副溶血性弧菌快速检测研究进展

作者单位:第一军医大学热带军队卫生学系微生物学教研室,广东广州510515・综述・副溶血性弧菌快速检测研究进展谭翰清,万成松 中图分类号:Q939.1 文献标识码:A 文章编号:1671-5039(2004)01-0021-03 副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus,Vp)是一种嗜盐性细菌,属弧菌科(Vibrio)弧菌属,主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海产品中。

人多因食用被本菌污染而又未煮熟的海产品而引起中毒,在细菌性食物中毒中,比例高、危害大。

目前,我国常规检测方法大多要经过前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、神奈川现象和血清学反应等过程。

这些实验操作繁琐,需耗时5～6d,检出率低,给海产品生产、出入境检验检疫、食品卫生监督等带来困难,影响经济发展。

我国每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的报道,近年来世界发病率呈上升趋势[1]。

因此,建立Vp快速、准确、特异、灵敏的检测诊断方法是十分必要的。

下面对副溶血性弧菌快速检测方法的研究进展进行综述。

1　KP溶血试验副溶血性弧菌临床分离株绝大部分都能产生耐热直接溶血毒素(therm ostable direct hem olysin,T DH),并能在我萋血平板上产生一种特殊的溶血现象,叫做神奈川现象(kanawaga phenomenen,K P)[2]。

该试验需经过前增菌、选择性增菌、选择性培养后,挑取可疑菌落接种到我萋血平板上,置于37℃孵箱中过夜,如菌苔周围出现透明溶血环,即为K P阳性,据此诊断样本中含有Vp。

该试验是检测副溶血性弧菌最基本的方法,能把绝大部分副溶血性弧菌检测出来,但操作繁琐、所需时间长(约4d),而且存在部分T DH-株,易漏检,给人们健康带来危害。

2　免疫学方法免疫学方法特异性强、灵敏度高、易于观察、应用广泛。

血清学反应是最基本的免疫学反应,主要用于细菌分型。

目前,通过血清学反应,Vp可分为13种O血清型、71种K血清型[3]。

正确的分型为流行病学调查和临床用药提供依据。

但此反应只能大概区分不同地区和来源的菌株,而且由于抗原位点受环境等因素的影响易发生突变,出现新的血清型时[4],以现有的血清检测就会漏检。

目前,应用最广泛的免疫学方法是酶联免疫吸附法(enzyme linked immunos orbent assay,E LIS A)。

该方法从抗体的包被到酶联显色,都已经具备了成熟的技术,易于制备试剂盒,操作简单,特异性好,灵敏度高。

由于Vp临床分离株大多为T DH+株,TRH(ther2 m ostable related hem olysin)阳性株只占10%～15%,少数为T DH和TRH双阳性,环境分离株几乎无T DH+[5,6],所以大多研究者主要选择T DH、TRH为抗原,制备相应的抗体进行检测。

E LIS A抗体的包被与固定是关键,影响检测的灵敏度和特异性。

H onda等[7]设计了一种新的固定方法,用HCl、聚乙烯(polythylence imine,PEI)、甲基乙烯基马来酸酐聚合醚(malwic anhydride methylvinyl ether copolymer,MAMEC)等化学试剂处理尼龙膜,接着固定包被T DH和TRH的单克隆抗体,然后与Vp 培养肉汤中T DH或TRH反应15min,洗涤后,与抗T DH、TRH的兔血清多克隆抗体37℃反应15min,再与碱性磷酸酶标记的抗兔抗体IgG反应,最后底物显色。

结果显示,经过紧密相连的三次抗原抗体反应,特异性100%,灵敏度9515%,并且通过肉眼观察就能区分T DH和TRH株。

同时,该尼龙膜也可以直接用于检测粪便标本,特异性达8819%,灵敏度达92%,并能在1h内完成检测。

此固定方法减少非特异性吸附,增强抗体结合度,从而增强了特异性,提高了灵敏度。

但是,这种方法涉及到抗体包被、固定、抗体的标记、显色等步骤,操作繁琐,技术要求高,而且尼龙膜不能长期保存,不能进行大规模临床检测。

同时,直接检测时,抗原量可能不足,抗原位点也容易改变,导致出现新的血清型,如近年来出现新的O3∶K6血清型[8],最终造成漏检。

3　核酸杂交免疫学方法是在蛋白水平检测Vp,而核酸杂交则是在基因水平进行检测,结果更为特异、准确、可靠。

用于检测Vp的核酸杂交方法主要有斑点杂交、S outhern杂交、夹心法杂交。

311　斑点杂交　1992年,Y amam oto等[9]针对tdh和trh101～125bp的基因设计探针,对Vp进行斑点杂交检测,其中tdh探针基因序列为5′2ccccggttctgaX gagatattgtt2 3′,trh探针基因序列为:5′2tccaggttcggaX gagctactatt2 3′,X为dUTP,用于标记碱性磷酸酶。

他们将Vp临床分离株的克隆基因片段点到尼龙膜,与探针在50℃杂交10min,洗涤,最后底物显色。

结果显示, tdh探针特异性为100%、灵敏度为93%;trh探针特异性为93%、灵敏度为86%。

但是,tdh探针把部分弧菌科的其他细菌也检测出来,造成一定的假阳性,而且膜上核酸片段易脱落,不能长期保存。

312　Southern杂交　1998年,Suthienkul等[6]对137株Vp临床分离株进行S outhern杂交。

tdh探针选自p KY199的EcoRI片段,长359bp,trh探针选自p KY298的EcoRI 片段,长334bp,两探针的dUTP都标记上地高辛。

他们将菌株的DNA片段HindⅢ酶切、电泳、尼龙膜转移后,与tdh、trh探针杂交,然后与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应,最后底物显色。

