实验二重组质粒酶切鉴定2016
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实验二 重组DNA的提取 及酶切鉴定
1
实验目的
掌握以下方法和技术：
1. 质粒DNA的小量快速制备
2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切
3. DNA的琼脂糖凝胶电泳
2
实验原理
1. 质粒DNA的小量快速制备
分离质粒DNA有三个步骤：
1. 培养细菌使质粒扩增
2. 收集和裂解细菌（本实验：SDS裂解）
加入TAE 60ml，勿晃
1. 标液面高度以观察水分是否蒸发过多，若
溶解后水分蒸发过多，补水
2. 三角烧瓶上覆打过洞的保鲜膜（防水蒸发） 3. 防爆沸和烫伤（带棉手套） 4. 加6μLGelRed后立即灌胶（戴手套） 微波炉溶胶 注意先做好制胶准备！
在电泳槽内加电泳缓冲液 拔去加样梳，将制好的凝胶连同内架 放入电泳槽内，保证液面高于凝胶面 加入6 ×凝胶加样缓冲液和 DNA（1:5比例混合）
Xba I
pSV-c-myc
BamH I
pSV2载体片段 c-myc 目的基因片段
4.8kb
pSV2载体片段3.5kb
3. 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖-海藻中提 取的线状高聚物
不同类型琼脂糖的特性
琼脂糖类型 凝结温度/℃ 熔化温度/℃
35~38 25~35 90~95 63~65
加热融化成清澈、 透明的溶液
3. 分离和纯化质粒DNA（本实验：碱变性法）
碱变性法抽提质粒DNA
Solution II Solution III 离心后去向 pH12.6 pH4.8
染色体 DNA
氢键断裂， 双螺旋解开
不能复性
沉淀中
氢键部分断 裂，cccDNA 质粒DNA 互补链不完 全分离
复性
上清中
硅基质材料(树脂）与DNA双链相互作用的原理
2 μL
1 μL 1 μL 10 μL 6 μL 20 μL
混匀后短暂离心，37 ℃水浴1小时
准备好制胶器，插好梳子并保证 梳子距底部0.5mm-1.2mm
准备好凝胶，加热熔解
灌胶（事先加GelRed）注意赶气泡
待凝
1%agar ose凝 胶
1%agar ose凝 胶
称量agarose
注意事项：
未酶切 λDNA/Hind ш 质粒 Marker
-23130 -9416 -6557 -4361 -2322 -2027
琼脂糖凝胶电泳凝胶中出现1或2或 3条带都有可能
1%agarose凝胶电泳
存在复制中间体可能
超螺旋的质粒跑得比线性快还是慢？
3
实验步骤
1. 质粒DNA的小量快速制备
（AXYGEN AxyPrep质粒DNA小量制备试剂盒）注意事项：
凝固后成凝胶
标准琼脂糖 低熔点琼脂糖
DNA在凝胶中的迁移率的影响因素
DNA分子的大小 琼脂糖的浓度
DNA的构象
所加电压 嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成及其 离子强度
DNA条带迁移距离（cm) （ 一般采用相对迁移率会更好）
不同含量标准的琼脂糖凝胶的分离范围
琼脂糖凝胶浓度 （%） 0.3 0.5 0.6 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0 DNA分子分离范围 （kb） 5~60 1~30 1~20 0.8~12 0.5~10 0.4~6 0.2~4 0.1~3
感谢您的聆听
将细菌培养物全部倒入15mL离心管，4500rpm，5min 请保持同步！ 弃上清，沥干，注意细菌沉淀别倒掉了！ 离心管配平 加250 μl Buffer S1，吹打混匀（也可Vortex）以充分悬浮细菌，转入1.5ml离心管 加250 μl Buffer S2，上下颠倒，温和混匀4~6次使菌体裂解 避免剧烈摇晃，此步骤不宜超过5min 加350 μl Buffer S3，上下颠倒，温和混匀6~8次，12000g 离心10min 避免剧烈摇晃 吸取上清至已置于 2ml 离心管的制备管中，12000g离心1min，弃滤液 同上，在制备管中加500 μl Buffer W1， 12000g离心1min ，弃滤液 在制备管中加700 μl Buffer W2， 12000g 离心1min ，弃滤液， 重复以Buffer W2洗涤（离心）一次，再空离心1次 Eluent液65 ℃温育可提高洗脱效率 将制备管移入新的1.5ml离心管，在膜中央加60 μl Eluent或去 离子水，室温静置1min， 12000g离心1min，即为质粒DNA。
