miR-1腺病毒载体的构建及表达分析
腺病毒与基因传递载体的构建与应用
腺病毒与基因传递载体的构建与应用腺病毒（Adenovirus）是一种以双链DNA为基础的病毒，主要感染哺乳动物，包括人类。
由于具有较高的感染率和传播速度，在临床治疗和基因治疗等领域，被用作基因载体。
这篇文章将会介绍腺病毒作为基因传递载体的构建和应用。
一、腺病毒作为基因传递载体的构建腺病毒是一个十分复杂的病毒，其基因组由约36 kb的双链DNA组成。
它的基因组被分为两个方向，一个方向编码早期基因（E1A、E1B、E2、E3和E4），另一个方向编码晚期基因（L1-L5）。
早期基因编码的转录产物参与了病毒DNA的复制和转录，晚期基因主要编码病毒颗粒结构和组装所需的蛋白质。
基于这个理论框架，可以利用腺病毒基因组进行基因传递。
首先，必须构建一个适当的腺病毒载体（Adenoviral vector），其基本构造是一个缺少大部分基因组的腺病毒。
在此基础上，将感兴趣的DNA片段插入到腺病毒基因组里。
这需要掌握两种方法：重组技术和确认策略。
以重组技术为例，首先要得到一个带有感兴趣DNA片段的载体核酸。
这个DNA完整地包含了带有专门的重组序列的保护酶切位点，使其能够在目标腺病毒基因组上的互补位点诱导重组。
在这个操作后，形成了一个新的腺病毒基因组，其中包括感兴趣的DNA片段。
然后，改造后的基因组可以转染到腺病毒感染容器中，进行繁殖和扩增。
这一步骤可以提高已经构建的腺病毒载体的数量。
其次，需要构建一种辅助病毒（Adenoviral helper）来帮助前述的重组病毒形成成熟的病毒颗粒。
在这个方法中，辅助病毒中没有任何有价值的基因，因此它不能复制自己。
相反，它确保引入的重组病毒可以在感染容器中成功地产生新的病毒颗粒。
通过这样的步骤，可以构建出一种有效的载体，并用于下一步的实验设计。
二、腺病毒作为基因传递载体的应用腺病毒作为基因传递载体可以应用于基因治疗、疫苗研究、基因注入和细胞治疗等领域。
下面分别介绍一下相关应用的基本技术。
腺病毒载体的构建和应用
腺病毒载体的构建和应用随着生物工程技术的不断发展，越来越多的生物医学研究领域开始趋向于基因治疗和基因编辑等方向。
这些技术的实现需要一种特殊的工具——腺病毒载体。
腺病毒（Adenovirus）是一种不包含RNA病毒的DNA病毒，其表面包裹着许多蛋白质，使其具有较好的基因导入能力。
这使得腺病毒成为一种常用的基因载体，被广泛应用于细胞遗传学、基因治疗等领域。
腺病毒的构成腺病毒包含一个大小为36 kb的线性双链DNA，这条DNA上编码了丰富的基因信息，其中大约包含40个基因左右。
腺病毒分为革兰氏正染色体和非冠状病毒两种类型，目前在研究中应用最多的是非冠状病毒型腺病毒。
腺病毒载体构建的两种方法目前有两种主要的构建腺病毒载体的方法，分别是端到端的法和质粒基因重组的法。
端到端的法端到端的法在构建腺病毒载体时需要把目标基因全长克隆进腺病毒的基因组中。
这种方法在基因克隆、重组和转染等方面比较复杂，对实验人员的操作技能要求较高。
同时，这种方法的构建产物相对来说比较容易受到细胞内DNA修饰和限制性酶的影响。
质粒基因重组的法对比之下，质粒基因重组的法相对来说较为容易，需要构建的重组质粒包括表示目标基因的转录单元以及与腺病毒DNA重组所需的旁路序列等。
通过将质粒DNA转染至腺病毒蛋白质、酶和基因表达产物等组分共同构成的细胞核中，将质粒DNA与腺病毒DNA进行重组，从而构建出目标腺病毒载体。
质粒基因重组法不仅可以有效克服端到端法受到限制性酶和DNA修饰的影响，而且富于设计灵活度，从而满足更多的实验需求。
腺病毒载体的应用腺病毒载体广泛应用于人类和动物细胞体内的基因传递、基因治疗和基因工程方面。
通过腺病毒载体可进行基因敲除、基因转录和基因转译等一系列基因编辑操作。
基因敲除基因敲除是研究腺病毒载体理解生命过程和信号转导途径的重要手段之一。
通过基因敲除的方法可以对特定基因进行敲除，从而寻找与该基因相关联的复杂的生物学催化剂。
目前腺病毒载体敲除方法尤其得到广泛应用，对于生命科学研究者来说具有重要的意义。
重组腺病毒载体的构建【精品推荐】
腺病毒载体的特点
n 主要以Ad5型病毒为框架构建 n 具有携带外源基因和转移外源基因的双
重功能 n 可插入长达5kb的外源基因 n 通过受体介导的细胞内吞作用进行基因
转移 n 安全性，复制缺陷（E1区缺陷）
腺病毒载体的特点
n 保留了E3区的腺病毒－－可逃逸宿主免 疫应答，可用于体内基因治疗
重组腺病毒的鉴定
n 病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
n 取上清提取重组病毒DNA n 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
n 24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 n 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 n 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
病毒滴度测定
n 观察细胞病变情况，取100%出现CPE的 稀释度计算病毒滴度： 105细胞×稀释度×10个病毒/细胞 pfu/ml=
重组病毒的扩增
n 293细胞大规模培养：悬浮培养，单层培 养
n 用收集的病变细胞培养上清或冻融上清 感染293细胞
n 反复培养、感染 收集大量的病变细胞 及病毒上清
n 不整合到宿主基因组 n 增殖和非增殖细胞均可感染
构建腺病毒载体的要素
n 腺病毒基因组质粒 n 穿梭质粒 n 目的基因片段 n 包装细胞
AdMax™ system