结果显示, tdh和trh探针特异性好,把tdh+株(共127株)和trh+株(共37株)全部检测出来。

然而,这种方法操作繁琐、时间长,不适合临床实验室的快速检测。

313　夹心法杂交　2003年,Lee等[10]采用夹心杂交法检测海产品中Vp的tl基因。

他们对微孔板进行NH修饰,然后与tl基因捕获探针的磷酸基团共价结合,接着把PCR变性产物、标记生物素的信号探针加到微孔板中进行杂交反应,洗涤后,与酶标链亲和素结合,最后底物显色并在405nm紫外灯下检测。

结果显示,该方法检测信噪比在1411～4312之间,特异性好,灵敏度高,能把每克牡蛎组织里10个Vp检测出来。

该方法易于制成试剂盒,目前,美国市场上已有销售。

由于试剂盒已经把捕获探针固定在微孔板上,检测时只需把PCR产物加到微孔板中杂交就行了,操作简单,重复性好,灵敏度高,特异性好,能进行临床大规模的快速检测,并且易于在普通实验室推广。

4　PCR近年来,随着微生物基因组学的发展,微生物基因检测迎来了新的机遇。

2000年,Makino等[11]已经完成Vp的基因组测序,Vp毒力基因及特异的基因序列得到进一步确定。

根据Vp特异基因序列,设计引物,进行PCR检测,是现阶段检测Vp的最快速准确的方法。

目前应用于检测Vp的PCR方法主要有任意引物PCR(abritrarily primed PCR,Ap2PCR)、针对任意引物PCR、多重PCR(multiplex2PCR)、实时PCR(real2time PCR)。

411　任意引物PCRMatsum oto等[12]采用任意引物PCR对Vp进行检测。

他们针对Vp的tdh和trh基因一段特异的序列,设计两条引物,引物1:5′2ggtgcgggaa23′和引物2: 5′2gtttcgctcc23′,对1977～1998年所收集的227株Vp 进行PCR。

通过电泳分析发现,1996～1998年收集的22株血清型为03∶K6菌株与1996年以前收集的O3∶K6血清型菌株基因序列有所不同,为O3∶K6血清型新出现的变异株,并最初出现在孟加拉国。

这是目前最简单的以基因为基础的细菌亚分型方法。

412　针对任意引物PCR由于临床分离株绝大多数含有tdh基因,因此绝大部分研究者都根据tdh设计引物进行特异扩增。

1993年,Lee等[13]根据tdh基因设计引物,对36株T DH+株、89株T DH-株以及46株其他弧菌和肠道菌进行PCR检测。

结果显示,36株T DH+株全部特异扩增出来,其余菌株都没有扩增;而检测灵敏度高,最低检测量可至40pg DNA,并可直接检测粪便标本,无需分离培养,方便快速。

1999年,K im等[14]选择toxR基因序列设计两对引物,5′2gtcttctgacgcaatcgttg23′和5′2atacgagtggttgctgtcatg2 3′,对14株Vp、14株其他弧菌进行PCR。

结果显示, 14株Vp都得到一条368bp的特异扩增亮带,而其他菌株没有特异扩增。

此外,Venkateswaran等[15]选择gyrB基因设计引物对Vp进行PCR、C ordova等[16]选择pR72H基因设计引物进行PCR,特异性、灵敏度都很好。

413　多重PCR由于不是全部副溶血性弧菌都含tdh或trh基因,所以只针对tdh或trh的单一PCR,有时会漏检。

多重PCR(multiplex2PCR)能全方面高效率地检测Vp。

1994年,Bej等[5]针对tl、tdh、trh设计不同的引物对,在同一PCR反应体系内同时扩增tl、tdh、trh。

结果显示,所有的Vp都扩增出tl基因,tl基因是Vp 特异的;54%的Vp扩增出tdh基因;只有38173%的Vp扩增出trh基因;该法灵敏度高,能把10g牡蛎培养肉汤里10～100个Vp检测出来。

与其他常规生化方法相比,多重PCR更快速、仅8h就能完成检测,结果更为准确、可靠,而且还可改进成定量竞争PCR,对标本中靶序列进行定量。

414　实时PCR常规PCR检测,需要从反应体系中吸取产物做电泳或S outhern杂交等实验进行鉴定,转移过程中易污染,造成假阳性,而且耗费时间。

1996年,T yagi 开创了一种实时PCR(real2time PCR)。

实时PCR是在PCR反应体系中加入标记有报告基团和猝灭基团的线性T aqman探针或茎环型荧光分子信标探针,在基因扩增过程中,与产物杂交,此时,报告基团和猝灭基团距离分开,根据能量共振转移现象,报告基团发出荧光而被检测。

这种方法操作简单,闭管检测,减少污染,灵敏度高,并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测,而且可以进行临床大规模快速检测。

2003年,Blackstone等[17]针对tdh设计荧光分子信标探针,对从牡蛎中富集的13个不同种类的菌株进行实时PCR检测。

结果显示,只有含tdh的Vp才被检测出来,特异性好,灵敏度高,能把每个纯培养体系的1个CFU检测出来。