4
实验结果观察和记录
80~1ห้องสมุดไป่ตู้0V电泳，直到溴酚蓝带泳动到凝胶的1/2至2/3处停止。 紫外灯下观察，拍照记录。
预期结果
实验组 对照组未酶切 未酶切 对照组 实验组 质粒 双酶切 双酶切Marker双酶切 双酶切 质粒
未酶切 对照组 实验组 λDNA/Hind ш 质粒 双酶切 双酶切 Marker
1. 首次使用前，将RNaseA全部加入Buffer S1中，4 ℃贮存
2.首次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入指定体积的无水乙醇
3. 使用前检查Buffer S2是否出现沉淀，若有应在37℃加热溶解并冷却 至室温使用 4. 自行准备无核酸和核酸酶污染的tip头和离心管 5. Buffer S2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中 的NaOH，降低溶菌效率
2. 质粒DNA的限制性内切酶的双酶切
注意： 1. 注意加样顺序 2. 保证每样试剂加入反应体系 3. 加样完成后需混匀，短暂离心 4. 反应结束后，上样电泳前需短 暂离心，再加凝胶加样缓冲液 5. 及时将酶放回-20 ℃冰箱以保 证酶的活力
Buffer 4
BamHⅠ(20U/ μl) XbaⅠ(20 U/ μl) dd H2O 质粒DNA
上样图示
上样和电泳: 每组上样2个（ 未酶解质粒
和双酶切产物） 未酶解质粒10 μL +2 μL凝胶加样缓冲液 双酶切产物20 μL +4 μL凝胶加样缓冲液 Marker 5 μL, 放中间，2组1块胶 各组做好准备，两组统一上样后电泳 电泳槽和电泳仪不可移动 10 μL 20 μL +2 μL +4 μL 5 μL 10 μL 20 μL +2 μL +4 μL
DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液 类型 Ⅰ
成分 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰FF 40%蔗糖 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰FF 15%Ficoll 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰FF 30%甘油 0.25%溴酚蓝 40%蔗糖
贮存温度 4℃
Ⅱ
室温
Ⅲ
4℃
Ⅳ
4℃
质粒DNA的3种构象
DNA从阴极向阳极迁移
依次加样，并加好Marker 连通电源，80~100V电泳至 溴酚蓝带达到凝胶的1/2处 结果观察和记录
GelRed从阳极向阴极迁移
（加样后不能移动电泳槽！）
凝胶成像仪
3. DNA的1%琼脂糖凝胶电泳
制胶：1% agarose ，防过热暴沸 上样准备 （1份凝胶加样缓冲液加5份 DNA） 未酶切 酶切 Marker 未酶切 酶切
DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液 的作用下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅
胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸附，一般的
洗液不能将其洗脱下来，只有水溶性的缓冲 液，如TE或水重新水化后，DNA才能从层 析柱上定量回收。
2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切
c-myc基因片段4.8 kb
BamH I + Xba I双酶切（酶切完 全时） 琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带 3.5kb
-23130 -9416 -6557 -4361 -2322 -2027
1%agarose凝胶电泳
发散性思考： 1. 为何细菌平板上的长出的细菌集合是单克隆 （一个细菌来源）的？请例举可能的解释来支 持或反对这一说法。
