Ras激酶抑制子KSR定点突变_表达和鉴定
ras蛋白名词解释细胞生物学
ras蛋白名词解释细胞生物学
Ras蛋白是一种小GTP酶（guanosine triphosphatase），在细胞生物学中是一个重要的信号转导蛋白。
它在多种细胞过程中扮演关键角色，包括细胞增殖、分化、存活与凋亡等。
Ras蛋白被称为癌基因的原型，因为它在多种癌症中突变或过表达。
Ras蛋白通过细胞膜上的受体激活，然后通过GTP（鸟苷三磷酸）与GDP（鸟苷二磷酸）之间的结合进行周期性的活化与失活化。
活化的Ras蛋白可以激活多个下游信号级联，其中包括Raf-MEK-ERK（MAPK）信号通路等。
这些信号通路调节了许多细胞功能，如基因转录、蛋白合成与细胞周期控制等。
Ras蛋白异常激活与多种疾病的发生和发展相关，因此它是研究和治疗癌症等疾病的重要靶点之一。
苏云金杆菌cry1aa基因的表达和定点突变
ＡＢＳＴＲＡＣＴＩｎｓｅｃｔｓｗｏｕｌｄｄｅｖｅｌｏｐｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｈｉｃｈｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅＢ口ｃｆ盯淞历“ｒｆ愕ｆＰ珊括ｔｏｘｉｎｓ，ａＩｌｄｄｅｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｐＨｏｆｉｔｓｍｉｄｇｕｔｊｕｉｃｅｔｏｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｕｎｋｎｏｗｎ．ＡｍｏｄｉｆｉｅｄＳＤＳ—ａｌｋａｌｉｎｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｐｌａｓｍｉｄｓｏｆＢｔ４．０７１８ｓｔｒａｉｎ，ａｎｄＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＰ３ｐｌａｓｍｉｄｃｏｎｔａｉｎｃ，），１Ａａｇｅｎｅ．Ｂｙａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｏｎｓｅｎｓｕｓｒｅｇｉｏｎｏｆ１３ｋｉｎｄｓｏｆｃＷｌＡａｇｅｎｅｗｉｔｈｍｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｆｂｎｎａｔｉｏｎ’ｓＢＬＡＳＴＷＷＷｓｅｒｖｅｒ’ｐｒｉｍｅｒｓＨ０１ａｎｄＨ０２ｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏａｍｐｌｉ６ｅｄｆＷｌＡａｇｅｎｅｆｒｏｍＰ３ｐｌａｓｍｉｄ，ｔｈｅｎｔｈｅＰＣＲＤｍｄｕｃｔｓｓｕｂｃｌｏｎｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭＤＡａｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ３．５一ｋｂＢ日历ＨＩａｎｄＳ口ｆＩｉｎｓｅｒｔｏｆｐＭＤｌ８一ＴｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＥＴ３０ａｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｏⅡｎｅｄＥ∞，ｆｓｔｒａｉｎＢＬ２ｌ（ＤＥ３）ｔｏｇｉＶｉｎｇＥＴＡａｓｔｒａｉｎ，ａｎｄａ１４１－ｋＤｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｂｙｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧＳｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｍｅｄｉｎａｔ、Ｖｏ－ｓｔ印ＰＣＲｗｉｔｈｔｈｒｅｅｐｒｉｍｅｒｓ．Ｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｍｅｆｉｒｓｔｓｔｅｐｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｔｈｅ“ｂｉｇｐｒｉｍｅｒ＂ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄＰＣＲｔｏａｒｎｐｌｉｆｉｅｄｔｈｅｌ０４８－ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎｄｓｕｂｃｌｏｎｅｄ．Ａ２２４－ｂｐｍｕｔａｔｅｄｆ｝ａｇｍｅｎｔｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｄｉｇｅＳｔｉｎｇｐＭＤＭＸｗｉｔｈ砌ＰＩａｎｄ丑ｆｓＨＩＩａｎｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｍｅｆｈｇｍｅｎｔｉｎｐＭＤＡａａｔｔｈｅｓａｒｎｅｐｏｓｉｔｉｏｎｔｏｇｅｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＭＤＭａ．ｐＭＤＭａｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＢ日ｍＨＩａｎｄＳｂ，Ｉ，ｔｈｅ３．５－ｋｂｍｕｔａｔｅｄ矗ａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＥＴ３０ａＶｅｃｔｏｒｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｍｕｔａｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎＥＴＭａＣ８１２ＡａｎｄＣ８１４Ａ．ＳＤＳ—ＰＡＧＥｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｕｔａｍｃ，），１ＡａｇｅｎｅｗａｓａｌｓｏｏＶｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ舶ｍＥＴＡａｓｔｒａｊｎａ１１ｄｍｕｔａｔｅｄＥＴＭａｓｔｒａｉｎｄｉｓｓｏｌＶｅｄｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｏｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ２一Ｍ［ｅｒｃａｐｔｏｅｍａｎｏｌｓ锄ｅｐＨｏｒｉｎｄｉＶｉｄｕａｌｌｙ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥｓｈｏｗｅｄｔ１１ａｔ，ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２－Ｍｅｒｃａｍｏｅｔｈａｎｏｌ，ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ疔ｏｍｍｕｔａｔｅｄＥＴＭａｓｔｒａｉｎｗｅｒｅｍｏｒｅｅａｓｙｔｏｄｉｓｓｏｌｖｅ，ａｎｄｃｏｕｌｄｄｉｓｓｏｌｖｅｂｅｔｔｅｒｉｎ１０ｗｐＨｏｒｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２一ＭｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌｔｈａＪｌｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓｆ＿ｒｏｍＥＴＡａｓｔｒａｉｎ．ＩｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｎｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆＣ８ｌ２ＡａｎｄＣ８１４Ａｃｏｕｌｄｓｉｇｎａｌｌｙｃｈａｎｇｅｔｈｅｄｉｓｓｏｌｖａｂｉｌｉｔｙｏｆｊｎｃｌｕｓｊｏｎｂｏｄｉｅｓ．ＴｈｅｓｔｕｄｙｐｒＤＶｉｄｅａＶａｌｕａｂｌｅｏｐｔｉｏｎｆｌｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ａｎｄｏｎｓｕｃｈａｂａｓｅ，出ｅｒｏｌｅｏｆｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅｉｎｔｈｅｐｒｏｔｏｘｉｎｓｔａｂｉＩｉｔｙａ１１ｄｔｏｘｉｃｉｔｙｃａｎｂｅｍｒ出ｅｒａｃｈｉｅｖｅｄＫｌｅｙｗｏｒｄｓ：８口ｃ“，￡岱ｆ是“ｒ豫ｉｌ拿挖ｓ扭，ｃ，ｙｌＡａｇｅｎｅ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｓｉｔｅ—ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ前言１．苏云金芽孢杆菌１．１苏云金芽孢杆菌（Ｂｔ）概论苏云金芽孢杆菌（肋ｃｆ，，“ｓ胁“ｒｆ娼招瑚如，简称Ｂｔ）是一种在自然界广泛分布的革兰氏阳性细菌，按照《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版可将其归属为第二类第十八群芽孢杆菌属（口口ｃ讲珊）中的一种【ｌＪ。
