2010实验一二-重组质粒DNA提取、双酶切鉴定、凝胶电泳、紫外分光法
质粒DNA的提取及电泳
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，加ddH2O至100ml。4℃保 存备用。
4. 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
四． 操作步骤
点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。 3. 制备1%琼脂糖凝胶。 （0.2克琼脂糖，加20毫升0.5倍的TBE） 4. 将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。
待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀， 轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要 避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。 5. 琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和 电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。
6. 将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面 高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心 吸出，以免影响加样。
7. 将DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。 8. 用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 9. 盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100～
1. 在50毫升的LB培养基中加入50微升氨苄青霉素（终浓度50微克/毫升）， 接入含PUC19的大肠杆菌，37度过夜培养。
2. 取1ml培养物入微量离心管中，室温离心12000转×30s，弃上清，将离心 管倒置，使液体尽可能流尽，将10毫升菌体收集在1个小指管中。
3. 将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。 4. 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离
实验三 质粒DNA的提取与酶切
相对误差2～5％ 操作简便快速 应用广泛
光学光谱区
远紫外
（真空紫）
近紫外 可见
近红外
中红外
远红外
10nm~200nm 200nm ~380nm
380nm 780 nm ~ 780nm ~ 2.5 m
2.5 m ~ 50 m
50 m ~300 m
复合光 氢灯 可见光分光光度计光源 （阳光及钨灯） 紫外分光光度计光源 三棱镜
实 验 三
重组质粒DNA的提取、酶切鉴定及电泳检测
紫外分光光度法检测DNA
实验安排
上午：
质粒DNA提取 限制性内切酶酶切鉴定 琼脂糖凝胶制备
下午：
酶切产物的电泳 紫外分光光度法检测DNA 实验课题设计的要求与安排
问
题
1 提取质粒DNA和提取基因组DNA有何不同?
2 限制性内切酶与医学有何关系?
试剂：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂
仪器与设备：电泳仪、电泳槽、染色缸、漂洗缸、
烧杯、吸管、微量移液器
3.实验方法和步骤
方法：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
步骤： 试剂准备
制胶 样品处理 电泳 染色与脱色
4.实验观察指标 ① 聚丙烯酰胺凝胶上电泳区带的分布 ② 电泳区带颜色深浅
5.实验预期结果的描述
重组DNA技术的一般过程
1.目的基因的获取 2.目的基因 和质粒载体 的连接
DNA片段（目的基因）与载体DNA分子相连接，形 成重组DNA
3.将重组DNA分子导入受体细胞 4.选择
选出含有所需要的重组体DNA分子的受体细胞
5.目的基因表达
目的基因在受体细胞中高效表达，合成产物（蛋白质)
重组质粒DNA的提取、 酶切鉴定
1.0 ml
＋ 200l
悬浮液
细胞悬浮液（STE） 葡萄糖：提供等渗环境，增加溶液的粘度, 防止
DNA受机械作用而降解 Tris·HCl （三羟甲基氨甲烷） :
不含金属离子,与EDTA更能稳定DNA的活性 EDTA(乙二胺四乙酸二钠):
螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制DNase保 护DNA；EDTA的存在,有利于溶菌作用。
温放置5min；
(3)加入200l细菌裂解液，颠倒混匀，待溶液变粘稠后，
立即进行下一个步骤； (4)加入150l中和液，上下颠倒混合后置冰上 5min，
12,000转/分，离心 5min；
(5)将上清移至另一管中,加入等体积的TE饱和酚/氯仿
(1:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 2min；
离心 2min
＋等体积TE
饱和酚/氯仿
移上清时要定量，不要混入白色沉淀物或漂浮物
饱和酚/氯仿(1:1)
！！带手套，一旦沾染皮肤请立即用大量清水冲洗！ 酚：使蛋白质变性沉淀 变性效果好，但与水部分互溶。
氯仿：可使蛋白质变性沉淀 变性效果没有酚好，但与水不相混溶。
离心后分层
上层水相含质粒 水相下面是变性蛋白 下层酚/氯仿
冰上 5min后 12,000转/分
离心 5min
移上层水相
于另一管中
7
接提取质粒的操作流程及具体原理
（包括一些试剂的作用原理 ）
移上层水相
于另一管中
分层
＋等体积 氯仿/异戊醇
!!移上清时要定量，宁少勿多!