2. 为何线性的质粒不易转入细菌内，如何从机理 上解释，从实验中证明？连接时是否会出现多 聚体？
1
实验目的
掌握以下方法和技术：
1. 质粒DNA的小量快速制备
2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切
3. DNA的琼脂糖凝胶电泳
2
实验原理
1. 质粒DNA的小量快速制备
分离质粒DNA有三个步骤：
1. 培养细菌使质粒扩增
2. 收集和裂解细菌（本实验：SDS裂解）
加入TAE 60ml，勿晃
1. 标液面高度以观察水分是否蒸发过多，若
溶解后水分蒸发过多，补水
2. 三角烧瓶上覆打过洞的保鲜膜（防水蒸发） 3. 防爆沸和烫伤（带棉手套） 4. 加6μLGelRed后立即灌胶（戴手套） 微波炉溶胶 注意先做好制胶准备！
在电泳槽内加电泳缓冲液 拔去加样梳，将制好的凝胶连同内架 放入电泳槽内，保证液面高于凝胶面 加入6 ×凝胶加样缓冲液和 DNA（1:5比例混合）
Xba I
pSV-c-myc
BamH I
pSV2载体片段 c-myc 目的基因片段
4.8kb
pSV2载体片段3.5kb
3. 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖-海藻中提 取的线状高聚物
不同类型琼脂糖的特性
琼脂糖类型 凝结温度/℃ 熔化温度/℃
35~38 25~35 90~95 63~65
加热融化成清澈、 透明的溶液
3. 分离和纯化质粒DNA（本实验：碱变性法）
碱变性法抽提质粒DNA
Solution II Solution III 离心后去向 pH12.6 pH4.8
染色体 DNA
氢键断裂， 双螺旋解开
不能复性
沉淀中
氢键部分断 裂，cccDNA 质粒DNA 互补链不完 全分离
复性
上清中
硅基质材料(树脂）与DNA双链相互作用的原理
2 μL
1 μL 1 μL 10 μL 6 μL 20 μL
混匀后短暂离心，37 ℃水浴1小时
准备好制胶器，插好梳子并保证 梳子距底部0.5mm-1.2mm
准备好凝胶，加热熔解
灌胶（事先加GelRed）注意赶气泡
待凝
1%agar ose凝 胶
1%agar ose凝 胶
称量agarose
注意事项：
未酶切 λDNA/Hind ш 质粒 Marker
-23130 -9416 -6557 -4361 -2322 -2027
琼脂糖凝胶电泳凝胶中出现1或2或 3条带都有可能
1%agarose凝胶电泳
存在复制中间体可能
超螺旋的质粒跑得比线性快还是慢？
3
实验步骤
1. 质粒DNA的小量快速制备
（AXYGEN AxyPrep质粒DNA小量制备试剂盒）注意事项：
凝固后成凝胶
标准琼脂糖 低熔点琼脂糖
DNA在凝胶中的迁移率的影响因素
DNA分子的大小 琼脂糖的浓度
DNA的构象
所加电压 嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成及其 离子强度
DNA条带迁移距离（cm) （ 一般采用相对迁移率会更好）
不同含量标准的琼脂糖凝胶的分离范围
琼脂糖凝胶浓度 （%） 0.3 0.5 0.6 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0 DNA分子分离范围 （kb） 5~60 1~30 1~20 0.8~12 0.5~10 0.4~6 0.2~4 0.1~3
感谢您的聆听
将细菌培养物全部倒入15mL离心管，4500rpm，5min 请保持同步！ 弃上清，沥干，注意细菌沉淀别倒掉了！ 离心管配平 加250 μl Buffer S1，吹打混匀（也可Vortex）以充分悬浮细菌，转入1.5ml离心管 加250 μl Buffer S2，上下颠倒，温和混匀4~6次使菌体裂解 避免剧烈摇晃，此步骤不宜超过5min 加350 μl Buffer S3，上下颠倒，温和混匀6~8次，12000g 离心10min 避免剧烈摇晃 吸取上清至已置于 2ml 离心管的制备管中，12000g离心1min，弃滤液 同上，在制备管中加500 μl Buffer W1， 12000g离心1min ，弃滤液 在制备管中加700 μl Buffer W2， 12000g 离心1min ，弃滤液， 重复以Buffer W2洗涤（离心）一次，再空离心1次 Eluent液65 ℃温育可提高洗脱效率 将制备管移入新的1.5ml离心管，在膜中央加60 μl Eluent或去 离子水，室温静置1min， 12000g离心1min，即为质粒DNA。
