实验二 阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定
质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒
纯化质粒
通过吸附、洗涤等步骤进一步 纯化质粒DNA。
02 双酶切鉴定
双酶切鉴定的原理
酶切原理
双酶切鉴定基于限制性内切酶对DNA的特异性切割，通过两种不同的限制性内 切酶对质粒进行切割，产生特定的DNA片段。
产物分析
通过电泳分析切割后的DNA片段，判断是否出现预期的酶切产物，从而确定重 组质粒是否正确。
酶切效率计算
通过比较酶切前后的质粒浓度，可以计算出酶切效率。
重组质粒鉴定
通过对比酶切后的质粒片段和预期的重组质粒片段， 可以初步判断重组质粒是否被成功构建。
序列分析
对重组质粒进行序列分析，可以进一步确认重组质粒 的准确性。
实验结果分析注意事项
确保电泳结果的可信度
01
在分析电泳结果时，应排除假阳性或假阴性的可能，确保结果
筛选与鉴定
通过特定的筛选和鉴定方法，如菌落PCR、酶切分析和电泳检测 等，对重组质粒进行筛选和鉴定。
内切酶内切重组质粒的步骤
酶切反应
将重组质粒与适量的内切酶混合，进行酶切 反应。
胶回收
通过凝胶电泳分离酶切产物，并使用胶回收 试剂盒回收目的片段。
连接反应
将两个不同的DNA片段进行连接，形成新的 重组分子。
质粒提取及双酶切鉴定 内切酶内切重组质粒
目录
CONTENTS
• 质粒提取 • 双酶切鉴定 • 内切酶内切重组质粒 • 实验结果分析
01 质粒提取
质粒提取方法
01
02
03
碱裂解法
利用高pH值环境下质粒 DNA与细胞基因组DNA 的变性差异，将二者分离。
煮沸法
通过加热使细胞破裂，释 放质粒DNA，再通过离心 将质粒DNA与其他细胞成 分分离。
重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定【实验原理】分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。
由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。
对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。
【实验步骤】本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。
1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。
3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。
4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。
操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。
5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。
12000rpm离心10min。
6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。
注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。
8. 重复上一步，9. 空管离2min。
将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。
10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。
实验二碱裂解法抽提质粒DNA2
3、加入1/10体积的3 M NaAc，加2倍体积的预冷无水乙醇，混匀。 4、置于-70oC冰箱约10分钟以上或-20oC冰箱30分钟至数小时。（DNA沉淀） 5、离心（12000 rpm，15分钟，4oC），倒掉乙醇，离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇
8、吸取 约500-600 μl 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质，若有杂质，则上清12000 rpm离 心5分钟后吸取上清）至另一 Eppendorf 管中；（记体积(tǐjī)）
9、加入 2/3 体积的酚/氯仿上下颠倒抽提10分钟，室温下静置待分层后12000 rpm 离心 10
分钟；（含有酚和氯仿的管子要盖好放于通风橱中）
精品文档
一、实验(shíyàn)目的
1、掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用；
2、掌握常用分子生物学试剂的配制；
3、掌握无菌操作技术； 4、掌握大肠杆菌的培养、保存及液体培养物OD值测定的方法；
5、掌握移液器、分光光度计、离心机的正确使用方法；
6、学会(xuéhuì)根据实验需要选择合适的大肠杆菌菌株和质粒载体。
详情请参考(cānkǎo)：
/p/1772289354
精品文档
碱裂解法的优缺点
优点：
1、对细菌的裂解、细菌染色体DNA及蛋白质变性充分；
2、提取的质粒DNA产量高、纯度好。
缺点：
1、碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，若暴露在强碱性环境 中时间过长，共价闭合环状质粒DNA发生不可逆的变性，导致酶切困难（电泳 时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是(jiùshì)此变性的质粒）。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