氯仿/异戊醇(24:1)溶液
氯仿：将残留在水相中的酚带走； 也可以再次使蛋白变性。
异戊醇：降低分子表面张力，减少气泡产生；
质粒DNA的提取、纯化及验证
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：201000100122 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
质粒DNA的提取、定量、酶切及PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
质粒DNA的提取及鉴定
二、实验原理
当pH=4.8的乙酸钾将其pH调到中性时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性， 形成缠绕的致密网状结构。同时，在反应体系中变性 的蛋白质会形成大量沉淀以及十二烷基磺酸钾沉淀， 染色体DNA会进一步缠绕在这些沉淀上。离心后，染 色体DNA与蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除 去，质粒DNA留在上清里。
水平电泳装置
四、实验操作
1、用碱裂解法提取质粒DNA：挑选单菌落小规模扩增后， 将2 mL含相应抗生素的 LB加入到容量为15 mL并通气良好的 试管中，然后接种入一单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜， 收集细菌。
2、将细菌团块重悬于100μL用冰预冷的溶液Ⅰ（150 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris–HCl，pH8．0，10 mmol/L EDTA， pH8.0）中剧烈振荡。加200μL新配制的溶 液Ⅱ(0.2mol/L Na0H, 1%SDS)盖紧管口，快速颠倒离心管5 次，将离心管放置于冰上。
3）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械 剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。
4）加入醋酸钾溶液后，可用小玻棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒 DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。溶解DNA，加入等体积 酚/氯仿抽提，取水相再用乙醇沉淀DNA。
四、实验操作
3、对提取的质粒DNA进行纯化及酶切鉴定： 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA，采用胶回收 试剂盒纯化质粒DNA；分析质粒DNA的限制 性酶切图谱，选择合适的限制性内切酶对质 粒DNA进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切 产物。
五、 结果处理
利用凝胶成像系统进行检测
闭环(螺旋) 闭环(超螺旋) 开环(部分解链 )
分子医学实验：实验四 重组质粒DNA提取及双酶切鉴定1
Molecular medicine Skills
问题：
1.提取质粒DNA的目的？ 2.什么是限制性核酸内切酶？有何作用？ 3.为什么选用双酶切？
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时的三者泳动速度大小关系？
10
Molecular medicine Skills
质粒DNA与宿主菌染色体DNA的区别：
宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA
要大得多
Escherichia coli. This organism was named for its discoverer, Theodore Escherich, and is one of the premier model organisms used in the study of bacterial genetics, physiology, and biochemistry. This enteric organism is typically present in the lower intestine of humans, where it is the dominant facultative anaerobe present, but it is only one minor constituent of the complete intestinal microflora. E. coli, is capable of causing various diseases in its host, especially when they acquire virulence traits. Strains of E. coli can cause urinary tract infections, neonatal meningitis, and many different intestinal diseases, usually by attaching to the host cell and introducing toxins that disrupt normal cellular processes. Virulence proteins may be encoded on extrachromosomal plasmids or within bacteriophages and distinct DNA segments termed pathogenicity islands (PAIs). PAIs are likely to have been transferred horizontally and may even have integrated into the chromosome through bacteriophage or plasmid
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温，与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280= DNA纯净A260/A280 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒DNA提取+电泳+质粒酶切实验报告