KRAS基因突变的检测及其临床意义
KRAS基因突变的检测及其临床意义RAS基因家族由KRAS、HRAS 和NRAS组成，基因家族各成员间同源性可达85%。
RAS 基因编码p21蛋白，分子量为21KD，位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参于传导细胞增殖信号的调控系统。
其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活性致癌基因的主要部位是第12、13 和61 密码子的突变，其中以第12 密码子点突变最常见。
RAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因，该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15%-30%，在结直肠癌患者中为20%-50%。
作为EGFR信号通路下游最重要的的效应因子，KRAS在肿瘤信号转导中发挥重要作用。
对KRAS基因突变的检测，可以为肿瘤患者的个体化治疗提供更确切的依据。
西妥昔单抗和帕尼单抗都是特异性针对人类EGFR胞外区的单克隆抗体。
美国FDA批准该药单药用于治疗难治性结肠癌，及在放疗基础上治疗进展性头颈部癌。
已知EGFR信号途径下游的基因突变则会使患者对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗产生耐药性。
2009年7月15日，美国FDA批准了对帕尼单抗和西妥昔单抗的说明书的修改，在西妥昔单抗和帕尼单抗说明书的“适应证和用法”部分明确指出，KRAS基因第12或13密码子突变的患者接受治疗无生存获益；不推荐这两种表皮生长因子受体（EGFR）抗体用于KRAS基因突变的转移性结直肠癌（mCRC）患者治疗。
根据这一提示，临床医生可以将KRAS基因突变的患者排除在接受抗EGFR单抗治疗之外，重新安排其接受其他药物替代治疗，避免对不能获益的患者进行不必要的治疗。
此外，研究表明，K-ras基因突变状态与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关，直肠癌患者中K-ras的突变对西妥昔单抗等药物的耐药性有关。
美国国家癌症综合网络(NCCN) 2011年版临床治疗指南指出：K-ras基因突变是EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗效的预测指标，肿瘤患者在接受EGFR靶向药物治疗前必须进行K-ras基因突变检测，以帮助决定患者是否接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物（易瑞沙/特罗凯/埃克替尼等）治疗。
一种人类K-ras基因突变检测试剂盒的质量标准研究
时荧光定量Ｐ Ｒ Ｃ 方法 ，检测７ 种Ｋ－ ｓ 因单一突变 点质控 品的准确性 、异性 、最低检 测量和重复性 。分别检测７ ｒ 基 ａ 例肠癌
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在 指 导Ｋ－ ｓ 因 突变 检 测 方 面 具 有 较 好 的应 用 前 景 。 ｒ 基 ａ
关键词 ：Ｋ ｒｓ － ：突变 ：试剂盒 ；质量标准 ａ
中 图 分类 号 ：Ｑ７ ４ ５ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章编 号 ： １７ ．７ ｘ（０ ２０ ．２ ３０ ６２９ ９ ２ １ ）７０３ ．４
胃癌组织中H_ras及K_ras基因第12密码子点突变的检测及意义
第42卷 第1期2006年3月青岛大学医学院学报ACT A ACADEM IAE M EDICINAE QINGDAO UNIVERS ITAT ISVol.42,No.1M arch 2006[收稿日期]2005 08 01; [修订日期]2005 09 28[作者简介]顾华丽(1973 ),女,硕士,主治医师。
胃癌组织中H ras 及K ras 基因第12密码子点突变的检测及意义顾华丽,董静(青岛大学医学院附属医院急诊内科,山东青岛 266003)[摘要] 目的 探讨人胃癌组织中H ras 、K r as 基因第12密码子点突变情况及意义。
方法 收集43例胃癌及相应癌旁组织标本。
应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性(PCR RF L P)分析法检测H r as 、K ras 基因第12密码子点突变情况。
结果 43例胃癌组织中有1例发生H r as 突变(1/43,2.3%),癌旁组织中未发生突变。
K ras 在胃癌及癌旁组织中均未发生突变。
结论 胃癌组织中H r as 、K ras 基因第12密码子点突变率低,在胃癌的发生中不起主要作用。
[关键词] 胃肿瘤;r as 基因;聚合酶链反应[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1672 4488(2006)01 0056 03DET ECTIO N O F PO INT MUTATION OF CO DON 12O F H ras AND K ras IN G AST RIC CANC ER TISS UES G U H UA L I ,DONG JI NG(Department of Emergen cy,The Affiliated H ospital of Qingdao Un iversity M edical College,Qingdao 266003,Chin a)[AB STRACT ] Obj ective T o investigate the poin t mutation of codon 12of H ras and K ras in tissu es of gastric car cinoma.M ethods Forty three gastric cancer specimens an d paraneoplastic tiss ues w ere obtained.Point mutation in codon 12of H ras an d K ras w ere detected by polym erase chain reaction restriction fragm ent length polym orphism (PCR RFLP). Results One case (1/43, 2.3%)of mutation of H ras 12codon w as detected,no mutation w as foun d in paraneoplas tic.No m utation of K ras w as d etected in b oth cancer and paran eoplastic tissues. Conclusion T he point mutation rate of codon 12of H ras and K ras is low in gastric cancer,w hich su ggestive of little role in the gen esis of th e can cer.[KEY WORDS] stomach neoplasms;gen e,ras ;polym erase chain reaction研究表明,约30%的人类肿瘤有r as 基因突变,并有Ras 蛋白高表达[1],突变的Ras 蛋白可刺激细胞增殖和抑制凋亡从而促使肿瘤发生、发展。
ras突变与胃癌_胃癌患者请查k-ras基因
ras突变与胃癌_胃癌患者请查k-ras基因胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤，在世界范围内因肿瘤死亡的病例中，胃癌占第二位。
目前胃癌治疗仍以根治性手术切除为主。
辅以放疗和化疗。