穿梭质粒
pDC315
腺病毒载体的包装胞细
n HEK293细胞－－E1区缺陷互补的细胞系 悬浮HEK293细胞，易大规模培养，可用 于腺病毒大规模制备。但不易长期保持 稳定。 单层培养HEK293细胞，稳定，用于 重组腺病毒载体构建、蚀斑挑选。也可 用于腺病毒扩增。
带绿色荧光蛋白的米非司酮诱导表达腺病毒载体的构建及表达
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（ 基础 研 究 ）
带 绿 色 荧 光 蛋 白 的米 非 司 酮 诱 导 表 达 腺 病 毒 载 体 的 构 建 及 表 达
贾绍 昌 ， 陈 坚 ， 全年 赵
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【 关键词 ］ 腺病毒载体 ； 米非 司酮 ； 基凶调控 ； 绿色荧光蛋 白 【 中图分类号】 Ｑ ８ ７２ 【 文献标 志码 】 Ａ ［ 文章编号 】 １０ —１９ ２ １ ） ｌ ０ ３０ ０ ８８ ９ （０ ０ （ － ４ －５ 】０
腺病毒载体构建的基本原理与应用
腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒（Adenovirus）是一类非常常见的病毒，它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。
在基因工程领域，腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。
通过对腺病毒进行适当的改造，可以将外源基因有效地传递到目标细胞中，并实现基因的高表达。
本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。
2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤：2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型，其中最常用的是腺病毒2（Ad2）和腺病毒5（Ad5）。
选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。
2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。
质粒载体通常由多个部分组成，包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。
通过合成或PCR扩增等方法，可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。
2.3 建立包装细胞系在构建过程中，需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。
这些细胞系通常包括两种类型的细胞：一种是质粒携带者，将质粒转染进细胞内；另一种是包装细胞，它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。
2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中，使其进入细胞内。
转染的方法可以采用常规的化学方法，如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。
2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后，通过转染和转座等过程，腺病毒基因组会产生复制和转录。
最终，腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒，从而完成腺病毒载体的构建。
3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。
以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍：•基因治疗：腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。
通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中，可以恢复或增强正常基因的功能，从而治疗相关疾病。
•疫苗开发：腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。
深圳市盎然生物科技有限公司-miRNALab-腺病毒载体构建与包装
腺病毒载体构建与包装
腺病毒是一种双链DNA病毒，长约36kb，衣壳呈规则的20面体结构。
由于腺病毒具有宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、高滴度制备、外源基因装载容量大等优点，重组腺病毒载体已广泛地被应用于基础研究和临床试验中。
盎然生物提供的腺病毒系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架，在克隆、包装、扩增等方面做了改进和优化，达到了克隆阳性率更高、质量更可靠、包装稳定、产毒迅速、滴度高等效果。
所包装的腺病毒已成功应用于信号转导，基因转位，Co-IP，动物实验，干细胞研究等科研实验。
系统优势
(1) 包装容量大-包装容量可以达到6 kb；
(2) 宿主范围广-可以广泛感染分裂和非分裂的哺乳动物细胞；
(3) 病毒滴度高-病毒活性滴度可达到1 x 10^11 pfu/ml；
(4) 病毒可扩增-包装好的病毒可以在293a细胞系中进行扩增.