4
实验结果观察和记录
80~1ห้องสมุดไป่ตู้0V电泳，直到溴酚蓝带泳动到凝胶的1/2至2/3处停止。 紫外灯下观察，拍照记录。
预期结果
实验组 对照组未酶切 未酶切 对照组 实验组 质粒 双酶切 双酶切Marker双酶切 双酶切 质粒
未酶切 对照组 实验组 λDNA/Hind ш 质粒 双酶切 双酶切 Marker
1. 首次使用前，将RNaseA全部加入Buffer S1中，4 ℃贮存
2.首次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入指定体积的无水乙醇
3. 使用前检查Buffer S2是否出现沉淀，若有应在37℃加热溶解并冷却 至室温使用 4. 自行准备无核酸和核酸酶污染的tip头和离心管 5. Buffer S2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中 的NaOH，降低溶菌效率
2. 质粒DNA的限制性内切酶的双酶切
注意： 1. 注意加样顺序 2. 保证每样试剂加入反应体系 3. 加样完成后需混匀，短暂离心 4. 反应结束后，上样电泳前需短 暂离心，再加凝胶加样缓冲液 5. 及时将酶放回-20 ℃冰箱以保 证酶的活力
Buffer 4
BamHⅠ(20U/ μl) XbaⅠ(20 U/ μl) dd H2O 质粒DNA
上样图示
上样和电泳: 每组上样2个（ 未酶解质粒
和双酶切产物） 未酶解质粒10 μL +2 μL凝胶加样缓冲液 双酶切产物20 μL +4 μL凝胶加样缓冲液 Marker 5 μL, 放中间，2组1块胶 各组做好准备，两组统一上样后电泳 电泳槽和电泳仪不可移动 10 μL 20 μL +2 μL +4 μL 5 μL 10 μL 20 μL +2 μL +4 μL
DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液 类型 Ⅰ
成分 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰FF 40%蔗糖 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰FF 15%Ficoll 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰FF 30%甘油 0.25%溴酚蓝 40%蔗糖
贮存温度 4℃
Ⅱ
室温
Ⅲ
4℃
Ⅳ
4℃
质粒DNA的3种构象
DNA从阴极向阳极迁移
依次加样，并加好Marker 连通电源，80~100V电泳至 溴酚蓝带达到凝胶的1/2处 结果观察和记录
GelRed从阳极向阴极迁移
（加样后不能移动电泳槽！）
凝胶成像仪
3. DNA的1%琼脂糖凝胶电泳
制胶：1% agarose ，防过热暴沸 上样准备 （1份凝胶加样缓冲液加5份 DNA） 未酶切 酶切 Marker 未酶切 酶切
DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液 的作用下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅
胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸附，一般的
洗液不能将其洗脱下来，只有水溶性的缓冲 液，如TE或水重新水化后，DNA才能从层 析柱上定量回收。
2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切
c-myc基因片段4.8 kb
BamH I + Xba I双酶切（酶切完 全时） 琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带 3.5kb
-23130 -9416 -6557 -4361 -2322 -2027
1%agarose凝胶电泳
发散性思考： 1. 为何细菌平板上的长出的细菌集合是单克隆 （一个细菌来源）的？请例举可能的解释来支 持或反对这一说法。
2. 为何线性的质粒不易转入细菌内，如何从机理 上解释，从实验中证明？连接时是否会出现多 聚体？