH、酶活力－pH曲线发生偏移
➢ 带负电荷载体(阴离子聚合物)，最适pH偏高， 向碱性偏移
- --
-
--
-
---
--------------------------------
+ H+ +
+++ +
H+
H+
+
+
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OH-
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-OH-
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5、米氏常数(Km)的变化
（2） 考察固定化酶稳定性 （3） 考察固定化酶最适反应条件
第三节提要
固定化酶的制备原则
尽可能地保持自然酶的催化活性 载体与酶结合牢固 空间位阻较小 成本尽可能低
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液发生化学反应； （6）成本要低。
9
固定化酶的优点
长时间使用，
在绝大多数情
况下提高了酶 的稳定性，有
1
利用工艺的连
续化和管道化
优点
极易将固定
化酶与底物、
2
产物分开
酶反应过程可
以严格控制，
有利于工艺自
3
动化和微电脑
化
酶的使用效
率提高，适
4
合于多酶反
应
10
酶固定化时酶 的活力有所损 失.
固定化酶的缺点
7
什么是固定化酶？
固定化酶（Immobilized Enzyme）：通过物理的 或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或 将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流 动，但能使酶充分发挥催化作用
水溶性酶
水不容性的载体
固定化技术
固定化酶 8
固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性； （2）有利于生产自动化、连续化； （3）应有最小的空间位阻； （4）酶与载体必须结合牢固； （5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反应
17
二、固定化后酶性质的变化
1、固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应 速度下降
原因：酶结构的变化
空间位阻
18
二、固定化酶的性质
固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高。
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。
26
三、评价固定化酶的指标：
3、
酶结合效率，又称为酶结合率，是指酶与载体结 合的百分率。
4、
酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定 化的总酶活力的百分率。
27
5、相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的 固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶 活力。
6、固定化酶的操作半衰期：在连续测定条件下， 固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的 连续工作的时间。
结合后不能生成产物。
21
pH对固定化酶的影响：
1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动;载体带正 电荷，pH向酸性方向移动。
22
3、pH的变化
2）产物性质对体系pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH
值比游离酶的pH值高；反之则低
23
4、最适温度变化 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
✓ 绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效
率高、专一性强、作用条件温和等特点。
3
游离酶的缺陷：
大多数游离酶的稳定性比较差 ； 游离酶的使用成本较高； 一些游离酶存在自水解作用； 产物的分离提纯困难。
4
固定化酶的发展史
在20世纪20年代，就出现了酶工程，以自然酶制 剂在工业上大规模应用的特征，原料以动植物为主
增加了固定化的成 本，使工厂开始投 资大
只能用于可溶性的底
物和小分子底物，对
大分子底物不适宜
11
固定化酶的优缺点：
多次使用 可以装塔连续反应 优点： 纯化简单 提高产物质量 应用范围广
缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难
12
第二节 固定化酶的性质及其影响因素 一、影响固定化酶性质的因素 二、固定化后酶性质的变化 三、评价固定化酶的指标
5、底物特异性变化 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
24
6、米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （1） 载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶
降低了酶的亲和力。 （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km‘ < 酶本身的变化，主要是由于活性中
心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。
14
一、影响固定化酶性质的因素
2、载体的影响
（1） 构象效应 （2） 空间屏蔽效应
15
（3） 微扰效应 （4）分配效应：载体
与底物带相同电荷-底 物少；反之则多。
16
（5）扩散限制效应 ✓ 外扩散限制 ✓ 内扩散限制
第五章 酶和细胞的固定化
1
主要内容
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用
2
第一节 概述
什么是酶？
✓ 催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。
是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反 应速度，但不改变反应的平衡点。
1953年，Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚 苯乙烯树脂对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定， 产生了固定化酶技术。
5
1969年，千田一郎等用固定化氨基酰化酶技 术拆分了DL-氨基酸，生产L-氨基酸，随后固定化 天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸等，开创了固定化酶 应用的局面。
1971年，第一次国际酶工程会议在美国召开，会议 主题是固定化酶的研制和应用,确定固定化酶 （Immobilized Enzyme）统一名称
25
三． 评价固定化酶的指标：
1、酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化 一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶 活单位。 1 Kat =1 mol/s = 60 mol/min = 60*106 umol/min = 6*106 IU
2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA （DNA)所具有的酶活力单位
6
1973年，日本首次在工业上固定化大肠杆菌菌体中天门冬 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸 固定化死菌体
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精 固定化细胞
1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功 固定化植物细胞
1982年日本固定化黄色短杆菌原生质体生产谷氨酸 固定化原生质体
（5） 对变性剂的耐受力升高。
19
2 、固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
20
3、pH的变化
pH对酶活性的影响：
（1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或
28
四、固定化酶的活力测定方法介绍
1、间歇测定：在搅拌或震荡反应中，在与溶液 酶相同测定条件下进行，然后间隔一段时间取 样，过滤后按常规方法测定产物生成量或底物 的消耗量。 此法操作简单。
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四、固定化酶的活力测定方法介绍
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固定化酶的优点
长时间使用，
在绝大多数情
况下提高了酶 的稳定性，有
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利用工艺的连
续化和管道化
优点
极易将固定
化酶与底物、
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产物分开
酶反应过程可
以严格控制，
有利于工艺自
3
动化和微电脑
化
酶的使用效
率提高，适
4
合于多酶反
应
10
酶固定化时酶 的活力有所损 失.