腺病毒包装腺病毒表达载体
腺病毒包装
详见“服务——病毒”栏目。
腺病毒表达载体
shRNA、miRNA、重组蛋白的腺病毒表达载体。
腺病毒载体的构建
第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1腺病毒载体的构建由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达水平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定高表达。
SOCS2高表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因子和脂质代谢基因表达发生了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过一种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续高表达。
细胞导入外源基因是目前常用的方法，但是保证外源基因的高效表达需要合适的表达系统。
目前常用的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导入外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把目标基因导入靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把目标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本身对脂肪细胞的感染率又比较低。
而腺病毒滴度高，适合外源基因大量表达，并且可插入较大的目的片段，对细胞类型限制较小，可感染非分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作比较简单(Luo JY et al. 2007)。
本章克隆SOCS2基因，采用pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中高效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取自6周龄昆白小鼠，小鼠购自第四军医大；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌肉发育实验室赠送；人胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中心。
4.1.2 主要试剂限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋白Marker购自Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购自NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购自Takara公司；穿梭质粒小提试剂盒购自Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购自天根公司；OptiMem优化培养液购自Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购自Invitrogen公司。
腺病毒载体构建原理与方法的研究进展
作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒学研究所病毒形态研究室#综述#腺病毒载体构建原理与方法的研究进展何金生王健伟洪涛由于腺病毒(Adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐,成为当今使用最多的病毒载体之一。
为了取得更满意的效果,人们在腺病毒载体构建与改进方面,做了大量工作。
本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下。
1腺病毒载体的构建原理腺病毒的基因组为线形双链DNA,长度约为36kb,被包装在一个二十面体的蛋白质外壳内,可分为编码区和非编码区。
编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种,前者有E1、E2、E3、E4四个区,编码病毒的调节蛋白,后者有L1、L2、L3、L4、L5五个区,编码病毒的结构蛋白。
非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
除E3区外,其余的编码区及顺式作用元件均为病毒复制所必需。
第1代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和P或E3两个区而获得,其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的293细胞中完成。
其主要优点为:在体外有很高的繁殖滴度(1011~1012PFU P ml);易感的宿主细胞范围广,既能感染增殖细胞,又能感染非增殖细胞;病毒基因组存在于细胞染色体外,避免了因整合引起的细胞突变。
但由于病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列。
在293细胞中繁殖时,通过重组,可重新获得E1区,出现复制型腺病毒(Replication-competent Ads, RCAs),这使得第1代腺病毒载体的应用受到限制112。
此外,由于发现在多种转化及原代的细胞内存在具有Ela样活性(Ela-like activity)的物质,因而E1区缺失的腺病毒载体在这些细胞内,仍能进行Ela非依赖性的腺病毒DNA复制,并从头合成病毒的早期和晚期蛋白,激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫,使载体在体内的持续时间以及再次应用均受到极大影响122。
大鼠miR-1慢病毒表达载体的构建与鉴定
与 慢 病 毒 辅 助 包装 质 粒 及 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｆ ｅ ｃ ｔ ａ ｍｉ ｎ ｅ ２ ０ ０ ０共 转 染 ２ ９ ３ Ｔ 细胞 ， 产 生 慢 病 毒 浓 缩 液 并 标 定 病 毒 滴 度 。 重 组 慢 病 毒 载体转染大鼠骨髓 间充质 干 细胞 （ ＭＳ Ｃ ｓ ） ， 观 察 转 染 效 率 及 ｍｉ Ｒ ＿ １ 表 达 水 平 。 结 果 测 序 结 果 显 示 目的 基 因 与 Ｇｅ ｎ ｅ ｂ ａ ｎ ｋ序 列 完全 一 致 ； 孔 稀 释 法 检 测 病 毒 滴度 为 ３ ×１ ０ Ｔ Ｕ／ ｕ Ｌ； 以感染复数 （ Ｍ０Ｉ ） ５ Ｏ感 染 大 鼠 ＭＳ Ｃ ｓ ， 感 染 效 率达 ９ Ｏ 以上 ， 聚 合 酶 链 反 应 显 示 ｍｉ Ｒ 一 １高 水 平 表 达 。结 论 成 功 构 建 大 鼠 ｍｉ Ｒ 一 １慢 病 毒 表 达 载 体 并 可 高效 转 染
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腺病毒载体构建(共10张PPT)
பைடு நூலகம்
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它通过 受体介导的内吞作用进入(jìnrù)细胞内，然后腺病毒基 因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入 (jìnrù)宿主细胞基因组中.
