现代生物技术实验讲义

现代生物技术实验讲义z DNA重组技术与基因检测芯片技术z动物细胞培养及细胞活性检测技术z发酵工程及分离提取技术第一部分DNA重组技术与基因检测芯片技术1. 相关基础知识1.1 DNA重组技术的基本原理基因工程技术的核心内容就是DNA重组技术，即在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要生产出不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。

强调外源核酸分子（一般情况下都是 DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限，将来自不相关物种的基因放入一个宿主中是DNA重组技术的重要特征。

另一个特征是繁殖。

重组DNA技术主要包括以下几个要素：载体；工具酶；外源DNA，即要克隆或表达的DNA片断；原核或真核宿主细胞。

基因克隆的基本步骤是先用限制性内切酶切割外源 DNA 和载体（质粒 DNA 载体或噬菌体载体），然后连接酶连接，组成DNA重组分子（重组质粒，见图1），转化入受体细胞，构建出基因文库，再筛选。

除了通常的克隆外，还有亚克隆。

初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的 DNA 片段，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段 DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。

图1 重组质粒构建示意图载体的作用是把外源DNA带进宿主细胞，并使之在细胞内建立稳定的遗传状态，在细胞内繁殖、传代或进行表达。

质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。

它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。

质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和α-互补、插入失活等筛选标记。

常见的质粒载体有： pBR322 pUC18/19、、pUC118/119、 pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体，如： pBluescript KSⅡ（±）。

大肠杆菌表达载体是最常见的原核表达载体，可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。

常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质 A 和纤维素结合位点等。

1Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站：Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 53280998005 网站：2重组DNA 所涉及的工具酶，最主要的是II 型限制性内切酶和DNA 连接酶。

Ⅱ型限制性内切酶用来切割DNA ，相当于基因工程中的“剪刀”。

II 型限制性内切酶识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性。

识别序列主要为 4bp ～6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异。

如Eco RI 和 Hin d Ⅲ 的识别序列和切割位置如下。

Eco R G Ⅰ↓AATTC Hin dA Ⅲ↓AGCTTCTTAA ↑G TTCGA ↑A连接酶则是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。

常用的T4DNA 连接酶是在T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现和分离的，需 Mg2+ 和ATP 的存在才能发挥活性。

它能催化两条匹配DNA 链的3’－OH 和5’－P 之间形成磷酸二酯键而把两个DNA 分子连接在一起。

外源DNA 就是需要克隆的DNA 片断，一般有四种来源。

（1）限制性内切酶切割DNA 产生的片断，经电泳分离后回收获得；（2）大DNA 分子经人工剪切产生的片断，这种片断一般是平末端；（3）cDNA ，即与mRNA 互补的DNA ，由真核基因的mRNA 逆转录制备；（4）人工合成的基因，例如根据蛋白质的氨基酸顺序和遗传密码合成的一些基因。

外源DNA 分子与载体（质粒）经过相同的酶切可以产生相互匹配的粘末端或平末端，经DNA 连接酶连接就构成了重组DNA 分子（重组质粒）。

质粒的转化就是指将质粒或以它为载体构建的重组DNA 分子导入细菌（受体细胞）的过程。

这一步是实现重组克隆的增殖。

受体细胞要接纳外源DNA，必须处于感受态。

所谓感受态，就是细菌具有吸收周围环境中的DNA的生理状态。

为了提高受体菌摄取外源DNA 的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。

目前主要采用电转化法和CaCl 2法将外源DNA 导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl 2感受态细胞。

电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而使外源DNA 能进入细胞，一般转化率为 109 ～ 1010 转化子 /μg DNA ；对于热激法，是利用冰冷的 CaCl 2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的 “感受态”，易于摄取外源DNA 。

转化率约106～ 107转化子 /μg DNA 。

获得转化子后可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。

首先可根据转化细胞的特征进行初步筛选。

由于载体都具有供筛选用的遗传标记，如抗生素，细胞转化后获得了这种遗传特性，使用含适当的相应抗生素的培养基即可初步筛选出转化的细菌。

经过培养初步筛选出来的细菌不一定都含有重组DNA ，还需进一步对DNA 进行分析。

常用方法之一是进行重组质粒的抽提，然后电泳分析，观察其分子量与原有载体相比是否增大；方法之二是将抽提的重组质粒进行限制性内切酶分析，观察酶切下来得到的DNA 片段大小是否与预计的相符；方法之三是以重组质粒为模板进行PCR 鉴定，观察PCR 产物的大小是否与目的基因大小相符；Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 53280998005 网站：3方法之四则是将重组质粒进行DNA 序列分析，直接分析重组质粒上的插入片段即目的基因的大小与序列是否正确。