②强碱环境（pH12.0-12.6）时：宿主菌的线性双 链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性，而质 粒DNA共价闭合环状的双链并不完全分离；
③当加入高浓度酸性盐，pH值恢复至中性时：变性 的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物；而质粒DNA又恢 复天然构型，能溶解在上清液中，这样通过离心 可以把染色体DNA、蛋白质-SDS复合物等一起除 去。
实验重组质粒DNA提7 取及双酶切鉴定
一.质粒DNA的制备
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
实验重组质粒DNA提8 取及双酶切鉴定
(1)质粒的定义
质粒是存在于细菌体内、独立于染色体的、可以自主复 制的一类双链环状DNA，在细胞内它们常以共价闭环的 超螺旋(supercoil)形式存在。
3.2 分离纯化质粒DNA 的主要步骤
①培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择） ②细菌的收集与裂解
收集——高速离心的方法 ③质粒DNA的纯化
所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环 状的性质。
实验重组质粒DNA提取及双酶切鉴定
3. SDS-碱裂解法提取质粒DNA
3.1 实验原理：
①在有EDTA及去污剂（SDS）存在的条件下，用碱处理细菌， 可以使细菌的细胞壁破裂，释放出细胞内容物（染色体DNA、 质粒DNA、蛋白质和RNA等）；处理过程中，染色体DNA 断裂成不同长度的双链DNA。
3.具有适当的限制性内切酶识别和切割位点（酶切位点） 4.细胞内稳定性高（持续表达和复制） 5.具有供筛选用的（遗传标记） 6.相对分子量小（一定的容量）
实验二重组DNA的提取及其酶切鉴定
实验二重组质粒的提取和鉴定一．提前一天扩增细菌(教师准备) 1．接种环；酒精棉球；火柴；酒精灯；记号笔；15 mL试管架；废物桶；2．15mL 离心管，内装5mL已加有100μg/mL 氨苄青霉素的LB液（共需40管）*请提前消毒45管内装5mL LB液的试管二．实验当天（一）每组（共40组）：1.饭盒内装： 1.5 mL Epp管×5纸巾×52．装冰的小盆；记号笔；镊子；废物桶；废液杯；3．1000、100、20 μL加样枪及枪头4．50 mL试管架和1.5 mL Ep管架5．一次性手套6．混匀板7．ddH2O×0.1 mL8．10×buffer 3uL（二）两组公用（共20套）：1．250 mL三角烧瓶(内装0.6g琼脂糖) 2．GelRed×6 μL3．1×TAE×500 mL 4．剪刀；电泳槽；梳子；量筒（三）全班公用（讲台上）*2份：1.AXYGEN 质粒小量制备试剂盒2.EcoR I酶3.Cla I 酶4.10×buffer5.λDNA Hind III Markers6.卷纸×4；保鲜膜（四）另外需：1.37℃水浴（内装1.5mL水漂）2.-20℃冰箱3.振荡器4.室温台式离心机5.低温15 mL离心机6.低温1.5 mL离心机7.电泳仪（两组共用）8.紫外检测仪（全班共用，在实验室讲台侧）（五）讲台上托盘中：1.电泳槽；胶布；混匀板；三角烧瓶2.公用试剂（冰浴）3.10 μL加样枪及枪头。
重组质粒鉴定
重组质粒进行鉴定时，可以采用两种方法进行鉴定。
1.通过pcr方法鉴定：以重组质粒为模板，pcr产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR 扩增后电泳鉴定。
2..就是酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了。
至于出现质粒条带很亮，而目的条带暗的现象，其实很正常。
因为一般情况下，质粒的碱基数比你的目的条带的碱基数多的多（一般质粒碱基都有好几千bp，而目的条带通常就几百到一千多bp）。
当我们用EB进行染色时，EB是掺入到到dna链中，碱基数越多则掺入的eb就越多，在紫外光下显示的条带就越亮，也就是说条带亮度与你的片段的长度成正比。
最后，如果两种方法都鉴定正确了，你就可以送到公司进行测序，做最后的鉴定了。
如果你非要看到你的目的条带很明显的话，也可以采取如下方法：
1.电泳时吸取的产物量加大，加入到大孔梳子的胶当中，如可以加产物10微升或更多。
2.凝胶成像拍照时，可以适当把曝光时间提高一点。
3.如果还是不清楚，就把你的酶切产物浓缩一下。
实验二-质粒DNA的提取及酶切
实验二质粒DNA的提取及酶切（8学时，6小时）一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取和酶切质粒的技术与方法。
二、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
环状闭合的质粒DNA在限制性内切酶的作用下成为线状质粒DNA，内切酶能识别DNA分子中某一特定的核苷酸序列。
三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、氨苄青霉素16、离心管(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶10、ECOR I酶四、实验步骤（一）质粒DNA的提取1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液1mL加入1.5mL离心管中，4000r/min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在一个离心管中。