实验一：质粒DNA提取+琼脂糖凝胶电泳*实验目的：1.掌握质粒DNA提取的基本原理和方法2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法*实验原理：1.DNA提取原理1）DNA提取要求：①保证DNA一级结构的完整性；②排除其他分子的污染，使其纯度尽可能提高。
2）DNA样品来源：①培养细胞；②组织样本；③血液样本。
3）主要试剂和材料及仪器：试剂和材料：RNA酶A、细胞悬浮液（Buffer P1)、细菌裂解液（Buffer P2）、中和液（Buffer P3）、漂洗液PW1、漂洗液PW2、洗脱液、质粒DNA吸附柱、滤液收集管仪器：微量移液器、台式微量高速离心机、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪或凝胶成像系统。
2.电泳原理：1）概念：电泳是指带电粒子在电场中向电势降低的方向移动的现象，移动速度与粒子大小及所带电荷多少有关。
在一定pH条件下，核酸及蛋白质等生物分子呈带电状态，可以进行电泳分析。
2）迁移方向：DNA由负极向正极迁移3）影响目标物迁移速率的因素：分子大小、构象、凝胶浓度、琼脂糖种类、电泳缓冲液、嵌入染料的存在和使用电压等。
4）荧光强度（得率）：荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比的。
5）琼脂糖凝胶电泳原理：(1)关于电泳技术:电泳常用于分离和纯化那些分子大小电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子一尤其是蛋白质和核酸。
正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。
通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp大小的DNA片断。
一般琼脂糖胶浓度在0.5%到4%之间，琼脂糖凝胶浓度越大,凝胶就越硬。
较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离,而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。
(2)琼脂糖凝胶电泳条带的观察:通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。
实验一 质粒DNA的提取纯化、限制性酶切及电泳检测
实验一 质粒DNA的提取纯化、限制性酶切及电泳检测内 容 提 要本实验采用碱裂解法提取细菌细胞中的质粒DNA，经酚/氯仿/异戊醇抽提和乙醇沉淀等步骤，从而得到适用于基因操作的质粒DNA。
采用分子生物学软件查找质粒DNA的酶切位点，然后利用限制性内切酶对质粒DNA进行酶切反应，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离和凝胶成像系统进行分析鉴定。
本实验要求：1．通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。
2．掌握质粒DNA的限制性内切酶酶切分析，了解内切酶的性质。
3．学习DNA的电泳检测。
原 理1．质粒DNA的提取把一个目的DNA片段通过重组DNA技术，进入受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
质粒(Plasmid)作为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，广泛应用于基因操作的各个方面。
因此，质粒的分离与提取是分子生物学中最常用、最基本的实验技术。
质粒是一种染色体外的DNA分子，其大小范围从1-200kb不等。
大多数来自细菌细胞的质粒为双链、共价闭合环状的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型和松驰控制型。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
通常所用的质粒载体有pBR322、pUC18、pUC19等，本实验提取pUC19质粒。
从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。
碱裂解法的原理是：碱性条件下，用十二烷基磺酸钠(SDS) 破坏菌体细胞壁，并使菌体蛋白质和染色体DNA变性，双链解开。
实验一二重组质粒DNA提取、双酶切鉴定、凝胶电泳、紫外分光法
3‘
Hind
II355I '''--CA
T A
T G
A C
A T
G-
T-3' 3'-T T C
G A A-5'
PUC119 （3.2K b）
U6启动 子（25 6bp）
电泳检测
2.2 实验材料: (1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。
31
2.3 实验步骤 (1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育1-2h） (3)电泳鉴定
梳）
倒缓冲液，加样 （取酶切质粒DNA样品液 20μl + 4
μl上样缓冲液，混匀 ）
电泳（100V 0.5小时，5V/cm）
染色与检测
（EB染色5 min，洗脱3min，紫外灯 下检测）
一、电泳前准备
准备内容
作用
1.刷干净电泳制胶的梳子，板子， 槽子，蒸馏水洗净晾干
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer
、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
3. SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DN
A
细菌的细胞壁破裂，内
3.1 实验原理： 容物释放
①染色体DNA断裂成不同长度的线性双
高碱
链DNA；
② ①线质性粒双DN链A不DN发A片生段断中裂的，氢保键持断双裂链，闭双合 链 环解状离；变性。
DNA分子的有效分 0.8 0.5 0.4 0.2 0.1
2 实验材料及试剂
琼脂糖
电泳缓冲液：1TAE 10 加样缓冲液 EB染色液 ——它能和碱基间的氢键结合，
在波长为254nm~365nm的紫 外光照射下呈橘红色（530n m）的荧光.
