质粒DNA 酶切鉴定
质粒DNA的酶切鉴定原理
质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。
酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。
限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。
首先，选择适当的限制性内切酶。
限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。
在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。
选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。
其次，进行质粒酶切。
通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。
反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。
酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。
然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。
它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。
较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。
通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。
最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。
琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。
常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。
经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。
总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。
这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。
酶切鉴定-BamHI and EcoRI
注意事项
1. 直接在抽提的质粒 直接在抽提的质粒DNA管中加入酶切体系。 管中加入酶切体系。 管中加入酶切体系 2. 为使微量操作更精确，可以4个人（8 tubes）一起做 为使微量操作更精确，可以 个人 个人（ ）一起做9 体系混合液，然后再分装10ul于各质粒管中。 于各质粒管中。 份酶切 体系混合液，然后再分装 于各质粒管中 3. 上样时要小心操作，防止样品溢出。 上样时要小心操作，防止样品溢出。 4. 接触凝胶时，因其中含有EB或荧光染料，要戴手套， 接触凝胶时，因其中含有 或荧光染料 要戴手套， 或荧光染料， 废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！ 废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！ 5. EB是极强致癌物！小心！ 是极强致癌物！小心！ 是极强致癌物
限制性内切 酶切割DNA 酶切割
A: Strategy of construction
f1 ori Ampr pGEX Vector (4900 bp)
BamH I EcoR I
B: The product of PCR
1 2 3
4900 bp
X-gene cDNA
Primer1
740 bp
Primer2
体积（ ） 体积（µl） 10 2 1 1 1 5 20
酶切一小时后，每管加入 酶切一小时后，每管加入5 ul的6xloading 的 buffer，中止反应，混匀。 ，中止反应，混匀。 20~25 ul上样，在一个泳道中加入 ul DNA 上样， 上样 在一个泳道中加入10 Marker。 。
核酸电泳 根据核酸的解离性质， 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动， 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是 电泳。 电泳。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 常用的凝胶电泳有琼脂糖 琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯 凝胶电泳和 常用的凝胶电泳有琼脂糖 凝胶电泳 酰胺(poly-acrylamide)凝胶电泳。可以在水平或垂直 凝胶电泳。 酰胺 凝胶电泳 的电泳槽中进行。 的电泳槽中进行。凝胶电泳兼分子筛和电泳双重效 果，所以分离效率很高。 所以分离效率很高。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定
质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定组员：孙慜、孙苏、谢拓燕、郑倩倩、王佳玲【实验目的】1、了解DNA的限制性内切酶酶切的基本原理2、学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术【实验原理】①DNA的限制性内切酶酶切原理（1）限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA，但不能切单链DNA。
它可分为三类:I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
III类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5‘- G↓AATTC-3‘), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3‘); 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5‘…G↓AATTC…3‘→5‘… G AATTC…3‘3‘…CTTAA↑G …5‘→3‘… CTTAA G…5‘DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。
在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。
②琼脂糖凝胶电泳条带的观察：（2）通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验目的：通过酶切实验分析质粒DNA的结构和性质。
实验原理：酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列的方法。
限制性内切酶是一种从细菌体内提取的一类酶，具有切割DNA的特异性。
实验步骤：1.实验准备：准备好所需试剂，包括限制性内切酶、缓冲液、质粒DNA等。
2.酶切反应：在一个离心管中，依次加入适量的缓冲液、质粒DNA、限制性内切酶及适量的蒸馏水，混匀后转入恒温水浴中进行酶切反应。
3.电泳分离：将酶切后的DNA溶液取出一定量，加入适量的电泳样品缓冲液，用于电泳分离。
4.染色观察：将分离出的DNA胶片浸泡于DNA染色剂中，染色后进行观察。
实验结果：通过电泳分离和染色观察，我们可以看到质粒DNA在电场作用下被分离成多个带状。
每个带状代表着一段特定长度的DNA序列，不同的长度代表着不同的DNA片段。
实验分析：1.酶切结果：酶切后的DNA片段的长度可以根据电泳结果得出。