3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的小指管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。
4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。
5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。
GFP实验报告
绿色荧光蛋白的克隆摘要：目的：研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。
方法：分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒，将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化，用抗生素抗性筛选后，通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白 DNA重组The cloning of green fluorescent proteinAbstract：Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid.Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。
实验二 重组质粒的构建
实验二重组质粒的构建一、实验步骤1.提取质粒DNA2.酶切（EcoRI+SpeI）注意事项：①酶量，反应时间及体积： One unit of enzyme is defined asthe quantity needed to cut 1μg of DNA in 50ul in onehour。
反应时间的选择。
一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，可延长反应时间（16h)；反应体系不应太小,常规的酶切一般要维持在10-50ul。
酶的体积不要超过总体积的10%（甘油应在5%以下）。
②酶的使用：酶应永远放冰上，应是最后一个被加入到反应体系中，用完后及时放回冰箱③DNA的制备：待切割的DNA应当已去除酚，氯仿，乙醇，EDTA, 去污剂或过多盐离子等④缓冲液：不同酶需不同离子强度缓冲液，使用前应将缓冲液完全溶解并充分混匀。
⑤混匀：很重要，注意不可振荡⑥反应温度：通常37 ℃⑦终止反应：终止液，热失活，酚/ 氯仿抽提⑧星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列。
3.: 酶切产物纯化4.连接二、实验结果与分析1.酶切结果检测图1 EcoRI和SpeI双酶切GST-T及proB载体结果1%琼脂糖凝胶电泳检测图注：M：DL5000DNAmarker；1号泳道;未酶切proB 质粒DNA；10、11号泳道：EcoRI和SpeI双酶切proB载体结果；16、17泳道：EcoRI和SpeI双酶切GST-T载体结果分析：①由图1可知，1号泳道的未酶切proB质粒DNA未显示有条带，其原因可能是所点的未酶切proB标准品浓度过低，条带亮度过低难以识别。
②10和11泳道中大小约为5000bp的较亮条带是proB载体，但有轻微拖尾现象，条带呈圆弧型，应该是因为点样量较大。
经EcoRI和SpeI双酶切后，环状的质粒DNA被分成两个部分，分别为约5000bp和40bp的片段，其中40bp的小片段因分子量小，迁移速度快而跑出了琼脂糖凝胶，在图中无法看到。
实验二 阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定
实验二阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定实验目的：练习质粒的抽提及双酶切的实验过程，熟悉相关操作。
实验材料及设备pMD-T重组质粒；内切酶Xba I 及Pst I；10×M Buffe r；琼脂糖；电泳仪及电泳所需试剂。
实验步骤A 大肠杆菌的扩繁及质粒DNA碱裂解法抽提挑取筛选平板上的白色菌落，接种到5ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期↓取培养液倒入2 ml eppendorf管中，4℃下12000 rpm离心2分钟，去上清↓沉淀中加入150 μl溶液I（50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)），剧烈振荡使菌体悬浮，室温下放置5分钟↓加入250 μl新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1％SDS, 临用前配制)盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，室温下放置5分钟↓加入180 μl预冷的溶液III（5 mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml, 定容至100ml , 并高压灭菌）盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀↓冰浴10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟↓上清液移入干净eppendorf管中，计算体积↓加入各1/2体积的Tris-饱和酚以及氯仿/异戊醇(24：1)，混匀20℃下12000 rpm离心10分钟，取上清, 计算体积↓加等体积的氯仿/异戊醇（24：1），12000 rpm离心10分钟↓将上清移入干净eppendorf管中，计算体积↓加入2倍体积的无水乙醇↓混匀后置于-20℃冰箱中30分钟↓然后4℃下12000 rpm离心10分钟↓弃上清，将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出，用70％乙醇、无水乙醇各洗沉淀一次↓将管倒置于纸巾上使液体流尽，室温干燥↓将沉淀溶于100 μl TE缓冲液(pH8.0，（含20μg /ml RNaseA )中，储于-20℃冰箱中备用B 双酶切反应1、在PCR管中配制下列酶切体系（1×M Buffer）：重组质粒10 ul（未稀释的原液）ddH2O 6 ul10×M Buffer 2ulXba I 1ul (15 U )Pst I 1ul (15 U )总体积20ul2、反应管置37℃下，酶切反应3～4小时。