第三第页三页，，共共101页0。页。
腺病毒的基因(jīyīn)及其功能
二早期、表小达的的穿E梭1区质蛋粒腺白，（病其甚带至毒有包括基目E的2因区基蛋因组白的编）表是达码腺盒病数以毒及十基(因y个ǐ组jí)复表腺制达、病盒病两毒毒侧包的的装与和结大其构质他蛋粒和白上表功的达目能翻的译蛋基所因必白拟须，插的，入分但部其位为对同细早源胞序期毒列性表（(dú左达x右ìn和ɡ臂)也）晚是很期强表的。达。
二、小的穿梭质粒，其带有 目的基因的表达盒以及(yǐjí) 表达盒两侧的与大质粒上的 目的基因拟插入部位同源序 列（左右臂）
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AdEasy腺病毒载体(zàitǐ)系统
稳定性 高
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
体内表达周期可早达期4表周。达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的 载体。 表达。
体内表达周期可达4周。
它 组 早期通中表.过达受的必体E须1介区早的导蛋期，的白表但（内达甚其吞的至作对包E用细1括进区胞E入2蛋毒区(j白性蛋ìnr白（(ùd)）ú甚细是x胞至ì腺n内包ɡ病)，括也毒然E基是后2因很区腺组强蛋病复的白制毒。、）基病因是毒组腺包转病装移毒和至其基细他因胞蛋组核白复内表制达，翻、保译病持所在毒必染包须色装的体和，外但其，其他不对蛋细整白胞合表毒进性达入(d(翻júìn译xrìùn所)ɡ宿)也主是细很胞强基的因。
人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达
人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达作者：韩增胜李健高大威李青旺来源：《湖北农业科学》2008年第06期(燕山大学环化学院生物技术与工程系，河北秦皇岛066004)摘要：将人乳铁蛋白基因与腺病毒基因组骨架质粒重组，在293细胞中包装重组腺病毒颗粒，获得真核细胞表达的载体pAd－hLTF｡以pcDNA3X为模板，PCR扩增hLTF基因，腺病毒穿梭载体pshuttle－cmv与hLTF重组为pshuttle－cmv－hLTF；再与腺病毒骨架质粒pAdEasy－1同源重组为pAd－hLTF质粒；脂质体法将重组pAd－hLTF质粒转染HEK 293细胞，包装成重组腺病毒颗粒｡Western blot和ELISA法测定细胞中hLTF基因的表达｡结果表明，pAd－hLTF质粒转染293细胞后，7～10 d后，获得细胞裂解液，将细胞裂解产物再次接种新鲜的293细胞，3～5 d后，80%以上的细胞变圆､膨胀､漂浮｡Western blot和ELISA结果显示，上清液中有hLTF基因的表达，为重组人乳铁蛋白的体外表达及其功能分析奠定了基础｡关键词：重组人乳铁蛋白；腺病毒载体；重组蛋白质中图分类号：Q513+．2；S852．65+9．1；Q782文献标识码：A文章编号：0439－8114(2008)06－0629－04Construction of Human Lactoferrin Gene Recombinant Adenoviruses and Expression in Eukaryotic CellsHAN Zeng－sheng，LI Jian，GAO Da－wei，LI Qing－wang(Department of Biological Engineering，College of Environment & Chemical Engineering，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei，China)Abstract： To construct the recombinant adenoviral vectors containing human lactoferrin gene，the recombinant adenoviruseswas obtained and expressed the recombinant protein in eukaryotic cells． The human lactoferrin gene was amplified from plasmid pcDNA3X； the gene of interest which contained hLTF gene was cloned into the pshuttle－cmv vector． The resulted vector was named pshuttle－cmv－hltf that was linearized by digesting with restriction endonuclease PmeI， andsubsequently cotransformed into Escherichia coli BJ5183 cells with an adenoviral backbone vector pAdEasy－1； Homologous recombinants were performed in bacterial cells． Finally， the linearized backbone adenoviral vector was transfected into the packaging cells lines HEK 293 cells by lipofectamine 2000 transfection reagents． The expression of human lactoferrin in cells was investigated by Western blot and ELISA methods． After the transfection， seven to ten days later，the cells lyses were collected and added into the separate 293 cells． The