通过比对DNA 片段与已知DNA序列的长度，我们可以推断得到质粒DNA的特异性序列。
如果我们使用了多种限制性内切酶，那么在电泳结果中会出现更多的带状。
2.质粒结构：通过酶切实验可以初步了解质粒DNA的基本结构。
如果酶切结果显示出多个相同长度的DNA片段，说明质粒DNA具有对称的环状结构。
如果酶切结果显示出不同长度的DNA片段，那么质粒DNA可能是线性的。
3.酶切效率：酶切效率是指限制性内切酶切割质粒DNA的效率。
酶切效率越高，产生的DNA片段长度越精确。
如果酶切反应时间过长或者酶切温度不合适，都可能导致酶切效率下降。
实验结论：通过质粒DNA酶切实验，我们可以初步了解质粒DNA的结构和性质。
这对于进一步研究质粒DNA的功能和应用具有重要意义。
质粒酶切反应实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握质粒DNA的提取方法。
2. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和操作方法。
3. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定质粒DNA的酶切位点。
二、实验原理质粒DNA是细菌染色体外的DNA分子，常用于基因克隆和分子生物学研究。
限制性核酸内切酶（RE）是一种可以识别并切割特定DNA序列的酶，常用于分子生物学实验中。
本实验通过提取质粒DNA，利用限制性核酸内切酶进行酶切反应，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，以鉴定质粒DNA的酶切位点。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌菌株（含有目的质粒）、限制性核酸内切酶、琼脂糖、DNA 分子量标准、TAE电泳缓冲液、琼脂糖凝胶电泳仪、PCR仪等。
2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、NaCl、蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、异丙醇、70%乙醇等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取（1）取适量大肠杆菌菌株，加入适量无菌水，用玻璃棒轻轻搅拌，制成菌悬液。
（2）向菌悬液中加入适量的Tris-HCl缓冲液、EDTA和蛋白酶K，充分混匀。
（3）将菌悬液放入65℃水浴中，孵育30分钟。
（4）向菌悬液中加入适量的SDS和酚/氯仿，充分混匀。
（5）12,000 r/min离心10分钟，取上清液。
（6）向上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置2小时。
（7）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（8）向沉淀中加入70%乙醇，混匀，室温静置5分钟。
（9）12,000 r/min离心10分钟，弃去上清液。
（10）将沉淀溶于适量的无菌水中，即为质粒DNA。
2. 酶切反应（1）取适量的质粒DNA，加入适量的限制性核酸内切酶，混匀。
（2）将混合液置于37℃水浴中，孵育适当时间。
（3）酶切反应结束后，加入适量的EDTA，终止反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳分析（1）配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA分子量标准。
（2）将酶切反应产物加入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳。
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定
质粒DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳分析鉴定一目的学习质粒的酶切及电泳分析。
二原理限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。
因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。
用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。
电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。
因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
三试剂与主要仪器（一）试剂1．Eco RⅠ酶2．λ DNA3．TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍4．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油5．溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。
6．琼脂糖（二）仪器1．电泳仪系统2．紫外灯3．恒温水浴箱四操作步骤（一）质粒DNA酶切1．按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。
管号①②③质粒DNA 10 10 10Eco RⅠ/ μl 1 1酶切Buffer（10×）/ μl 2 2 2ddH2O/ μl8 7 6RNA酶 1 2．加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。
然后每个管中加入4 μl Loading buffer。
（二）琼脂糖凝胶电泳1 琼脂糖凝胶的制备称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。
冷却至65℃时加入2μl EB，混匀。
实验3质粒DNA的酶切鉴定
实验三质粒DNA的酶切鉴定南京大学生命科学院一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、学习酶解的操作方法，初步理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具3、进一步熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的方法二、实验原理限制性核酸内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是能够识别双链DNA分子特异性核酸序列，并能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。
限制性核酸内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。
限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。
寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。
这类酶如EcoB、EcoK等。
第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。
由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。
因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。
高中生物质粒DNA的酶切鉴定(28页)公开课ppt课件
实验目的
1、学习限制性内切酶的特性 2、掌握酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法