但是临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物，具有选择性差、毒副作用强、易产生耐药性等缺点，同时胃癌细胞对于化疗、放疗又不甚敏感。
难以取得满意疗效。
因此，寻找治疗胃癌的新方法已成为当务之急。
分子靶向治疗是以肿瘤细胞过度表达的某些标志性分子为靶点，特异性地阻断这些靶点而抑制肿瘤细胞的生长、转移。
与传统化疗药物不同的是，靶向药物对肿瘤细胞具有较高的选择性，对正常细胞影响较小，因而具有疗效高、毒性低的特点。
目前已经上市的有表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙(吉非替尼)、特罗凯(厄洛替尼)、格列卫(伊马替尼)、拉帕替尼等；单抗类药物艾比妥(西妥西单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)等，通过特异性靶向抑制表皮生长因子受体下游信号通路。
也能抑制肿瘤生长；阿瓦斯汀(贝伐单抗)通过拮抗肿瘤新生血管的生长，在胃癌的靶向治疗中具有重要作用，对临床上确证有K-ras基因突变的患者，建议联合应用阿瓦斯汀。
其他还有一些处于临床研究阶段的药物。
如肿瘤生长细胞凋亡促进剂、基质金属蛋白酶抑制剂等多种特异的生物靶向治疗药物，也在胃癌综合治疗中显露出了光明的前景。
这些胃癌靶向治疗药物都有一个共同的作用靶点。
即K-ras基因。
肿瘤细胞的生长、增殖、血管生成等过程，都需要细胞内蛋白进行信号传导，而K-ras基因是传导蛋白的关键“开关”，影响着肿瘤的生长和扩散。
K-ras基因可以是正常状态(称为野生型)或异常状态(突变型)。
突变型K-ras基因不受上游表皮生长因子受体信号的影响，始终处于激活状态。
因而其患者对分子靶向治疗不敏感，甚至治疗无效；野生型K-ras基因受上游表皮生长因子受体信号的影响较大，其患者是分子靶向治疗的适应症。
由此可见，K-ras基因检测不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出对靶向治疗药物有效的胃癌患者，真正实现肿瘤病人的个体化治疗。
某理工大学《细胞生物学》考试试卷(1010)
某理工大学《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（85分，每题5分）1. 网格蛋白有被小泡与溶酶体融合，其包被最后在溶酶体被水解。
（）答案：错误解析：网格蛋白有被小泡在出芽后，网格蛋白包被脱落，并不进入溶酶体。
2. 核糖体中具有肽酰转移酶活性的成分是蛋白质。
（）答案：错误解析：核糖体中rRNA具有肽酰转移酶的活性。
3. 呼吸链酶系和氧化磷酸化作用定位于线粒体基质中。
（）答案：错误解析：细胞呼吸的场所是在线粒体基质中，但是氧化磷酸化是在线粒体的基粒上进行的。
4. 在减数分裂交换期间，两条染色体上编码同样基因的区域必须彼此配对。
（）答案：正确解析：如果染色体的非对应区域也能发生重组，将产生大范围的基因重排，这对于生物而言几乎是灾难性的。
然而，少数罕见的“不等交换”对生物体可能有利，基因组中已发现这些罕见的例子。
5. 单个基因的突变能够引起转决定。
（）答案：错误解析：转决定是一群细胞突变的结果。
6. 大多数真核基因是不连续基因，在RNA中出现的部分称为外显子。
（）答案：错误解析：外显子是指在成熟的RNA上的序列。
在基因中外显子被内含子隔开，转录后经过加工被连接在一起，生成成熟的RNA分子。
7. 胆固醇在动物细胞膜中含量较高，但不存在于植物和原核生物细胞膜中。
（）答案：错误解析：胆固醇存在于动物细胞和极少数的原核细胞中，在哺乳动物的细胞质膜中，尤为丰富。
多数细菌质膜中不含有胆固醇成分，但支原体细胞膜中胆固醇含量较多，约占36，这对保持细胞膜的完整性是必需的，因其细胞膜含甾醇，故比其他原核生物的膜更坚韧。
植物细胞膜一般无胆固醇。
8. 细胞分化是选择性基因表达的结果，所以受精卵中不同的区域表达不同组织的专一性基因。
（）答案：正确解析：受精卵细胞中的细胞质中，物质分布是不均匀的，正是这种不均一分布决定了细胞的早期分化。
K-ras基因突变位点检测试剂盒[发明专利]
![K-ras基因突变位点检测试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/87adf32bd5bbfd0a78567356.png)
专利名称：K-ras基因突变位点检测试剂盒专利类型：发明专利
发明人：王建平
申请号：CN201911293559.7
申请日：20191216
公开号：CN110835644A
公开日：
20200225
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及分子生物技术和基因检测领域，具体而言，涉及一种K‑ras基因突变位点检测试剂盒，该试剂盒包括：a)引物对；b)上游探针、下游探针、发夹探针；以及c)两种纳米金探针。
上述引物和探针能够实现在闭管条件下对K‑ras基因的突变位点进行高灵敏、高分辨、低成本检测，能够有效的避免扩增产物的交叉污染。
其中下游探针既可单独使用，也可互相配合在同一反应体系下进行多重检测，因而本试剂盒能够对最多七种K‑ras基因突变位点同时进行检测，检测效率更高。
申请人：广州市宝创生物技术有限公司
地址：510623 广东省广州市广州高新技术产业开发区科学城揽月路80号科技创新基地C区第2层204-206、207-211单元、D区第6层615-617单元
国籍：CN
代理机构：广州华进联合专利商标代理有限公司
代理人：林青中
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Ras激酶抑制子KSR定点突变_表达和鉴定
・研究生专栏・Ras激酶抑制子KSR定点突变、表达和鉴定肖文 周清华 王燕萍 朱文 陈晓禾 杨雪琴 朱大兴【摘要】 背景与目的 Ras to MA P K通路在生长、发育信号传递中起关键的作用。
Ras激酶抑制基因(KSR)是该通路中的一个重要组分,其功能主要是作为一个支架蛋白协调装配包含有丝分裂原活化蛋白激酶(MA P K)及其上游调控子的多蛋白复合体。
已有的研究表明KSR有许多磷酸化位点,这些位点磷酸化状态的改变与外界信号刺激有着极为密切的关系。
利用定点突变技术可以准确地改变基因特定碱基序列,获得突变蛋白质。
本研究的目的是应用定点突变技术构建突变型KSR,并将其瞬时转染293T细胞所表达蛋白纯化和鉴定,为进一步研究KSR生化作用机制提供理论和实验依据。
方法 以本实验室自己构建的pCMV2Tag2b2KSR质粒为模板,应用本实验室改进的QuikChang tm定点突变方法,引入KSR12个突变位点,构建突变型pCMV2Tag2b2KSR,并将其瞬时转染293T细胞进行蛋白表达,亲和胶纯化并经SDS2PA GE和蛋白质印迹鉴定。
结果 成功构建了2个突变型KSR基因,经DNA序列分析突变碱基,证实位点正确,并经过瞬时转染293T细胞表达出突变体蛋白,纯化蛋白经SDS2PA GE和蛋白质印迹鉴定与实验设计完全一致。
结论 成功构建了2个具有不同突变位点的突变型KSR,为以后进行蛋白功能研究提供实验基础。
【关键词】 定点突变 Ras激酶抑制基因 真核表达 构建 纯化 鉴定【中图分类号】 Q784Construction,expression and purif ication of kinase suppressor of R as,K SR X IA O Wen,Z HOU Qi nghua,W A N G Yan ping,Z HU Wen,C H EN X iaohe,YA N G X ueqin,Z HU Dax ing.Key L aboratory of L ungCancer Molecular B iolog y of S ichuan Province,Cancer Center,West China Hos pital,S ichuan Universit y,Cheng du,S ichuan610041,P.R.ChinaCorres ponding author:Z HOU Qinghua,E2mail:z houqh1016@y 【Abstract】 B ackground and objective Ras to MA P K pathway plays a critical role in the transmission of many growth and developmental signals.A new component of this pathway which is termed kinase suppressorof Ras(KSR)was found in1995.KSR is