cells become roundness，swell and floats． Western blot and ELISA results showed the high expressed human lactoferrin in the cells． These results shown that human lactoferrin gene recombinant adenoviral backbone vector had been constructed successfully． The recombinant adenoviruses pAd－hLTF had been produced by packaging in 293 cells． This study could provide the possibility of further researches on the high －level expression of recombinant proteins．Key words： recombinant human lactoferrin； adenoviral vectors； recombinant protein人乳铁蛋白(human lactoferrin，hLTF)是主要存在于初乳中的一种结合性糖蛋白，由于乳铁蛋白具有许多独特的生物学功能，如广谱的抗菌性及免疫作用､抗氧化作用､抗炎症､抗病毒､抗癌症作用等[1]生物学功能，近年来成为国内外研究的热点｡目前人乳铁蛋白已在多种基因表达系统中获得成功表达，如乳腺[2]､烟草[3]､昆虫[4]､酵母[5]等系统中均表达了hLTF重组蛋白｡但上述表达系统均存在一些缺陷，如转基因乳腺表达需要特异启动子，以及制作转基因动物效率低､成本高，且烟草和酵母基因表达系统所得重组真核蛋白存在生物活性不高和不易纯化的缺点｡为此，有必要探索新的重组人乳铁蛋白的高效表达方法｡腺病毒载体表达系统是近年来应用于人类基因治疗中最为广泛的真核载体表达系统之一｡由于腺病毒载体本身具有安全性好和转基因效率高的优点，被广泛应用于真核基因的表达和癌症的基因治疗中[6]，本研究构建了含有人乳铁蛋白的腺病毒载体，并进行了重组人乳铁蛋白腺病毒在细胞中的表达试验，以期获得可以高效表达的重组人乳铁蛋白腺病毒颗粒，为重组人乳铁蛋白的体外高效表达奠定了基础，也可为其他重组蛋白质的高效表达提供一定的参考｡1材料与方法1．1细胞､菌株及培养HEK 293(人胚胎肾细胞系)来自于中国医学科学院细胞中心，Escherichia coli BJ5183菌株由张智英先生惠赠｡293细胞培养于DMEM基础培养基中添加100 U·mL－1双抗(青霉素100，000 U·mL－1+链霉素100，000 U·mL－1)､1%非必需氨基酸(NAA)(Gibco)､10%胎牛血清(FBS，Hyclone)｡37℃，5% CO2培养箱｡1．2主要试剂限制性内切酶､DNA连接酶､Taq DNA聚合酶等工具酶类均来自大连宝生物工程有限公司；人乳铁蛋白ELISA试剂盒购自美国USBiological公司；脂质体lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；人乳铁蛋白单克隆抗体购自Sigma公司｡1．3重组穿梭载体的构建含有人乳铁蛋白基因的pcDNA3X质粒由我们实验室克隆保存，分别以Kpn I/Xho I消化后，接入以同样酶Kpn I/Xho I消化的pshuttle－cmv载体，获得阳性重组子后，命名为pshuttle －cmv－hltf，并送往上海英俊公司进行测序｡经测序以及限制性内切酶消化重组质粒pshuttle－cmv－hltf鉴定正确后，将其转化DH5α感受态细胞，进行大量扩增，碱裂解法抽提质粒并纯化备用｡1．4腺病毒载体的构建将pshuttle－cmv－hlTF质粒以Pme I酶消化使其线性化，利用PCR产物纯化试剂盒纯化线性化质粒pshuttle－cmv－hlTF，腺病毒骨架质粒pAdEasy－1和线性化质粒pshuttle－cmv－hlTF共转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组，限制性内切酶鉴定重组腺病毒载体pAd－LTF｡1．5重组腺病毒的包装将酶切鉴定正确的重组腺病毒载体pAd－LTF进行Pac I酶切消化，胶回收试剂盒回收约33kb大小的片段，将该大片段以脂质体法转染293细胞，转染4 h后，细胞换成完全培养基培养，即DMEM基础培养基中添加10% FBS，37℃，5%CO2培养箱｡每日观察细胞，记录细胞生长状态｡转染7～10 d后，细胞会出现变圆和脱落等现象，小心收集细胞及上清，将细胞反复冻融3次(分别置于液氮和37℃水浴)，离心后获得上清液，即为病毒的初级产物，于－70℃贮存，或直接用于下一步病毒扩增试验｡1．6重组病毒的扩增与鉴定将病毒初级产物接种于细胞生长汇合率为50%～70%的293细胞，感染3～5d后，根据细胞脱落状况判断收获病毒时间，若细胞90%以上出现飘落时，立即收集细胞及上清，同样，将细胞反复冻融3次，最终获得病毒的扩增产物｡而后，取细胞上清液10 μL，加入蛋白酶K，于50℃孵育1 h，离心后取上清为模版，分别进行PCR鉴定｡以hLTF特异引物进行PCR扩增，可获得约2．2kb的目标片段，引物分别为：F11—GGTCTATATAAGCAGAGCTG；R12—CTGATCATAATCAGCCATACCAC｡以腺病毒基因组和hLTF的结合处设计引物，可获得约1．2kb的目标片段，引物分别为：F21—ATTTCAGTCAAAGCTGTGCCCCTG；R22—CTCAGGAAAGCAAAGTCAGTCAC｡1．7重组腺病毒的细胞表达将鉴定正确的pAd－LTF重组腺病毒接种293细胞，感染48 h后，取上清分别进行Western blot和ELISA分析，以检测人乳铁蛋白在细胞中的表达效果｡2结果与分析2．1重组穿梭载体的鉴定将重组的阳性质粒pShuttle－hLTF进行3种不同限制性内切酶分析，所获琼脂糖电泳大小片段与预期的完全一致(图1)｡经送往测序公司的结果分析，所测序列与国际GENEBANK上AY875691和AY178998登录的人乳铁蛋白序列基本一致｡