固定化酶的缺点
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什么是固定化酶？
固定化酶（Immobilized Enzyme）：通过物理的 或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或 将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流 动，但能使酶充分发挥催化作用
水溶性酶
水不容性的载体
固定化技术
固定化酶 8
固定化酶制备原则
（1）维持酶的催化活性及专一性； （2）有利于生产自动化、连续化； （3）应有最小的空间位阻； （4）酶与载体必须结合牢固； （5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反应
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二、固定化后酶性质的变化
1、固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应 速度下降
原因：酶结构的变化
空间位阻
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二、固定化酶的性质
固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高。
（2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。
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三、评价固定化酶的指标：
3、
酶结合效率，又称为酶结合率，是指酶与载体结 合的百分率。
4、
酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定 化的总酶活力的百分率。
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5、相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的 固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶 活力。
6、固定化酶的操作半衰期：在连续测定条件下， 固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的 连续工作的时间。
结合后不能生成产物。
21
pH对固定化酶的影响：
1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动;载体带正 电荷，pH向酸性方向移动。
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3、pH的变化
2）产物性质对体系pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH
值比游离酶的pH值高；反之则低
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4、最适温度变化 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
✓ 绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效
率高、专一性强、作用条件温和等特点。
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游离酶的缺陷：
大多数游离酶的稳定性比较差 ； 游离酶的使用成本较高； 一些游离酶存在自水解作用； 产物的分离提纯困难。
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固定化酶的发展史
在20世纪20年代，就出现了酶工程，以自然酶制 剂在工业上大规模应用的特征，原料以动植物为主
增加了固定化的成 本，使工厂开始投 资大
只能用于可溶性的底
物和小分子底物，对
大分子底物不适宜
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固定化酶的优缺点：
多次使用 可以装塔连续反应 优点： 纯化简单 提高产物质量 应用范围广
缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难
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第二节 固定化酶的性质及其影响因素 一、影响固定化酶性质的因素 二、固定化后酶性质的变化 三、评价固定化酶的指标
5、底物特异性变化 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。
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6、米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （1） 载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶
降低了酶的亲和力。 （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，Km‘ < 酶本身的变化，主要是由于活性中
心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。
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一、影响固定化酶性质的因素
2、载体的影响
（1） 构象效应 （2） 空间屏蔽效应
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（3） 微扰效应 （4）分配效应：载体
与底物带相同电荷-底 物少；反之则多。
16
（5）扩散限制效应 ✓ 外扩散限制 ✓ 内扩散限制
第五章 酶和细胞的固定化
1
主要内容
第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用
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第一节 概述
什么是酶？
✓ 催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。
是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反 应速度，但不改变反应的平衡点。
1953年，Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚 苯乙烯树脂对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定， 产生了固定化酶技术。
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1969年，千田一郎等用固定化氨基酰化酶技 术拆分了DL-氨基酸，生产L-氨基酸，随后固定化 天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸等，开创了固定化酶 应用的局面。
1971年，第一次国际酶工程会议在美国召开，会议 主题是固定化酶的研制和应用,确定固定化酶 （Immobilized Enzyme）统一名称
25
三． 评价固定化酶的指标：
1、酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化 一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶 活单位。 1 Kat =1 mol/s = 60 mol/min = 60*106 umol/min = 6*106 IU
2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA （DNA)所具有的酶活力单位
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1973年，日本首次在工业上固定化大肠杆菌菌体中天门冬 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸 固定化死菌体
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精 固定化细胞
1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功 固定化植物细胞
1982年日本固定化黄色短杆菌原生质体生产谷氨酸 固定化原生质体
（5） 对变性剂的耐受力升高。
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2 、固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。
20
3、pH的变化
pH对酶活性的影响：
（1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或
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四、固定化酶的活力测定方法介绍
1、间歇测定：在搅拌或震荡反应中，在与溶液 酶相同测定条件下进行，然后间隔一段时间取 样，过滤后按常规方法测定产物生成量或底物 的消耗量。 此法操作简单。
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四、固定化酶的活力测定方法介绍