高中教材分析
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA 分子特
异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的
重要工具，常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶
等一起称为工具酶。 限制性核酸内切酶还可以用于基因组酶切图谱的鉴 定。
2)限制性核酸内切酶的类型及特性
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺 序，并在识别点附近 1000 bp 的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专 一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技 术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结外观察 分析仪 上观察酶切的结果。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能 形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取 决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的 缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
BglⅡ
19
5) 影响内切酶切割效率的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。
质粒
EcoR1
1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型和特征 4) 同裂酶和同尾酶 5) 核酸限制性内切酶的命名法 6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
1)寄主控制的限制与修饰现象 restriction modification system
质粒DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定
质粒DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定[实验原理]限制性内切酶识别短的DNA序列并在识别序列内或旁侧特异性切割双链DNA。
对环状DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。
如上次实验提取的质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，(open circular DNA，简称OCDNA)，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂(linear DNA，简称L DNA)。
这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。
因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
[仪器、材料与试剂]（一）仪器与材料恒温水浴槽、电泳仪、电泳槽、紫外线透射仪、移液枪、质粒、HindI II酶、EcoRI酶(二) 试剂1 000 mL 5xTBE：Tris 54 g硼酸27.5 g 0.5 mol／L EDTA 20 mL（pH 8.0）凝胶加样缓冲液(6x)：溴酚蓝0.25％蔗糖40％琼脂糖溴化乙锭溶液(EB) 0.5ug／mL[实验步骤](一) 酶切取5uLDNA溶液，加1uL酶切缓冲液，EcoRI酶1uL(2U)，无菌水补至总体积10uL，37保温3h，加凝胶上样缓冲液(6X)2uL，准备下个实验进行电泳，分析质粒DNA的限制性酶切图谱。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告质粒DNA酶切实验报告引言：质粒DNA酶切是分子生物学实验中常用的一项技术，它通过利用特定的酶切酶将质粒DNA分割成特定的片段，从而方便进行进一步的实验操作。
本实验旨在通过质粒DNA酶切实验，探究酶切酶的作用机制以及其在分子生物学研究中的应用。
材料与方法：1. 实验所需材料：质粒DNA、酶切酶、缓冲液、酶切反应管、电泳装置等。
2. 实验步骤：a. 准备实验所需材料，并保持无菌环境。
b. 将质粒DNA与酶切酶、缓冲液混合，进行酶切反应。
c. 将反应产物进行电泳分离。
d. 观察电泳结果并进行分析。
结果与讨论：通过实验观察，我们可以得到以下结果和讨论。
1. 酶切反应结果：在酶切反应中，我们将质粒DNA与酶切酶一起进行反应。
根据酶切酶的特异性，我们可以得到特定的DNA片段。
通过电泳分离，我们可以观察到不同大小的DNA片段。
2. 酶切酶的作用机制：酶切酶是一种特殊的酶，它能够识别DNA序列上的特定碱基序列，并在该序列上切割DNA链。
这种特异性识别和切割的能力使得酶切酶在分子生物学研究中得到广泛应用。
常见的酶切酶有EcoRI、BamHI等。
3. 实验应用：质粒DNA酶切在分子生物学研究中有着广泛的应用。
首先，通过酶切反应，我们可以将质粒DNA切割成特定的片段，从而方便进行进一步的实验操作，如克隆、测序等。
其次，酶切反应也可以用于检测DNA的特定序列，如PCR产物的验证等。
此外，酶切酶还可以用于DNA指纹图谱的构建、基因突变的研究等。
4. 实验注意事项：在进行质粒DNA酶切实验时，需要注意以下几点：a. 保持实验环境的无菌，避免外源性DNA的污染。
b. 选择适当的酶切酶和缓冲液，以确保酶切反应的有效性和特异性。
c. 控制酶切反应的时间和温度，避免过度切割或不完全切割。
结论：质粒DNA酶切是一项重要的分子生物学实验技术，通过酶切酶的作用，我们可以将质粒DNA切割成特定的片段，从而方便后续的实验操作。
质粒酶切实验报告讨论
一、实验背景质粒是细菌染色体外的DNA分子，广泛存在于细菌、真菌、植物和动物细胞中。
质粒DNA在分子生物学研究中具有重要意义，如基因克隆、基因表达、基因编辑等。
质粒酶切实验是分子生物学实验中的一项基础技术，通过限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒DNA，得到特定的DNA片段，从而实现基因克隆、基因表达等目的。
本实验旨在通过质粒酶切实验，对提取的质粒DNA进行酶切，并利用琼脂糖凝胶电泳技术检测酶切结果，以验证实验的准确性。
二、实验方法1. 质粒DNA提取（1）采用碱裂解法提取质粒DNA，具体操作如下：① 将含有质粒的细菌培养至对数生长期，收集菌液。
② 向菌液中加入溶菌酶，37℃水浴30分钟，使细胞壁破裂。
③ 加入等体积的碱液（NaOH），混匀，室温放置5分钟。
④ 加入等体积的冰乙酸，混匀，室温放置5分钟。
⑤ 12,000 r/min离心5分钟，取上清液。
⑥ 加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置15分钟。
⑦ 12,000 r/min离心10分钟，弃上清液。
⑧ 加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀，12,000 r/min离心5分钟。
⑨ 弃上清液，将沉淀溶于50μl TE缓冲液中。
（2）检测质粒DNA浓度和纯度，具体操作如下：① 使用紫外分光光度计测定质粒DNA在260nm和280nm处的吸光度值。
② 根据公式计算质粒DNA浓度和纯度。
2. 质粒DNA酶切（1）选择合适的限制酶，根据质粒DNA序列设计酶切位点。
（2）配制酶切反应体系，包括质粒DNA、限制酶、缓冲液等。
（3）将反应体系置于37℃水浴中酶切反应4小时。