质粒提取及双酶切鉴定
(5) 氯仿：异戊醇（24:1）
(6) 无水乙醇、70%乙醇、醋酸钠（pH5.2）
（三）限制性内切酶
1）EcoRI
识别顺序为：5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G ……5’
2）XhoI 识别顺序为：5’…… C|TCGAG ……3’ 3’…… GAGCT|C ……5’
四、实验步骤
一实验目的及原理学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法学习和掌握双酶切鉴定学习和掌握双酶切鉴定二实验原理一质粒提取原理一质粒提取原理质粒plasmid独立于染色体外的能自主复制且稳定遗传的遗传因子是一种环状的双链dna分子
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质粒提取及双酶切鉴定
2011年5月9日
主要内容
4. 加200μl新配制的溶液Ⅱ,立即温和颠倒离心管5次， 使菌体充分裂解, 切勿振荡!将离心管放置于冰上12min。(不要超过2min)。
5. 加150μl用冰预冷的溶液III, 反复温和颠倒5次, 将 管置于冰上3～5min。
6. 4 ℃、12000rpm离心15min,将上清液约400ul转移到另 一离心管中。
(1)溶液Ⅰ:
Tris·HCl(pH8.0)
EDTA(pH8.0)
葡萄糖
(2)溶液Ⅱ(新鲜配制) :
NaOH
0.2mol/L
SDS
1%(W/V)
25mmol/L 10mmol/L 50mmol/L
(3)溶液Ⅲ(100ml):
5mol/L乙酸钾
60ml
冰乙酸
11.5ml(pH4.8)
水
28.5ml
(4) 苯酚
10ХBuffer
2ul
DDW
8ul
重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
重组质粒的酶切鉴定及PCR实验陈倩倩（交流生） 118627140313一，实验目的1，检验重组质粒的插入片段的大小2，学习PCR技术的使用二，实验原理PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。
重组质粒的酶切鉴定及PCR试验
重组质粒的酶切鉴定及PCR实验一、【实验目的】1、酶切鉴定重组质粒插入片段的大小；2、学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
二、【实验原理】1、PCR反应基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR反应原理图2、PCR反应体系与反应条件(1) 标准的PCR反应体系②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L ③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L ④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul） ⑤引物浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L ⑥反应温度和循环次数 变性温度和时间 95℃，30s 退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内） Tm值=4(G+C) +2(A+T)循环次数：一般为25 ～ 30次。
循环数决定PCR扩增的产量。
模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。
但循环数并不是可以无限增加的。
一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
重组质粒双酶切鉴定结果
重组质粒双酶切鉴定结果
质粒双酶切鉴定是一种用于确定质粒DNA序列的技术。
通过
使用限制性内切酶对质粒进行酶切，然后运用电泳分析，可以获得关于质粒DNA序列的信息。
重组质粒双酶切鉴定结果通常包括以下内容：
1. 双酶切酶的酶切模式：双酶切鉴定通常使用两种限制性内切酶来进行酶切。
酶切模式描述了每个酶切酶在质粒上切割的位置，包括切割位点及其与质粒线性DNA的相对位置。
2. 酶切产物的大小：通过电泳将酶切后的质粒DNA进行分离，可以得到一系列的DNA片段。
通过估算这些片段的大小，可
以进一步确定酶切酶的切割位点以及质粒DNA的序列。
3. 酶切图谱：酶切图谱是通过将电泳分离的酶切产物进行可视化的图像，通常以荧光标记或放射性标记的方式进行。
酶切图谱可以帮助鉴定质粒的酶切模式，确认切割位点，以及评估酶切的效果。
通过分析重组质粒双酶切鉴定结果，可以确定质粒的基本结构和序列信息。
这对于研究质粒的功能和用途，以及进行基因工程和生物技术研究都具有重要意义。
质粒dna的提取与鉴定实验报告
质粒dna的提取与鉴定实验报告一、实验目的本实验旨在了解质粒DNA的提取方法、鉴定方法及其应用，并掌握相应的实验操作技能。
二、实验原理质粒DNA是细胞内存在于细胞质中的一种环状双链DNA，通常具有自主复制和自主转录等特性。