上述结果表明，已正确获得了人乳铁蛋白基因克隆，并已完成了腺病毒穿梭载体的构建｡并可用于下一步重组腺病毒载体的构建｡2．2重组腺病毒载体pAd－hLTF的鉴定利用AdEasy腺病毒骨架系统，在BJ5183细菌内同源重组而获得的腺病毒载体，用PacI 酶切后将会出现3．0kb大小的特异条带，分别以pAdEasy－1质粒为空白对照，同时用PacI消化pAd－hLTF和pAdEasy－1质粒，仅在pAd－hLTF消化产物中出现了约3．0kb大小的特征性小条带(图2)｡证明已成功构建获得重组人乳铁蛋白腺病毒载体pAd－hLTF｡由于重组质粒大于30kb，所以用1%的琼脂糖电泳时大片段容易跑不出，出现部分质粒停留在泳道口的现象，但这不影响结果分析｡2．3重组腺病毒载体转染293细胞结果利用阳离子脂质体法，将PacI消化的pAd－hLTF载体转染293细胞，转染4h后，若在显微镜下看到细胞形状稍有变化，则立即取出脂质体，更换培养基为完全培养基｡继续培养7～10 d后，可看到细胞有明显的变化，主要表现为细胞肿胀､容易脱落和漂浮于培养液中｡待到80%细胞出现上述现象后，收集细胞和上清液，同时进行PCR鉴定初级病毒产物｡分别使用了2对引物进行PCR鉴定，琼脂糖电泳分别获得2．2kb和1．2kb两条片段，结果与预期完全一致(图3)｡2．4pAd－hLTF在细胞中的表达将鉴定正确的pAd－hLTF用于进一步的细胞表达试验，分别于不同接种密度的细胞培养皿中加入pAd－hLTF病毒，于48 h后，开始检测细胞上清中hLTF的表达，以兔抗人乳铁蛋白单克隆抗体为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗兔免疫球蛋白为二抗，Western blot杂交试验结果显示，在约80kD处有一条特异的蛋白条带，与人乳铁蛋白标准品条带一致，表明pAd－hLTF载体在细胞里获得了正确表达(图4)｡同时，利用人乳铁蛋白酶联免疫检测试剂盒(USBiological，USA)，对细胞上清进行了检测，酶标仪450 nm处读数，阴性对照孔值平均0．064 1，阳性标准品对照孔值平均0．235，上清液样品孔值平均为0．243，表明上清液中有较高水平的重组人乳铁蛋白的表达｡3讨论在基因工程技术中，重组蛋白质的表达一直以来是人们所研究的热点之一，特别是随着人类基因组计划的完成，大量的人源性基因急需表达，以便研究其结构和功能｡本研究以人乳铁蛋白为目标基因，成功构建了重组腺病毒载体pAd－hLTF，并在细胞里获得了重组人乳铁蛋白的较高水平的表达｡另外，以腺病毒为载体，我们实验室同时做了人生长激素基因､人红细胞生成素基因和神经生长因子等基因的细胞表达，均获得了重组基因的表达｡由此可揭示出，重组腺病毒表达系统可用于其他真核基因的体外快速表达和鉴定｡构建腺病毒载体的主要思路是删除其早期基因(主要是E1A和E3A)的部分或全部，使外源基因能够通过同源重组的方式进入病毒基因的框架[6]｡外源基因主要进入E1区，因为E1区是病毒复制所必需的，缺失E1区的腺病毒可以在反式提供E1区编码产物的细胞系中，如HEK 293细胞系中复制｡而E3区的缺失主要是为了扩大病毒的包装容量｡本研究中采用pAdEasy腺病毒载体系统，通过细菌同源重组产生腺病毒载体的方法[7]，该方法是利用重组酶缺陷型大肠杆菌(如BJ5183，recBCsbcBC)高效的同源重组机制得以实现的｡该法中的腺病毒骨架质粒包含全长病毒序列(或E3区缺陷)，且末端带有PacI酶切位点(8bp 内切酶识别序列)､氨苄青霉素抗性基因和质粒复制区｡穿梭质粒包含病毒基因组左侧区序列ITR序列､病毒包装信号序列及与E1区下游的一段同源序列｡首先，将构建含有目标基因的穿梭质粒，然后与病毒载体两个质粒载体共转化于recBCsbcBC型大肠杆菌(BJ5183)，挑取单菌落获得阳性重组质粒，经过限制性酶切分析，正确的重组子再转染HEK 293细胞，从而获得重组腺病毒｡该方法可以最大程度避免野生型腺病毒的产生，所以重组成功率较高[6，7]｡另外，细菌内重组的方法无需进行繁琐的病毒空斑化筛选，因而省时省力｡因此，通过本试验pAd－hLTF的成功构建，可为人乳铁蛋白腺病毒载体的构建以及其他重组腺病毒载体的构建提供一定的依据｡参考文献：[1]LONNERDAL B， IYER S． Lactoferrin： molecular structure and biologicalfunction[J]． Annu Rev Nutr，1995，15：93－110．[2]VAN BERKEL P H， WELLING M M， GEERTS M， et al． Large－scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows[J]． Nat Biotechnol，2002，20：484－487．[3]MATRAA， ZHANG Z Y． Expression of human lactoferrin cDNA in tobacco cells produces antibacterial protein [J]． Plant Physiol， 1994，106：977－981．[4]张大兵，姜育蕾，吴祥甫，等．人乳铁蛋白基因在昆虫细胞中的表达[J]．生物化学与生物物理学报，1998，30：57－59．[5]LIANG Q， RICHARDSON T． Expression and characterized of human lactoferrinin yeast Saccharomyces cerevisiae[J]． J Agric Food Chem， 1993，41：1800－1807．[6]RUSSELL W C． Update on adenovirus and its vectors [J]． Journal of General Virology，2000， 81： 2573－2604．SOUZA D W， ARMENTANO D． Novel cloning method for recombinant adenovirus construction in Escherichia coli [J]． Biotechniques， 1999，26：502－508．。