在确证得到核酸序列一致的基因后，接下来就要想办法使该基因得到表达，获得基因表达产物——蛋白（肽）。

通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定。

SDS-PAGE 电泳不但能观察到蛋白在电场中的泳动位置，而且还能知道蛋白的分子量大小以及由几个亚基组成。

此外，还可将电泳胶上的蛋白质条带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应来检测特异蛋白的存在，即所谓的Western Blotting 。

在基因表达产物也得到确证之后，就可以对表达的蛋白（肽）进行发酵和分离纯化，并研究其生物学功能。

1.2基因芯片技术的基本原理基因芯片（genechip ）技术是自20世纪90年代初发展起来的新兴技术，又称DNA 芯片（DNA chip ），是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统或CCD 成像扫描系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。

基因芯片基本技术通常包括：芯片制作、样品制备（标记）、生物分子反应（杂交）以及数据分析（杂交信号的检测及分析）等步骤。

在本实验教程中，我们给大家介绍单基因多人份的基因检测芯片的基本原理和技术。

本实验教程使用的基因芯片制作是在醛基修饰后的玻璃基片上制造的。

DNA 探针（寡核苷酸片段，与被检测的靶DNA 互补）溶液与点样缓冲液以1：1比例混合，通过点样仪点到醛基基片上，然后用芯片活化液固定8小时。

固定后DNA 探针将与醛基玻片共价结合，形成阵列；在基因阵列周围贴上反应舱，完成芯片制作过程。

样品制备：通过向样本，如毛发、口腔粘膜脱落细胞、全血中加入抽提液，煮沸、离心等操作，使样品中的细胞裂解释放出DNA 、同时使蛋白变性沉淀，完成样本DNA 的抽提。

抽提获得的染色体DNA 浓度太小，直接进行杂交检测无法获得信号。

将抽提获得的染色体DNA 作为模板，进行PCR 扩增。

针对待检基因序列的SNP 位点，设计20bp 左右的上、下游引物用于扩增靶DNA ，同时，在引物的5’端加上标签序列，对扩增靶DNA 进行标记。

杂交反应：将扩增后的PCR 产物变性成单链DNA 分子，由于基因芯片上固定有与标签序列相结合的标签探针，可与PCR 扩增产物通过碱基配对进行特异性杂交。

这样，芯片上的每个标签探针都结合有一个扩增靶DNA 分子。

然后将芯片与经生物素（Biotin ）标记的特异性检测探针进行杂交，就可以知道样本DNA 序列中的SNP 信息，即到底是属于野生型还是突变型，是杂合子还是纯合子。

在杂交反应中，序列组成、靶标DNA 分子和探针的长度、杂交温度、盐浓度等均会影响杂交效率和强度。

显色原理：采用生物素标记的碱性磷酸酶（AP ）催化的NBT/BCIP 显色反应的检测方法。

首先，特异性检测探针上的生物素先与链亲和素碱性磷酸酶复合物（Stripavitin-AP）反应，生成新的复合物：Biotin-Stripavitin-AP，后者发生如下的显色反应：Biotin-Stripavitin-AP + BCI-P → BCI-OH + Pi （pH 7.5）BCI-OH + NBT →蓝紫色沉淀其中，BCIP为5溴-4氯-3吲哚磷酸；NBT为硝基四氮唑蓝。

检测原理：采用CCD（Charge Coupled Device 即电荷耦合器件）原理，将芯片上的色斑信号扫描成图像，用Array Doctor分析软件进行分析，给出靶基因SNP信息。

单基因多人份基因芯片检测原理示意图2实验目的和要求2.1 DNA重组技术实验目的和要求本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。

2.1.1 提取基因工程中的运载基因的载体DNA，掌握最常用的提取和纯化DNA的方法。

2.1.2 掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。

并以此法进一步区分质粒DNA中染色体DNA和RNA的污染；估计出质粒DNA分子量的大小；观察质粒DNA三种基本构象的比例；也可用此法纯化DNA及计算出DNA的浓度，是基因工程实验中最常用的实验方法。

2.1.3 学习和掌握用紫外分光光度法测定DNA的纯度和浓度。

2.1.4 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法。

了解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。

2.1.5 学习和掌握感受态细胞的制备过程。

2.1.6 掌握质粒的转化方法，学习把体外重组的DNA（即连接反应物）导入受体细胞（感受4Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站：Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 53280998005 网站：5态细胞），使受体菌具有新的遗传特性，并从中选择出阳性转化子。