as a scaffolding protein that coordinates the assembly of a multipro2tein complex containing mitogen2activated protein kinase(MAP K)and its upstream regulators.It has beenproven that KSR has many phosphorylation sites,and phosphorylation state changes response to signaling e2vents.Site2directed mutagenesis can precisely change the base sequence and get mutant proteins.The aim ofthis study is to construct two mutant proteins of KSR by using site2directed mutagenesis,and to express andpurify them,therefore to provide basement for studying the f unctional and biochemical mechanisms of KSR.Methods Site2directed mutagenesis of pCMV2Tag2b2KSR gene was performed by modified QuikChang tm site2directed mutagenesis kit method.Two pairs of mutagenic primers were synthesized in vit ro and two mutationsdesired,the recombinant plasmids were verified by restriction enzyme analysis and DNA sequencing.Thenpositive clones were transfected into293T cell line.The purified mutant proteins were analyzed by Westernblot.R esults Two mutants were successf ully constructed.The results of DNA sequencing confirmed that thebase sequences of the mutant genes were completely concordant with experiment design,which could be usedto be transfected into293T cell line.The purified mutants were identified by Western blot.Conclusion Twomutant KSR genes are successfully constructed.It provides experimental basement for f urther f unctional re2search of KSR.【K ey w ords】 Site2directed mutagenesis Kinase suppressor of Ras Eukaryotic expression Con2 struction Purification Identification本研究受国家自然科学基金重点项目(No.30430300)、国家自然科学基金(No.30070333)和高等学校博士学科点专项基金(No.20040610060)资助作者单位:610041 成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室(肖文、王燕萍、朱文、陈晓禾、杨雪琴);300052 天津医科大学总医院天津市肺癌研究所(周清华、朱大兴)(通讯作者:周清华,E2mail:zhouqh1016@) This work was partly supported by grants f rom Key Project of National Natural Science Foundation of China(to ZHOU Qinghua)(No.30430300),National Natural Science Foundation of China(to ZHOU Qing2 hua)(No.30070333)and the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(to ZHOU Qinghua)(No.20040610060). Ras to MA P K通路在生长、发育信号传递中起关键的作用。
顺序特异性引物法快速检测胰腺癌K-ras基因点突变
顺序特异性引物法快速检测胰腺癌K-ras基因点突变戴存才;刘训良;苗毅;杜竞辉;张兆松;陈淑贞【摘要】目的研究简捷、特异、敏感的检测胰腺癌K ras基因点突变的方法及其在胰腺疾病中定性诊断的价值.方法采用针对K ras基因点突变方式(CGT、GAT、GTT)设计的顺序特异性引物(SSP),先后对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液进行多聚酶链反应(PCR),扩增产物借助常规电泳和染色检测有无K-ras基因突变及突变方式.结果胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液中K-ras基因点突变率分别为74.2%、95.1%、91.4%及94.1%,而所有被检测的慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、胆管癌、十二指肠乳头癌及外伤胰腺的组织标本和胰液标本均无K ras基因突变发生.结论该检测法简便、快速、特异、敏感,具有临床实用性,可以作为鉴别胰腺肿块良恶性和诊断胰腺癌的一种方法.【期刊名称】《中华胰腺病杂志》【年(卷),期】2002(002)001【总页数】3页(P22-24)【关键词】胰腺癌;K-ras基因突变;多聚酶链反应-顺序特异性引物【作者】戴存才;刘训良;苗毅;杜竞辉;张兆松;陈淑贞【作者单位】210029,南京,南京医科大学第一附属医院普外科;210029,南京,南京医科大学第一附属医院普外科;210029,南京,南京医科大学第一附属医院普外科;210029,南京,南京医科大学第一附属医院普外科;210029,南京,南京医科大学第一附属医院普外科;210029,南京,南京医科大学第一附属医院普外科【正文语种】中文【中图分类】R73胰腺癌K-ras基因第12位密码子点突变率达90%以上[1-7]，具有重要的临床诊治意义。
自1992年以来，我们收集标本对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰腺癌患者胰液，采用多聚酶链反应-顺序特异性引物(PCR-SSP)检测K-ras基因第12密码子有无突变及突变方式，现报告如下。
连接酶-ELISA检测K-ras基因突变方法研究
连接酶-ELISA检测K-ras基因突变方法研究肖娜;唐一通;崔海忠;李智山;邹玖明【摘要】目的研究一种简便、灵敏的K-ras基因突变检测方法,使其适合于进行常规突变检测.方法设计对应检测位点寡核苷酸探针,经探针的连接、扩增、标记及ELISA反应,通过ELISA反应检测值确定突变位点基因型.以K-ras基因12位密码子的G12S、G12R、G12C、G12D、G12A、G12V 6个点突变为检测对象,对72例肺癌血浆循环DNA标本进行检测,并与直接测序结果进行比较.结果利用建立方法共检出3例标本分别存在G12S、G12R、G12A突变.而通过直接测序未能从标本中检出K-ras突变,表明直接测序方法灵敏度较低,不适合于对循环DNA等不均一标本进行突变检测.结论建立了一种简便、灵敏的K-ras基因突变检测方法,能够对不均一标本进行常规突变检测.