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
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25
1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
属 系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
基因载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括 质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)
柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致
病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行
筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
实验内容
1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P83)
上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000g10min 弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000g×5min 去上清，管平放室温静置10min， 20 µ l TE 溶解DNA
加1.5ml培养物于EP管，12000g×30S
RCF = 1.12r（rpm/1000)2
20
溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
同学自己加
准备室 老师已 加好
合计 37 ℃，1-2h
20μl
33
思考题？
为什么要对重组质粒DNA进行双酶切？
34
三、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶 电泳
1 原理
在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解 离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极 方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、 构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动 力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达 到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合， 在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
11
最慢
中
最快
1.3 质粒DNA的一般特性：
(1) 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (2) 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型： 菌毛、抗药性等
(3) 它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。
(4) 质粒DNA与宿主菌染色体DNA的两点不同： ★ 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 ★ 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒 DNA呈闭合环的形式。
高酸 中和 至中 性 纯化
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)
①
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械
8
1.2 质粒的三种构型
(1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)
9
(2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
10
(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
13
1.4 提取质粒DNA的目的与意义：
基因载体/基因克隆/基因工程
2 提取大肠杆菌质粒DNA的 方法和原则
2.1 提取质粒DNA的常规方法
(1)SDS碱裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。
但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒 DNA的差异来分离的。
一.质粒DNA的提取
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪Hale Waihona Puke ？71.1 质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般 不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
U6启动子 （256bp）
电泳检测
2.2 实验材料:
(1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。
31
2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育1-2h） (3)电泳鉴定
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2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O 10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
2.3 核酸分离纯化的总原则：
(1) 保证核酸一级结构完整 (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
3. SDS- 碱 裂 解 法 提 取 Puc119-U6 重 组 质 粒 DNA
细菌的细胞壁破裂，内容物释放
3.1 实验原理：
高碱
①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA； ②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。 ①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； ②双链DNA并不完全分离。
二、限制性内切酶切割重组质粒
1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease）
1.1 定义
能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子 的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤
(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）
(2)细菌的收集与裂解 收集方法：高速离心的方法 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。
(3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
RCF: 离心力（g） r: 离心半径（mm） rpm: 每分钟转速（r/min）
注意事项：
1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤； 8、 每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶 切和电泳，其余10ul用于下次的转化实验，切 记！！！
35
1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素
1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液
1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
排除电泳槽的电极接触不良，确保 buffer的缓冲能力，减少污染。 达到较好的分离效果，防止样过快 跑出胶或者是过慢浪费时间。
4.计算agarose的用量和制胶 buffer的 实验记录备查 用量记录，胶最终越薄越好。
二、制胶
注意事项 步骤 1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确
3.3 除去上清，加入冰的200 µ l 溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min 实 加入200µ l 溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min 验 步 加入150µl 冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min 骤
转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿(1:1)，温和振荡，冰浴3min， 12000g×5min
2 实验材料及试剂
琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE
10 加样缓冲液
EB染色液 ——它能和碱基间的氢键结合，在波长为
254nm~365nm的紫外光照射下呈橘 红色（530nm）的荧光.
3 实验步骤
琼脂糖凝胶板的制备
（封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）
倒缓冲液，加样 （取酶切质粒DNA样品液 20μl + 4
剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对
质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作 用）
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溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）
质粒DNA的提取、纯化、酶切、 电泳、 紫外分光光度法定量测 定
朱文博 中山医学院
基因克隆示意图
分、切
载体DNA ( 限制性内切酶切开 )
＋
目的基因
接
宿主细胞
＋
重组体
转
已转化的宿主细胞
繁殖