提取质粒DNA主要采用碱裂解法，即通过加入碱性物质使细胞膜溶解，从而释放出细胞内的质粒DNA。
鉴定质粒DNA则需要使用凝胶电泳法，即将提取出的质粒DNA样品经过电泳分离，从而观察到不同大小和形态的质粒DNA带。
三、实验材料和设备1. 大肠杆菌菌株；2. 质粒抽提试剂盒；3. 1%琼脂糖凝胶；4. TAE缓冲液；5. DNA分子量标记物；6. UV透射仪；7. 手套、口罩等个人防护用品。
四、实验步骤1. 大肠杆菌培养：将大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，在37℃下静置培养至菌液浑浊；2. 质粒DNA提取：按照试剂盒说明书进行操作，将培养好的大肠杆菌菌株经过离心分离出细胞沉淀，加入裂解缓冲液后进行碱裂解，最后使用洗涤缓冲液洗涤并提取质粒DNA；3. 凝胶电泳：将凝胶放置于电泳槽中，加入TAE缓冲液，将提取好的质粒DNA样品和分子量标记物混合后均匀加入凝胶孔中，进行电泳分离；4. 质粒DNA鉴定：在UV透射仪下观察凝胶板上的DNA带，并根据分子量标记物判断质粒DNA的大小。
五、实验结果通过实验我们成功地提取出了大肠杆菌中的质粒DNA，并通过凝胶电泳观察到了不同大小和形态的质粒DNA带。
根据分子量标记物我们可以初步估计出这些质粒DNA的大小范围。
六、实验总结本次实验掌握了质粒DNA的提取和鉴定方法，并成功地进行了实验操作。
同时也发现了实验中可能存在的问题和改进的空间，例如在质粒DNA提取过程中需要注意细胞沉淀的清洗和干燥等细节问题。
通过本次实验，我们对质粒DNA的应用和相关技术有了更深入的了解。
动物分子生物学实验6重组质粒DNA的提取及插入DNA的酶切鉴定
125
四、实验步骤
接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜
取1.5ml菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）
10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
3 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室 温放置10 min。
4 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内 容物，将离心管放冰上5 min。
5 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数 次使混匀。冰上放置15min。
6 12 000r/min，离心10 min，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积酚：氯仿 (1:1)（去蛋白），反复 混匀，12 000r/min，离心5 min，将上清转至另一离心 管中。转移时小心！（total volume: 400 μL）
－ 原核细胞 － 繁殖力强, 2-30 分细胞分裂、加倍
DNA
基因组107bp, 编码约2000种蛋白质
质粒（plasmid）
－ 染色体外的稳定遗传因子
－ 双链、闭环的DNA分子，大小1-200 kb 不等 － 存在于细菌、放线菌和真菌细胞中
－ 具有自主复制和转录能力，并表达所携带的遗传信息
DNA
*溶液II 0.2mol/L溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O
*饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) *氯仿 *3M乙酸钠溶液(pH5.2) * TE缓冲液:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇与70％乙醇
重组质粒酶切鉴定及PCR实验
重组质粒的酶切鉴定及PCR实验一．实验目的1．检验重组质粒的插入片段的大小2．学习PCR技术的使用二．实验原理（一）重组质粒酶切鉴定将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。
（二）PCRPCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。
本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。
1.聚合酶链式反应原理PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。
置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
2．PCR的反应动力学PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
实验二重组质粒酶切鉴定2016
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实验二 重组DNA的提取 及酶切鉴定
1
实验目的
掌握以下方法和技术：
1. 质粒DNA的小量快速制备
2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切
3. DNA的琼脂糖凝胶电泳
2
实验原理
1. 质粒DNA的小量快速制备
分离质粒DNA有三个步骤：
1. 培养细菌使质粒扩增
2. 收集和裂解细菌（本实验：SDS裂解）
DNA从阴极向阳极迁移
依次加样，并加好Marker 连通电源，80~100V电泳至 溴酚蓝带达到凝胶的1/2处 结果观察和记录
GelRed从阳极向阴极迁移
（加样后不能移动电泳槽！）
凝胶成像仪
3. DNA的1%琼脂糖凝胶电泳