%Objective To research a simple and sensitive K-ras gene mutations detection method in order to be suitable for the routine mutation detection.Methods The corresponding detection locus oligonucleotide probe was designed.By theconnection,amplification,labeling and ELISA reaction in probe,the mutation locus genotype was determined by the ELISA reaction detection value.With the six point mutations of G12S,G12R,G12C,G12D,G12A and G12V in 12 codons of K-ras gene as the detection objects,the plasma circulation DNA sample in 72 cases of lung cancer was detected,then the results were compared with those obtained by the direct sequencing.Results Three samples were identified as the G12S,G12R and G12A mutatins by the established method.But no K-ras mutations were detected in the samples by using the direct sequencing,indicating that the direct sequencing hadlower sensitivity and was not suitable for the mutation detection of heterogeneous samples such as circulating DNA.Conclusion The simple and sensitive K-ras gene mutation detection method is established and can conduct the routine mutation detection for the heterogeneous samples.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2018(047)002【总页数】3页(P217-219)【关键词】基因,ras;突变;循环DNA;DNA连接酶类;酶联免疫吸附测定【作者】肖娜;唐一通;崔海忠;李智山;邹玖明【作者单位】湖北文理学院医学院,襄阳441053;湖北文理学院医学院,襄阳441053;湖北文理学院医学院枣阳临床学院,枣阳441200;湖北文理学院附属医院,襄阳441021;湖北文理学院附属医院,襄阳441021【正文语种】中文【中图分类】R394.3K-ras基因是常见的致癌基因，其突变会造成表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂类和EGFR抗体类药物的耐药，K-ras基因突变检测能够帮助肿瘤患者制定个体化治疗方案，提高临床治疗的针对性和有效性[1-2] 。
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》考试试卷(6225)
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（35分，每题5分）1. 囊泡出芽是主动的自我装配过程。
（）答案：正确解析：非细胞转运体系的体外研究结果表明囊泡出芽是主动的自我装配过程。
2. 多线染色体的每个带上只含有一个基因。
（）答案：错误解析：多线染色体的每条染色质纤维的带区含有3000～300000bp。
3. 有亮氨酸拉链模式的Jun和Fos蛋白是以二聚体或四聚体的形式结合DNA的。
（）答案：错误解析：含有亮氨酸拉链模式的蛋白质与DNA的特异性结合都是以二聚体形式气催化作用的。
4. 微管存在于所有真核生物细胞中。
（）答案：错误解析：人的红细胞中没有微管，另外，原核生物中没有微管。
5. 乙酰胆碱对一个动物的不同细胞有不同的效应，而且它和不同细胞上的不同受体分子相结合。
（）答案：正确解析：比如，乙酰胆碱通过结合第一种G蛋白耦联受体而减弱心肌细胞的搏动；通过结合另相结合一不同的乙酰胆碱受体而刺激骨骼肌细胞的收缩。
这种受体是一种配体门控离子通道。
6. 原核生物和真核生物的核糖体都是在胞质溶胶中装配的。
（）答案：错误解析：真核生物的核糖体是在核仁中装配的。
7. 细胞壁可以看作是高等植物细胞的胞外基质，但它仅仅起支持与保护作用。
（）答案：错误解析：细胞壁不仅起支持保障与保护积极作用，组分而且其中的某些寡糖具有信号分子的作用。
2、名词解释（40分，每题5分）1. 接触抑制（contact inhibition）答案：接触抑制是指细胞培养过程中出现的一种现象。
在培养开始后，分散的细胞悬液在外壁培养瓶中不久就可贴附在瓶壁上，原来呈圆形的细胞一经贴壁便会迅速铺展而变成多种形态，随即细胞开始四分五裂，构成贴壁生长形成致密的单层细胞。
小鼠Ras激酶抑制剂(KSR)基因氨基端和羧基端真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达
小鼠Ras激酶抑制剂(KSR)基因氨基端和羧基端真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达杨雪琴;周清华;朱文;朱大兴;马力;李昌林;王艳萍;陈小禾;马家宝【期刊名称】《中国肺癌杂志》【年(卷),期】2006(9)2【摘要】背景与目的已有的实验证据表明,Ras激酶抑制剂(kinase suppressor of Ras,KSR)的功能主要是作为一个支架蛋白组装MAPK及其上游调控子形成多蛋白的复合体.但KSR是否存在激酶活性,一直是争论的焦点.本研究的目的是构建小鼠KSR基因氨基端(N-KSR)和羧基端(C-KSR)的真核表达载体,并观察其在293T细胞中的表达.方法通过PCR方法扩增N-KSR和C-KSR目的片段,利用基因重组技术构建pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表达载体,并进行酶切和测序鉴定.鉴定正确的克隆瞬时转染293T细胞,通过Western blot方法检测目的蛋白的表达.结果通过酶切和测序鉴定,pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表达载体序列正确,编码框正确.转染后的293T细胞经Western blot检测,能够表达目的蛋白.结论成功构建了pCMV-Tag2b-N-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR真核表达载体并可在293T细胞中表达,为以后的研究奠定了基础.【总页数】4页(P123-126)【作者】杨雪琴;周清华;朱文;朱大兴;马力;李昌林;王艳萍;陈小禾;马家宝【作者单位】610041,成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室、肿瘤中心;610041,成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室、肿瘤中心;610041,成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室、肿瘤中心;610041,成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室、肿瘤中心;610041,成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室、肿瘤中心;610041,成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室、肿瘤中心;610041,成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室、肿瘤中心;610041,成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室、肿瘤中心;610041,成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室、肿瘤中心【正文语种】中文【中图分类】Q784【相关文献】1.小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达 [J], 袁磊;吴国豪;张波2.Raf全长及氨基端、羧基端真核表达载体的构建和表达 [J], 王卓敏;周清华;陈军;万海粟;刘红雨;朱文;肖文;范羽;李永文;孙丽亚3.人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达[J], 卢钧雄;江慧贤;曹莹;庞建新4.人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达[J], 卢钧雄;江慧贤;曹莹;庞建新5.鸡MHCⅠα和β2 m链基因真核表达载体的构建及其在293T 细胞中的表达 [J], 戴银;胡晓苗;赵瑞宏;侯宏艳;沈学怀;潘孝成;周学利;张丹俊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
