2010实验一二-重组质粒DNA提取、双酶切鉴定、凝胶电泳、紫外分光法

2 BamHI 、HindⅢ酶切质粒及鉴定
2.1 实验原理：
利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的 核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA 片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴 别目的基因（重组质粒DNA）
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PUC119 （3.2Kb）
BamHI
双酶切
Hind III 重组质粒
BamHI 5'-G A A T T C-3‘ 3'-C T T A A G-5' Hind III 5'-A A G C T T-3' 3'-T T C G A A-5'
2.2 分离纯化质粒DNA的主要步骤
(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）
(2)细菌的收集与裂解 收集方法：高速离心的方法 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、 碱变性法、沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。 根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。
(3)质粒DNA的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较 小及共价闭合环状的性质。
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1.4 提取质粒DNA的目的与意义：
基因载体/基因克隆/基因工程
2 提取大肠杆菌质粒DNA的 方法和原则
2.1 提取质粒DNA的常规方法
(1)SDS碱裂解法 (2)煮沸法 (3) high pure plasmid isolation kit等。
但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒 DNA的差异来分离的。
排除电泳槽的电极接触不良，确保 buffer的缓冲能力，减少污染。 达到较好的分离效果，防止样过快 跑出胶或者是过慢浪费时间。
4.计算agarose的用量和制胶 buffer的 实验记录备查 用量记录，胶最终越薄越好。
二、制胶
注意事项 步骤 1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确
二、限制性内切酶切割重组质粒
1 关于限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease）
1.1 定义
能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子 的断裂,产生相应的限制性DNA片段。 主要存在于细菌体内。 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶 切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）。
上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000g10min 弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000g×5min 去上清，管平放室温静置10min， 20 µ l TE 溶解DNA
加1.5ml培养物于EP管，12000g×30S
RCF = 1.12r（rpm/1000)2
2 实验材料及试剂
琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE
10 加样缓冲液
EB染色液 ——它能和碱基间的氢键结合，在波长为
254nm~365nm的紫外光照射下呈橘 红色（530nm）的荧光.
3 实验步骤
琼脂糖凝胶板的制备
（封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）
倒缓冲液，加样 （取酶切质粒DNA样品液 20μl + 4
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溶液III：HAC(乙酸)和 KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液 (复性，分离) ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成
沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
如果两条链均断开，即为线状DNA。
电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）
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最慢
中
最快
1.3 质粒DNA的一般特性：
(1) 质粒是细菌内的共生型遗传因子,有相对独立性。 (2) 它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型： 菌毛、抗药性等
(3) 它是双链闭合环状DNA，分子量大小不等。
(4) 质粒DNA与宿主菌染色体DNA的两点不同： ★ 宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多 ★ 纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒 DNA呈闭合环的形式。
质粒DNA的提取、纯化、酶切、 电泳、 紫外分光光度法定量测 定
朱文博 中山医学院
基因克隆示意图
分、切
载体DNA ( 限制性内切酶切开 )
＋
目的基因
接
宿主细胞
＋
重组体
转
已转化的宿主细胞
繁殖Leabharlann Baidu
筛
阳性克隆株
表达
基因工程
定义：
实现基因克隆所采用的方法及相关的工 作统称为重组DNA技术，又称重组DNA技术。
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1.2 质粒的三种构型
(1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA)
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(2) 开环DNA (open circular DNA, OC DNA)
如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能 发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。
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(3) 线状DNA (linear DNA, L DNA):
剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用)
② EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对
质粒分子的降解作用。（保护作用） ③ Tris•HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作 用）
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溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用） ② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变 性作用）
RCF: 离心力（g） r: 离心半径（mm） rpm: 每分钟转速（r/min）
注意事项：
1、加样枪正确使用； 2、标记自己所提取的质粒类型； 3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中； 4、加不同溶液要换枪头； 5、离心前把管擦干； 6、转移上清时不要吸到沉淀； 7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤； 8、 每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用于酶 切和电泳，其余10ul用于下次的转化实验，切 记！！！
μl上样缓冲液，混匀 ）
电泳（100V 0.5小时，5V/cm）
染色与检测
（EB染色5 min，洗脱3min，紫外灯下检测）
一、电泳前准备
准备内容 作用
1.刷干净电泳制胶的梳子，板子， 槽子，蒸馏水洗净晾干
2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 3.根据DNA的分离范围选择合适的 胶浓度并记录
防止不必要的重复污染，减少外来 的污染。梳子干净有利于梳孔的 形成。
U6启动子 （256bp）
电泳检测
2.2 实验材料:
(1)重组质粒; (2)BamHI 、Hind Ⅲ限制性内切酶; (3)反应缓冲液。
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2.3 实验步骤
(1)建立反应体系 (2)酶切反应（温育1-2h） (3)电泳鉴定
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2.4 双酶切体系
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O 10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
2.3 核酸分离纯化的总原则：

(1) 保证核酸一级结构完整 (2) 排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、 糖、 有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）
3. SDS- 碱 裂 解 法 提 取 Puc119-U6 重 组 质 粒 DNA
细菌的细胞壁破裂，内容物释放
3.1 实验原理：
高碱
①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA； ②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。 ①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； ②双链DNA并不完全分离。
基因载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括 质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)
柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致
病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行
筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
实验内容
1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)
2.限制性内切酶的酶切鉴定(P83)
一.质粒DNA的提取
1 关于质粒的概念
a.什么是质粒（plasmid）？ b.质粒的本质是什么？ c.质粒有哪些构型？ c.质粒有哪些特点？ d.质粒的用途有哪些？
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1.1 质粒的定义
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分 子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般 不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。
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1.2 分类
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1.3 作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
1.4 命名
Hin dⅢ
属 系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
高酸 中和 至中 性 纯化
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚 成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质
3.2 主要试剂及作用
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)
①
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械
2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀， 非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶 继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。 冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的 瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引 起的胶中孔径不均匀影响分离效果。 3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右， 即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧， 缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定 的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头 赶掉气泡。 制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产 生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入， 使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显； 不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动， 尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以 上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈 建议跑完胶之后再用EB染色。 过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。 时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影 响胶内部孔径形成。
同学自己加
准备室 老师已 加好
合计 37 ℃，1-2h
20μl
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思考题？

为什么要对重组质粒DNA进行双酶切？
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三、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶 电泳
1 原理
在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解 离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极 方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、 构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动 力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达 到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合， 在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。
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1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素
1 DNA分子的大小 2 构象 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液

1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
琼脂糖浓度（％，W/ V )
DNA分子的有效分离范围（kb)
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
3.定性鉴定:DNA 的琼脂糖凝胶电 泳(P28)
4.定量检测：DNA 的紫外分光光度法 测定(P37)
实验目的
掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的 作用 ; 掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切 酶 掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和步骤； 掌握紫外分光光度计对DNA含量的测定方法。
4.室温凝胶30分钟
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是 同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入 电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳
注意事项 步骤 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为 Loading buffer浓度不宜过低，点样时样 1 X，混匀 品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高， 电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。 2.点样 沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰 坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起 时不要过猛带出样品。每点一个样完， 吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果 是有特殊要求，例如回收，强烈建议每 点一个样换一次枪头。加样的速度当然 是越快越好，注意保证质量。点样的量 不要太大，一方面是体积不要太大，溢 出污染邻位样品；一方面两不要太大， 容易导致脱尾和模糊不清。 胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。 跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出 胶等意外发生。
3.3 除去上清，加入冰的200 µ l 溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min 实 加入200µ l 溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min 验 步 加入150µl 冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min 骤
转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿(1:1)，温和振荡，冰浴3min， 12000g×5min