过表达慢病毒载体介导miR-1转染L6细胞增殖分化及组蛋白去乙酰化酶的表达
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2019)13-02075-06 2075www.CRTER .org·研究原著·弓贺炜，男，1986年生，山西省晋中市人，汉族，硕士，主要从事骨科手显微外科研究。
通讯作者：刘承伟，硕士，主任医师，贵州省骨科医院骨外三病区，贵州省贵阳市 550007文献标识码:B稿件接受：2019-01-12Gong Hewei, Master, Third Ward of Orthopedics, Guizhou Orthopedic Hospital, Guiyang 550007, Guizhou Province, ChinaCorresponding author: Liu Chengwei, Master, Chief physician, Third Ward of Orthopedics, Guizhou Orthopedic Hospital, Guiyang 550007, Guizhou Province, China过表达慢病毒载体介导miR-1转染L6细胞增殖分化及 组蛋白去乙酰化酶的表达弓贺炜1，刘承伟1，梁炳生2，李 刚2 (1贵州省骨科医院骨外三病区，贵州省贵阳市 550007；2山西医科大学第二医院骨科显微手外科组，山西省太原市 030001)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1680 ORCID: 0000-0002-3625-9132(弓贺炜)文章快速阅读：文题释义：miR-1：微小RNA(MicroRNA ，miRNA ，miR)是一类长度约为22 个核苷酸(nt)的非编码小分子RNA ，在正常细胞中普遍存在，其在基因转录后水平抑制mRNA 的翻译或直接降解mRNA ，实现基因调控。
miRNA 在正常心肌与骨骼肌中均有表达，在骨骼肌中还存在组织特异性miRNA ，如miR-1、miR-133及miR-206。
人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达活性
人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达活性【关键词】内皮抑素腺病毒基因治疗抗血管治疗乳腺癌0 引言近年来，阻止肿瘤血管生成，控制肿瘤的生长和转移，成为肿瘤治疗的一项新策略［1，2］，其中采用转染血管生成抑制剂拮抗血管的生成，以内皮抑素最为理想［3］。
本文通过构建人内皮抑素基因的腺病毒表达载体，研究内皮抑素在乳腺癌细胞中的表达，为进一步研究乳腺癌的抗血管基因治疗做好准备。
1 材料与方法1.1 材料携带人内皮抑素基因（human endostatin,hE）的质粒pBlast hEndostatin购于美国InvitroGen公司；腺病毒载体pCA13、pBGHE3及293细胞株购于Microbix Biosystems公司；人乳腺癌细胞株MBD 231和MCF7、人脐静脉内皮细胞株ECV304购于美国ATCC 细胞库；LipofectAMINE2000转染试剂盒购自GibcoBRL公司；各种限制性内切酶和DNA连接酶购自NEB公司；QIAprep spin miniprepkit、QIAamp DNA Blood Mini Kit购自QIAGEN公司；MPER Mammalian Protein Extraction Reagent购自PIERCE公司；Western显色液LumiGLO chemiluminescent reagent and peroxide为Cell Signaling Technology公司产品；鼠抗人hE单克隆抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自武汉博士德公司；携带报告基因LacZ的增殖缺陷型腺病毒Ad LacZ由东方肝胆外科医院病毒与基因治疗研究室保存。
1.2 腺病毒载体质粒pAd hE的构建根据GenBank AF184060基因序列（555bp），在hE基因上下游分别设计引物，上游引物P1: 5’CGGAATTCACCATGCACAGCCACCGC3’, 下游引物P2: 5’GCTCTAGATTACTACTTGGAGGCAGT3’。
Ad-IRE1α腺病毒载体的构建及对软骨细胞分化与凋亡的效应研究的开题报告
Ad-IRE1α腺病毒载体的构建及对软骨细胞分化与凋亡的效应研究的开题报告题目：Ad-IRE1α腺病毒载体的构建及对软骨细胞分化与凋亡的效应研究研究背景及意义：软骨组织是一种特殊的结缔组织，具有一定的韧性和弹性，在机体内具有很重要的功能，如支持身体结构、吸收冲击力、减轻摩擦等。
但软骨缺乏血管和神经的供应，且细胞数量较少，修复能力较差，因此软骨损伤的治疗一直是一个难题。
最近的研究表明，内质网应激（ER stress）与软骨细胞的分化和凋亡密切相关。
IRE1α作为内质网应激信号通路中最重要的分子之一，在细胞凋亡和分化过程中具有重要作用。
因此，研究IRE1α信号通路在软骨细胞分化和凋亡中的作用，对于开发软骨组织再生治疗策略具有重要的理论和实际意义。
本研究拟通过构建Ad-IRE1α腺病毒载体，实现IRE1α的特异性表达，进一步研究IRE1α在软骨细胞分化和凋亡中的作用，以期为软骨组织再生治疗策略的开发提供新的思路和实验依据。
研究内容及方法：1.构建Ad-IRE1α腺病毒载体。
采用腺病毒载体设计软件，设计IRE1α基因的重组腺病毒载体，采用常规的腺病毒包装技术，构建Ad-IRE1α腺病毒载体。
2.体外软骨细胞培养。
从小鼠软骨中分离并培养软骨细胞。
用不同浓度的Ad-IRE1α腺病毒感染软骨细胞，分别培养24h、48h和72h，采用Western blotting检测IRE1α的表达情况，并进一步观察IRE1α表达对软骨细胞的形态学改变和细胞增殖的影响。
3.研究IRE1α在软骨细胞分化和凋亡中的作用机制。