某工业大学生物工程学院《细胞生物学》考试试卷(1526)
某工业大学生物工程学院《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（45分，每题5分）1. 根据caspase蛋白在细胞程序性死亡中的作用，将它们分为三大类：调节物、衔接物和效应物。
caspase9属于调节物。
（）答案：错误解析：所有的caspase都是效应物。
2. 电子传递链复合物Ⅰ、复合物Ⅱ、复合物Ⅲ、复合物Ⅳ均具有电子传递体和质子移位体的作用。
（）答案：错误解析：复合物Ⅱ是电子移位体而非质子移位体。
复合物Ⅱ催化从琥珀酸来得一对低能电子经FAD和FeS传给泛醌，电子当中在传递过程中所释放的自由能不足以合成ATP，因此，这一步反应没有ATP的形成，电子传递也不伴随质子的跨膜转移。
3. 在所有动力动物细胞中，中心体是主要的微管组织中心。
（）答案：错误解析：在动物细胞中，微管组织中心还包括纤毛、鞭毛的基体。
4. 细胞是生命活动的基本单位，也是生命的唯一表现形式。
（）答案：错误解析：还有病毒等非细胞的生命形式。
5. 含有遗传信息的线粒体和叶绿体，可以在体外培养持续生存。
（）答案：错误解析：从细胞分离出的任何结构，也不能在体外培养持续生存，不能作为生命单位社区活动的基本单位而存在。
6. 参与信号转导的受体都是膜蛋白。
（）答案：错误解析：细胞内受体则是胞浆蛋白。
7. ras是一个癌基因。
（）答案：错误解析：ras是一个原癌基因，如果带有使其始终处于活化的突变，才会变成癌基因。
8. 叶绿体基质中的类囊体是彼此独立的由单位膜封闭形成的扁平小囊。
（）答案：错误解析：叶绿体中相邻基粒类囊体经网管状或扁平状的基质类囊体相连，而使类囊体腔彼此相通，因而一个叶绿体的全部类囊体实际上是一个完整连续的封闭膜囊。
9. 非循环式光合磷酸化能够形成3个分子ATP，正好满足同化1个ATP分子的需要。
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》考试试卷(824)
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（35分，每题5分）1. 所有的受体都是跨膜蛋白质。
（）答案：错误解析：细胞表面的受体多为跨膜脂质，但细胞内的受体如基因调控蛋白等不一定是。
2. 线粒体和叶绿体在进行电子传递时，被传递的电子都要穿膜三次，才能传递给最终的电子受体。
（）答案：错误解析：线粒体和叶绿体进行电子传递时，射频被传递的电子穿膜的次数是不同的。
3. 受体都分布于质膜表面，在信息传递和细胞识别过程中起信号接收器的作用。
（）答案：错误解析：受体分为胞内受体和胞外受体两种类型。
4. 凋亡小体只能被吞噬细胞所吞噬。
（）答案：错误解析：凋亡小体为邻近的神经元所吞噬，但并非完全为吞噬细胞所吞噬。
5. 端粒是任何生物染色体所不可缺少的稳定染色体结构的组成部分。
（）答案：错误解析：大肠杆菌染色体就没有端粒序列。
6. 放线菌酮可特异性地抑制核糖体的蛋白质合成。
（）答案：错误解析：放线菌酮只能特异性抑制80S核糖体的蛋白质合成。
7. 胡克发现的细胞是动物的活细胞。
（）答案：错误解析：胡克发现的细胞是植物的死细胞。
2、名词解释（40分，每题5分）1. electrochemical gradient答案：electrochemical gradient的中文名称是电化学斜率，质子跨过内膜向膜间隙转运的过程中，膜间隙积累了大量的氘，建立了质子浓度梯度。
同时，由于膜间隙质子梯度生物膜的建立，导致线粒体膜正电间隙产生大量的正电荷，使膜顶部的电压也发生显著的显著变化，这两种梯度合称为电化学梯度。
解析：空2. 细胞分泌答案：细胞分泌是指动物细胞而植物细胞将在粗面内质网上合成和又非内质网组成部分逐步的蛋白质和脂通过小泡运输的方式经过高尔基体的进一步加工和分选运送到细胞内相应结构、细胞质膜及体细胞外的过程。
K—RAS基因突变热点的快速检测及临床应用
K—RAS基因突变热点的快速检测及临床应用
蔡军;朱理玮
【期刊名称】《天津医科大学学报》
【年(卷),期】1996(002)001
【摘要】ＰＣＲ－ＲＥＬＰｓ法是一种快速灵敏、简单经济的基因突变检测手术，适于在临床上推广使用。
Ｋ－ＲＡＳ基因１２位密码子是常见的突变热点，我们设计并合成一对在近３’－末端存在人为突变碱芭的引物，对３６例直肠癌手术切除标本，癌旁肉眼观察“正常”的粘膜组织标本及正常肠粘膜进行Ｋ－ＲＡＳ基因扩增，并酶切分析１２位密码子点突变，结果表明１２位密码子突变所激活的Ｋ－ＲＡＳ基因是伴随直肠癌的一种基因异常表现，是直肠癌
【总页数】4页(P22-25)
【作者】蔡军;朱理玮
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R735.370.4
【相关文献】
1.致死性侏儒症p.R248C突变热点的快速检测和三例TD-Ⅰ型高危胎儿的快速产
前诊断 [J], 姜煜;潘敬新;郭东炜;艾阳;李荣;蒋玮莹;方群;郭奕斌
2.顺序特异性引物法快速检测胰腺癌K-ras基因点突变 [J], 戴存才;刘训良;苗毅;
杜竞辉;张兆松;陈淑贞
3.中国人肝豆状核变性基因突变热点区的快速检测 [J], 崔天盆;王琳;宋斌;赵瑞生;
胡丽华;吴健民
4.PCR-SSP快速检测胰腺癌石蜡切片中K-ras基因点突变 [J], 戴存才;刘训良;苗毅
5.喉及下咽鳞状细胞癌的ras基因突变热点的研究 [J], 赵书佑;王春芳;罗兵;孙洁;辛露
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K-RAS蛋白的表达、基因突变在皮肤瘢痕癌组织中的意义
K-RAS蛋白的表达、基因突变在皮肤瘢痕癌组织中的意义胡成久;郭瑞珍【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2013(023)001【摘要】目的探讨K-ras蛋白表达、基因突变在皮肤瘢痕癌组织中的意义.方法以皮肤病理性瘢痕、皮肤瘢痕癌组织为研究对象,以正常皮肤组织为对照.采用免疫组织化学(SP)法检测K-ras蛋白的表达.另外,从瘢痕和瘢痕癌石蜡组织中提取DNA,进行PCR扩增及测序,分析K-RAS基因第12、13位密码子点突变情况.所有数据运用SPSS16.0软件包进行统计学分析.结果①K-ras蛋白在正常皮肤表皮和皮肤病理性瘢痕上皮中呈弱阳性表达,在瘢痕癌组织中呈强阳性表达.瘢痕癌组的表达与正常皮肤组及皮肤瘢痕组比较,差异均有显著性(P＜0.05)；正常皮肤组与瘢痕组比较,差异无显著性(P＞0.05).②从14例皮肤瘢痕和14例瘢痕癌石蜡组织中提取DNA,经PCR反应,均成功扩增出目的片段,测序未发现K-ras基因第12、13位密码子的点突变.结论①皮肤瘢痕癌的发生可能与K-ras蛋白的高表达有关.②瘢痕癌中K-ras基因的突变位点有待进一步探讨.【总页数】4页(P22-25)【作者】胡成久;郭瑞珍【作者单位】遵义医学院珠海校区病理学教研室,广东珠海519041;遵义医学院珠海校区病理学教研室,广东珠海519041【正文语种】中文【中图分类】R363.2;R739.5【相关文献】1.SSTR2、FHIT及K-ras蛋白在结直肠癌组织中的表达意义 [J], 胡楠;吴风雷;郑义同2.甲状腺乳头状癌组织中BRAF基因突变及CyclinD1蛋白表达的临床意义 [J], 卢军峰;解乃昌;马艳红;段友良;徐良3.PKC-a、K-ras蛋白在结直肠癌组织中的表达及意义 [J], 宋芳;万义增;陈素贤4.K-RAS蛋白表达及基因状态在胃癌组织中的临床意义 [J], 宗桂娟; 尹海兵; 李春笋; 陈旭东; 蔡南南; 杨磊; 赵斌; 何松5.结直肠癌中K-RAS基因突变与p53蛋白表达的临床意义及相关性 [J], 吴雪芳;李霜;胡建军;杨迎春;龙艳丽;王剑;易韦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
