实验二 阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定

实验二阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定

实验目的：练习质粒的抽提及双酶切的实验过程，熟悉相关操作。

实验材料及设备

pMD-T重组质粒；内切酶Xba I 及Pst I；10×M Buffe r；琼脂糖；电泳仪及电泳所需试剂。

实验步骤

A 大肠杆菌的扩繁及质粒DNA碱裂解法抽提

挑取筛选平板上的白色菌落，

接种到5ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中，

37℃振荡培养约12小时至对数生长后期

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取培养液倒入2 ml eppendorf管中，4℃下12000 rpm离心2分钟，去上清

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沉淀中加入150 μl溶液I（50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)），

剧烈振荡使菌体悬浮，室温下放置5分钟

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加入250 μl新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1％SDS, 临用前配制)

盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，

以混匀内容物(千万不要振荡)，室温下放置5分钟

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加入180 μl预冷的溶液III

（5 mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml, 定容至100ml , 并高压灭菌）

盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀

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冰浴10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟

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上清液移入干净eppendorf管中，计算体积

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加入各1/2体积的Tris-饱和酚以及氯仿/异戊醇(24：1)，混匀

20℃下12000 rpm离心10分钟，取上清, 计算体积

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加等体积的氯仿/异戊醇（24：1），12000 rpm离心10分钟

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将上清移入干净eppendorf管中，计算体积

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加入2倍体积的无水乙醇

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混匀后置于-20℃冰箱中30分钟

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然后4℃下12000 rpm离心10分钟

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弃上清，将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出，

用70％乙醇、无水乙醇各洗沉淀一次

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将管倒置于纸巾上使液体流尽，室温干燥

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将沉淀溶于100 μl TE缓冲液(pH8.0，（含20μg /ml RNaseA )中，储于-20℃冰箱中备用

B 双酶切反应

1、在PCR管中配制下列酶切体系（1×M Buffer）：

重组质粒10 ul（未稀释的原液）

ddH2O 6 ul

10×M Buffer 2ul

Xba I 1ul (15 U )

Pst I 1ul (15 U )

总体积20ul

2、反应管置37℃下，酶切反应3～4小时。.

3、酶切反应产物的检测：反应管中加入6×溴酚兰载样缓冲液4 µl，混匀后于1.0%琼脂糖凝胶中电泳，同时取8 µl DNA分子量标准DL2000于样品相邻孔中电泳,紫外光观察仪观察或凝胶成像仪照相。根据分子量标准判断扩增产物大小和大致浓度。本实验中预计酶切产物为844 bp。

C DNA琼脂糖凝胶电泳观察（同实验一）