3. 琼脂糖凝胶电泳检测（1）配制琼脂糖凝胶，加入适量的溴化乙锭（EB）。
（2）将酶切后的质粒DNA样品和DNA分子量标准样品加入琼脂糖凝胶孔中。
（3）100V电压电泳1小时。
（4）紫外灯下观察并拍照记录电泳结果。
三、实验结果与分析1. 质粒DNA提取结果通过紫外分光光度计检测，质粒DNA浓度为100ng/μl，纯度为1.8（A260/A280），符合实验要求。
重组质粒双酶切鉴定结果
重组质粒双酶切鉴定结果
质粒双酶切鉴定是一种用于确定质粒DNA序列的技术。
通过
使用限制性内切酶对质粒进行酶切，然后运用电泳分析，可以获得关于质粒DNA序列的信息。
重组质粒双酶切鉴定结果通常包括以下内容：
1. 双酶切酶的酶切模式：双酶切鉴定通常使用两种限制性内切酶来进行酶切。
酶切模式描述了每个酶切酶在质粒上切割的位置，包括切割位点及其与质粒线性DNA的相对位置。
2. 酶切产物的大小：通过电泳将酶切后的质粒DNA进行分离，可以得到一系列的DNA片段。
通过估算这些片段的大小，可
以进一步确定酶切酶的切割位点以及质粒DNA的序列。
3. 酶切图谱：酶切图谱是通过将电泳分离的酶切产物进行可视化的图像，通常以荧光标记或放射性标记的方式进行。
酶切图谱可以帮助鉴定质粒的酶切模式，确认切割位点，以及评估酶切的效果。
通过分析重组质粒双酶切鉴定结果，可以确定质粒的基本结构和序列信息。
这对于研究质粒的功能和用途，以及进行基因工程和生物技术研究都具有重要意义。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验报告：质粒DNA酶切实验一、实验目的1. 熟悉质粒DNA的抽提方法及质量检测方法。
2. 掌握酶切反应中各种试剂的使用方法和浓度。
3. 学习构建质粒的操作技术，合理选择酶切酶和酶切条件，成功制备目标DNA 片段。
二、实验原理质粒是宿主细胞负责复制、分离和基因表达的非必需DNA分子，通常还携带有特定的基因片段。
酶切反应是一种通过酶解水解代表性结构的方法，主要应用于DNA检测、分析和改造等方面。
在质粒DNA酶切实验中，需要先将质粒DNA利用DNA抽提试剂提取，之后与适当的酶切酶混合进行酶切反应，最终得到目标DNA片段。
三、实验步骤1. 取200µl E.coli DH5α预菌液，离心5min，弃去上清液，用PBS洗菌2次。
2. 加入200µl胰蛋白酶，37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
3. 加入200µl重组核酸缓冲液，同样37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
4. 加入50µl重组蛋白酶K，65°C水浴下混合反应50min，离心5min（13000r/min），上清液弃掉。
5. 加入50µl除菌水，65°C混匀5min后，离心5min，上清液收集起来，质粒DNA抽提完成。
6. 按照要求将质粒DNA加入载体质粒pUC19中，加入合适的限制酶进行酶切反应。
7. 通过琼脂糖凝胶电泳法将分子量合适的目标DNA片段筛选出来。
四、实验结果本次实验成功提取了质粒DNA，并利用限制酶EcoRI和BamHI进行了酶切反应。
最终，经琼脂糖凝胶电泳检测，成功得到目标DNA片段，质量均匀、纯度高。
五、实验总结本次实验通过对质粒DNA的抽提和酶切反应，加深了对质粒结构及酶切法原理的理解，并提高了实验操作的技术能力及分析数据的能力。
在今后的实验中，将继续加强实验操作，探究更多质粒DNA的构建与酶切方法，为基因检测及分析领域提供更多有效的技术支持。
实验三 质粒DNA的酶切鉴定课件PPT
Asp718I 5’-G GTACC-3’ 3’-CCATG G-5’
Kpn I 5’-GGTAC C-3’ 3’-C CATGG-5’
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（2）同尾酶(Isocaudamers）
同尾酶 ( Isocaudamers ) :识别的序列不同，但能切出 相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等
Enzyme
Sequence Isoschizomers
Acc65I AhaIII
GGTACC CCATGG
c) 平末端 如, Sma I 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
2021/3/10
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同列裂酶和同尾酶
（1）同裂酶（Isoschizomers)
同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也 可以不同，来源不同的酶。
① 完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ 和Hsu I。
Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
2021/3/10
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② 不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
3’-CCTAGG-5’
3’-CGCCGGCG-5’
2.呈回文结构(palindrome)；
3.旋转对称性；
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
4.切点大多数在识别顺序之内，也有例外。
Fok I 5’-GGATGNN -3’ 3’-CCTAC NN-5’ 外侧，产生3’-端突起
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实验五质粒DNA的微量提取及酶切鉴定
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质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的环形双链DNA 分子。
一、质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解；质粒DNA的分离和纯化。
1、细菌的生长和质粒的扩增
从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。
对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或TB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。
但对于拷贝数较低的质粒（如pBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。
因为氯霉素可以抑制宿主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。
（问题：提取质粒时，对于不同拷贝的质粒，应如何进行细菌的培养？为什么？）2、细菌的收集、裂解和质粒DNA的分离
细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。
质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：
a.大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。
b.从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA 是共价闭合的环状分子。