东南大学农学院2021级《细胞生物学》考试试卷(3174)
东南大学农学院2021级《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（40分，每题5分）1. 细胞内新合成的多肽链如果带有信号序列，它就被运送到细胞外成为分泌蛋白；如果不带有信号肽，就留在细胞内。
（）答案：错误解析：蛋白分选的信号分选序列多种多样，所决定的糖类的最终去向不一，如含N端信号肽的多肽将分泌至细胞外，而含有核定位信号的蛋白将进入细胞核。
2. 基因表达的最终产物是蛋白质。
（）答案：错误解析：基因表达的最终产物是氨基酸多肽。
3. 原核生物和真核生物细胞质膜内都含有胆固醇。
（）答案：错误解析：原核生物细胞膜中一般不含胆固醇等甾醇（支原体例外），而在几种细菌中，含有与称为脯氨酸类似的五环分子称为类何帕烷，可强化细胞膜的坚韧性。
真核生物中，动物细胞质膜内则含有胆固醇，而植物体细胞中不含。
综上所述，胆固醇存在于动物细胞和极少数原核细胞质膜钙中。
4. 体外细胞培养很容易被微生物所污染，因此细胞工程所有的实验都必须在无菌条件下进行，所有的实验器械和试剂都是以相同的方式消毒灭菌。
（）答案：错误解析：细胞工程实验用到的灭菌方式有高压蒸汽灭菌，高温灭菌，以及过滤等方法。
不同的试验器械和试剂所需要的灭菌方式不尽相同，例如：玻璃品类的器皿可以通过高压蒸汽灭菌，金属类则可以通过灼烧的方法进行高温灭菌。
5. 内分泌是细胞对自身分泌的物质产生反应。
（）答案：错误解析：内分泌是由无导管腺体支架产生的一种或几种激素，间接分泌到血液中，通过蠕动运输到靶细胞，促进其生理、生化应答的现象。
6. 基因扩增的结果是某些特定基因的拷贝数增加。
（）答案：正确解析：基因扩增是指细胞中某些基因的拷贝数专一性地大量增加的现象。
7. 亚显微结构即超微结构。
（）答案：正确解析：亚显微结构全称超微结构，是指在普通光学显微镜下观察不能分辨的细胞内各种微细结构。
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》考试试卷(6126)
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（35分，每题5分）1. 在原核细胞中，由DNA转录mRNA和由mRNA翻译蛋白质是同时并几乎在同一部位进行。
（）答案：正确解析：真核与原核细胞的一个显著差是：真核细胞核内转录，细胞质内翻译，具有严格的结构性调整与区域性，而原核的转录与翻译同时、同地进行。
2. 在泛素化途径降解蛋白质过程中，泛素随靶蛋白一同被蛋白酶体降解。
（）答案：错误解析：泛素并不被降解，它可以循环利用。
3. 参与信号转导的受体都是膜蛋白。
（）答案：错误解析：细胞内受体则是胞浆蛋白。
4. 所有真核细胞都含有细胞核。
（）答案：错误解析：但有少数例外，如哺乳动物成熟的红细胞。
5. 通常微管的负端埋在中心体中，而正端只能加长，不能缩短，所以能保证微管的稳定。
（）答案：错误解析：微管的负端埋在中心体中，但正端是可以加长的。
6. 细胞质基质之中的蛋白质都呈溶解状存在。
（）答案：错误解析：在细胞质基质中的多数蛋白质包括水溶性蛋白质，并不是以溶解平衡态存在的，而是或者或间接骨架与细胞质骨架结合或与生物膜结合。
7. 网格蛋白有被小泡中的“被”是指接合素蛋白。
（）答案：错误解析：网格蛋白有被小泡的“被”还包括网格蛋白。
2、名词解释（40分，每题5分）1. 抑癌基因[山东大学2019研]答案：抑癌基因又称抗癌基因或肿瘤抑制基因，存在于正常细胞中抗癌控制细胞生长并具有潜在可作用的基因。
该基因突变会动脉硬化导致细胞癌变。
常见的有p53、Rb和ras等基因。
解析：空2. 分子伴侣（molecular chaperone）答案：分子伴侣（molecular chaperone）是指在细胞中某些可以识别正在合成的多肽或部分折叠的多肽，科学管理并与大分子的某些部位相结合，从而能够帮助这些多肽转运、折叠或装配，但本身并不参与最终产物形成的蛋白质分子，如信号识别颗粒和Hsp70蛋白家族。
肿瘤标志物之K-Ras
肿瘤标志物之K-RasRas基因是在急性转化性逆转录病毒实验中从Harvey、Kirsten两株大鼠肉瘤病毒中克隆出来的转化基因，自1982年Weinberg等人发现人的膀胱癌细胞中有活化的H-Ras基因后，引起了人们对Ras癌基因在人类肿瘤发生发展过程中所起的作用的极大关注。
Ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——H-Ras、K-Ras和N-Ras，分别定位在11、12和1号染色体上。
其中，K-Ras则对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。
最新研究表明，K-Ras蛋白并不是永远位于细胞膜上，它的位置受到蛋白激酶 C (protein kinase C，PKC)的控制。
他们发现PKC使磷酸分子与K-Ras结合即磷酸化，这种磷酸化过程导致K-Ras与细胞膜的结合减弱而改变位置，并移至内质网、高尔基体和粒线体等位置。
2008年注定要成为K-RAS辉煌的一年。
6月，CRYSTAL、OPUS等研究在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上大出风头，K-RAS基因状态与表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂疗效之间的关系逐渐明朗化；紧随其后，各大知名期刊不断公布新的证据；10月，K-RAS基因检测被写入最新版(2008年第3版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。
新指南传递供了两条重要的信息：一是所有转移性结直肠癌患者都应检测K-RAS基因状态；二是只有K-RAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗和帕尼单抗(包括单药或与化疗联合)治疗。
图1 EGFR信号传导通路EGFR被TGFα、EGF等配体激活后启动细胞内信号传导，维持细胞存活，促进细胞增殖、转移，在存在血管内皮生长因子(VEGF)的条件下还可促进新生血管生成新指南称，K-RAS基因检测既可以在原发灶也可以在转移灶样本上进行。
NCCN专家组认为，K-RAS突变是结直肠癌形成过程中的早期事件，并且原发灶和转移灶基因状态之间具有很强的相关性。
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・研究生专栏・Ras激酶抑制子KSR定点突变、表达和鉴定肖文 周清华 王燕萍 朱文 陈晓禾 杨雪琴 朱大兴【摘要】 背景与目的 Ras to MA P K通路在生长、发育信号传递中起关键的作用。
Ras激酶抑制基因(KSR)是该通路中的一个重要组分,其功能主要是作为一个支架蛋白协调装配包含有丝分裂原活化蛋白激酶(MA P K)及其上游调控子的多蛋白复合体。
已有的研究表明KSR有许多磷酸化位点,这些位点磷酸化状态的改变与外界信号刺激有着极为密切的关系。
利用定点突变技术可以准确地改变基因特定碱基序列,获得突变蛋白质。
本研究的目的是应用定点突变技术构建突变型KSR,并将其瞬时转染293T细胞所表达蛋白纯化和鉴定,为进一步研究KSR生化作用机制提供理论和实验依据。
方法 以本实验室自己构建的pCMV2Tag2b2KSR质粒为模板,应用本实验室改进的QuikChang tm定点突变方法,引入KSR12个突变位点,构建突变型pCMV2Tag2b2KSR,并将其瞬时转染293T细胞进行蛋白表达,亲和胶纯化并经SDS2PA GE和蛋白质印迹鉴定。
结果 成功构建了2个突变型KSR基因,经DNA序列分析突变碱基,证实位点正确,并经过瞬时转染293T细胞表达出突变体蛋白,纯化蛋白经SDS2PA GE和蛋白质印迹鉴定与实验设计完全一致。
结论 成功构建了2个具有不同突变位点的突变型KSR,为以后进行蛋白功能研究提供实验基础。