制胶：1% agarose ，防过热暴沸 上样准备 （1份凝胶加样缓冲液加5份 DNA） 未酶切 酶切 Marker 未酶切 酶切
1. 首次使用前，将RNaseA全部加入Buffer S1中，4 ℃贮存
2.首次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入指定体积的无水乙醇
3. 使用前检查Buffer S2是否出现沉淀，若有应在37℃加热溶解并冷却 至室温使用 4. 自行准备无核酸和核酸酶污染的tip头和离心管 5. Buffer S2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中 的NaOH，降低溶菌效率
未酶切 λDNA/Hind ш 质粒 Marker
-23130 -9416 -6557 -4361 -2322 -2027
琼脂糖凝胶电泳凝胶中出现1或2或 3条带都有可能来自1%agarose凝胶电泳
存在复制中间体可能
超螺旋的质粒跑得比线性快还是慢？
3
实验步骤
分子实验学报告-重组质粒的酶切鉴定及PCR实验
分子实验学报告-重组质粒的酶切鉴定及PCR实验第三次分子生物学实验报告重组质粒的酶切鉴定及PCR实验一、实验目的1、通过酶切鉴定重组质粒的插入片段的大小；2、学习并掌握PCR技术的原理和基本操作。
二、实验原理1、重组质粒酶切鉴定将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。
2、PCR原理PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。
本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。
（1）聚合酶链式反应原理CR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。
置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
重组质粒实验报告
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。
学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
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实验二阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定
实验目的：练习质粒的抽提及双酶切的实验过程，熟悉相关操作。
实验材料及设备
pMD-T重组质粒；内切酶Xba I 及Pst I；10×M Buffe r；琼脂糖；电泳仪及电泳所需试剂。
实验步骤
A 大肠杆菌的扩繁及质粒DNA碱裂解法抽提
挑取筛选平板上的白色菌落，
接种到5ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中，
37℃振荡培养约12小时至对数生长后期
↓
取培养液倒入2 ml eppendorf管中，4℃下12000 rpm离心2分钟，去上清
↓
沉淀中加入150 μl溶液I（50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)），
剧烈振荡使菌体悬浮，室温下放置5分钟
↓
加入250 μl新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1％SDS, 临用前配制)
盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，
以混匀内容物(千万不要振荡)，室温下放置5分钟
↓
加入180 μl预冷的溶液III
（5 mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml, 定容至100ml , 并高压灭菌）
盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀
↓
冰浴10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟
↓
上清液移入干净eppendorf管中，计算体积
↓
加入各1/2体积的Tris-饱和酚以及氯仿/异戊醇(24：1)，混匀
20℃下12000 rpm离心10分钟，取上清, 计算体积
↓
加等体积的氯仿/异戊醇（24：1），12000 rpm离心10分钟
↓
将上清移入干净eppendorf管中，计算体积
↓
加入2倍体积的无水乙醇
↓
混匀后置于-20℃冰箱中30分钟
↓
然后4℃下12000 rpm离心10分钟
↓
弃上清，将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出，
用70％乙醇、无水乙醇各洗沉淀一次
↓
将管倒置于纸巾上使液体流尽，室温干燥
↓
将沉淀溶于100 μl TE缓冲液(pH8.0，（含20μg /ml RNaseA )中，储于-20℃冰箱中备用
B 双酶切反应
1、在PCR管中配制下列酶切体系（1×M Buffer）：
重组质粒10 ul（未稀释的原液）
ddH2O 6 ul
10×M Buffer 2ul
Xba I 1ul (15 U )
Pst I 1ul (15 U )
总体积20ul
2、反应管置37℃下，酶切反应3～4小时。
.
3、酶切反应产物的检测：反应管中加入6×溴酚兰载样缓冲液4 µl，混匀后于1.0%琼脂糖凝胶中电泳，同时取8 µl DNA分子量标准DL2000于样品相邻孔中电泳,紫外光观察仪观察或凝胶成像仪照相。
根据分子量标准判断扩增产物大小和大致浓度。
本实验中预计酶切产物为844 bp。
C DNA琼脂糖凝胶电泳观察（同实验一）。