利用溶菌酶和加热处理的方法，使细菌的线状染色体DNA变性，通过离心，可以使染色体DNA和变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒分子仍留于上清中。
问题1：某些大肠杆菌的菌株不能用加热的方法裂解。
（1）易产生多糖的如大肠杆菌菌株，如HB101和TG1等。
尤其是HB101的一些变种和衍生物，在用去污剂或加热裂解时可释放处相对大量的糖，从而影响质粒的纯化，抑制多种限制性内切酶的活性。
（2）表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+），如HB101。
因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA 会被降解。
但通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽提）可易避免此问题。
3、质粒DNA的纯化
纯化质粒DNA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状这两个基本性质。
多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心一直是制备大量质粒DNA的方法，然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多代替方法，其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀（聚乙二醇和LiCI 分级沉淀法）等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白和RNA，达到纯化的目的。
二、质粒在细胞内的复制，一般分两种类型：
严密控制型（stringent control）：只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。
每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。
松弛控制型（relaxed control）：质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。
三、质粒DNA分子具有三种构型：
共价闭合环状DNA（cccDNA，SC构型）、开环DNA（OC构型）和线形分子（L构型）。
在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。
在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但是有不同的电泳迁移率。
其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA。
3000
2500
1000
750
OC DNA
L DNA
SC DNA
四、质粒DNA微量提取程序。
五、限制性内切酶酶切注意事项
在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。
根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题： 1. 加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。
大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。
当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。
2. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；
③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。
3. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。
建议酶切反应的DNA浓度为
0.1-0.4ug/ul。
4. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：
①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；
②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。
5. 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。
6. 酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。
7 .要保证酶作用时的最佳反应条件(ph, 温度)和底物用量，酶反应才能有效地进行。
8. 反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。
9. 反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。
10. 反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。
五、常用的凝胶电泳技术有：
琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
六、电泳的原理：
凝胶电泳的原理比较简单。
我们知道当一种分子放置在电场中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。
这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。
也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。
由于在电泳中使用了一种无反映活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。
已知摩擦系数是分子量大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异，以及所带的净电荷的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。
七、电泳中常用的电泳缓冲液
Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（TAE）：
Tris-硼酸盐缓冲液（TBE）：
Tris-磷酸盐缓冲液（TPE）：
这些缓冲液工作都很好，选择哪一种主要看个人的工作习惯。
区别：
（1）TAE缓冲容量最低，长时间电泳会被消耗，凝胶的阳极一侧将发生酸性化，定期更换缓冲液货调换两个电极的缓冲液可以防止TAE的消耗。
（2）TBE和TPE比TAE稍贵些，但它们有高得多得缓冲容量。
（3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10％‘
（4）对于高分子质量DNA，TAE的分辨率略高于TBE和TAE。
八、在琼脂糖凝胶电泳中，加入溴化乙锭的作用：
溴化乙锭（ethidium bromide,简称EtBr）会插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，将电泳放置在紫外光下观察，便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的谱带位置。
九、电泳中，凝胶加样缓冲液（Loading Buffer）的作用：
（1）增加样品密度，以保证DNA沉入加样孔中；
（2）使样品带有颜色，便于简化上样过程；
（3）其中的染料，在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。
溴酚蓝的迁移速率约与长300bp的线状双链DNA相同
二甲苯氰FF约与长4000bp的DNA相同。