【关键词】 定点突变 Ras激酶抑制基因 真核表达 构建 纯化 鉴定【中图分类号】 Q784Construction,expression and purif ication of kinase suppressor of R as,K SR X IA O Wen,Z HOU Qi nghua,W A N G Yan ping,Z HU Wen,C H EN X iaohe,YA N G X ueqin,Z HU Dax ing.Key L aboratory of L ungCancer Molecular B iolog y of S ichuan Province,Cancer Center,West China Hos pital,S ichuan Universit y,Cheng du,S ichuan610041,P.R.ChinaCorres ponding author:Z HOU Qinghua,E2mail:z houqh1016@y 【Abstract】 B ackground and objective Ras to MA P K pathway plays a critical role in the transmission of many growth and developmental signals.A new component of this pathway which is termed kinase suppressorof Ras(KSR)was found in1995.KSR is as a scaffolding protein that coordinates the assembly of a multipro2tein complex containing mitogen2activated protein kinase(MAP K)and its upstream regulators.It has beenproven that KSR has many phosphorylation sites,and phosphorylation state changes response to signaling e2vents.Site2directed mutagenesis can precisely change the base sequence and get mutant proteins.The aim ofthis study is to construct two mutant proteins of KSR by using site2directed mutagenesis,and to express andpurify them,therefore to provide basement for studying the f unctional and biochemical mechanisms of KSR.Methods Site2directed mutagenesis of pCMV2Tag2b2KSR gene was performed by modified QuikChang tm site2directed mutagenesis kit method.Two pairs of mutagenic primers were synthesized in vit ro and two mutationsdesired,the recombinant plasmids were verified by restriction enzyme analysis and DNA sequencing.Thenpositive clones were transfected into293T cell line.The purified mutant proteins were analyzed by Westernblot.R esults Two mutants were successf ully constructed.The results of DNA sequencing confirmed that thebase sequences of the mutant genes were completely concordant with experiment design,which could be usedto be transfected into293T cell line.The purified mutants were identified by Western blot.Conclusion Twomutant KSR genes are successfully constructed.It provides experimental basement for f urther f unctional re2search of KSR.【K ey w ords】 Site2directed mutagenesis Kinase suppressor of Ras Eukaryotic expression Con2 struction Purification Identification本研究受国家自然科学基金重点项目(No.30430300)、国家自然科学基金(No.30070333)和高等学校博士学科点专项基金(No.20040610060)资助作者单位:610041 成都,四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室(肖文、王燕萍、朱文、陈晓禾、杨雪琴);300052 天津医科大学总医院天津市肺癌研究所(周清华、朱大兴)(通讯作者:周清华,E2mail:zhouqh1016@) This work was partly supported by grants f rom Key Project of National Natural Science Foundation of China(to ZHOU Qinghua)(No.30430300),National Natural Science Foundation of China(to ZHOU Qing2 hua)(No.30070333)and the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China(to ZHOU Qinghua)(No.20040610060). Ras to MA P K通路在生长、发育信号传递中起关键的作用。
其经典传导通路由Ras→Raf→M E K→MA P K组成。
1995年在该通路中发现了一个新组分:一个Ras激酶抑制基因(kinase suppressor of Ras,KSR),其功能主要是作为一个支架蛋白协调装配包含有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen2activated p rotein kinase,MA P K)及其上游调控子的多蛋白复合体。
已有的研究表明KSR有许多磷酸化位点,这些位点磷酸化状态的改变与外界信号刺激有着极为密切的关系。
利用定点突变技术可以准确地改变基因特定碱基序列,获得突变蛋白质。
本研究的目的是应用定点突变技术构建突变型KSR,并将其瞬时表达纯化和鉴定,为进一步研究KSR生化作用机制提供理论和实验依据。
1 材料与方法1.1 主要试剂和仪器 p CMV2Tag2b2KSR质粒(6.9kb)为本实验室构建。
BL21(D E3)溶源菌由本实验室保存。
DNA分子量标准(MarkerⅥ)购自天为时生物技术有限公司。
NotⅠ、Eco RⅠ等限制性内切酶, Ult rahot start高保真DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司。
质粒提取试剂盒购自北京赛百盛生物工程公司。
胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖粉购自美国Sigma公司。
PCR反应在Thermo Hybaid公司生产的PX2型96孔PCR仪上进行。
测序由宝生物工程有限公司(Takara)AB I PRISM TM测序仪完成。
293T 人胚肾癌细胞由本实验室保存,anti2FLA G M2亲合胶(affinity gel)购自美国Sigma公司。
1.2 实验方法1.2.1 质粒抽提 采用北京赛百盛生物工程公司Ult raPure TM质粒DNA小量提取试剂盒抽提、纯化,操作按说明书进行。
1.2.2 突变引物设计和突变反应 均参考文献1。
突变引物由北京赛百盛生物工程公司合成:引物对丝氨酸(serine)297to丙氨酸(alanine)(KSR S297A),5′2 TCA CAC GG A GCA A GG CCC ACG A GT CCC A GC2 3′,5′2GCT GGG ACT CGT GGG CCT TGC TCC GTG TG A23′;KSR2392(KSR S392A),5′2TTC GG A GG A CA G A GG CTG TCC CGT CA G AT A T23′,5′2AT A TCT GAC GGG ACA GCC TCT GTC CTC CG A A23′。