对不同浓度的Ad-IRE1α腺病毒感染的软骨细胞进行Alcian blue染色和碱性磷酸酶染色，检测软骨细胞分化的能力，同时采用TUNEL检测IRE1α表达对软骨细胞凋亡的影响。
预期效果：本研究将构建IRE1α基因的重组腺病毒载体，实现IRE1α的特异性表达，进一步研究IRE1α在软骨细胞分化和凋亡中的作用。
重组MIF腺病毒载体的构建、包装与纯化及其意义
重组MIF腺病毒载体的构建、包装与纯化及其意义蓝海兵;罗亮;齐协飞;龚园其;陈玉【摘要】Objective To construct a recombinant adenovirus vector containing (Macrophage migration inhibitory factor,MIF) and identify the function of the Ad-MIF. Methods Amplify MIF gene plasmid with molecular biological technique. Identify the success of MIF gene plasmid amplification with gel electrophoresis,sequencing and Western Blot technique. Amplify MIF gene with PCR technology,then recombinate gene to adenovirus vector and prepared for adenovirus packaging. Amplify virus in HEK293 cells,After 3 cycles of amplification,the titer of adenovirus containing MIF reached an appropriate level. and The protein expressed in the infected human airway smooth muscle cells significantly increased. Results It is correct when identify the MIF gene plasmid using gel electrophoresis,sequencing and Western Blot technique.The the virus titre was 2E+9PFU/ml. Conclusions The successful construction of the recombinant adenovirus containing MIF,which provides an experimental basis for the basic re-search of MIF gene therapy on asthma.%目的：采用分子生物学技术构建人巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）基因腺病毒表达载体，检测AD-MIF腺病毒转染人气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cell，ASMC）后蛋白表达。
微型腺病毒载体的扩增和纯化研究（论文）
文章编号:0427-7104(2001D 05-0525-05微型腺病毒载体的扩增和纯化研究邰艳红1 2 王飞1 王琪1 卢大儒1 郑尊2 薛京伦1(1.复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室 上海200433;2.第二军医大学基础部细胞生物学教研室 上海200433D 摘要:微型腺病毒(mAd D 是去除所有编码基因 仅保留两侧反向末端重复序列(ITR D 及包装信号(I D 的新型腺病毒载体.它具有包装容量大 免疫原性小等优点.在大量扩增时 需与缺失E 1区及包装信号的辅助腺病毒共转染入包装细胞(293细胞D 内 S 1超离心纯化 将二者分开.再通过琼脂糖覆盖挑斑~在包装细胞内大量扩增~S 1超离心纯化等步骤 最终得到较为纯净的mAd .但因mAd 结构不稳定 易与辅助病毒发生同源重组 在S 1超离心时不能完全与辅助病毒分开 导致外源基因表达逐步下降.关键词:微型腺病毒;扩增;纯化中图分类号:G 39;R 554文献标识码:A腺病毒(AdenoviruS Ad D 因其滴度高~易于制备~转染效率高等优点 现已成为仅次于反转录病毒载体的应用最广泛的一类病毒载体[1].然而 由于腺病毒基因本身转录的病毒蛋白会诱导宿主产生细胞免疫及体液免疫 最终导致外源基因不能长期稳定地表达 且造成二次注射失败[2];目前常用的腺病毒载体(AdV D 包装容量小(约8kb D 不能容纳大片断外源基因.为了提供腺病毒载体的包装容量 降低腺病毒载体的免疫原性 提高外源基因的表达时间及可重复注射的目的 腺病毒载体的结构一直在不断的被改进[3*5].我们尝试构建去除所有病毒编码基因 仅保留两侧反向末端重复序列(ITR D 及包装信号(I D 共500bp 左右的微型腺病毒载体(mini -Ad mAd D 介导凝血F X 基因及绿色荧光蛋白报告基因(GFP D 进行大量扩增~纯化~离体及活体表达检测.由于微型腺病毒缺失所有结构蛋白基因 仅保留复制及包装所必需的顺式结构 在其大量扩增时 就必须与辅助腺病毒(E 1区缺失D 一同转入包装细胞(含腺病毒的E 1区片断D 为其提供复制及包装所需的蛋白.因此 在大量扩增2种病毒混合液后 mAd 的分离纯化是一个关键问题.本文就微型腺病毒载体的大量扩增及纯化作了初步的尝试 为其下一步的外源基因表达打下基础.1材料和方法1.1细胞系及腺病毒混合液293细胞为含有Ad 5的E 1区并持续表达E 1A 及E 1B 功能蛋白的人胚肾细胞系 由加拿大哥伦比亚大学A .Ama1Sitano 赠送;含凝血F X 基因及GFP 报告基因的微型腺病毒(mAdcFIX ;mAd D 和含B -ga1报告基因的辅助腺病毒(Ad~B D 由美国Baxter 公司张维维博士构建 由本实验室负责扩增及纯化.RSF 细胞(兔成纤维细胞系D 购自美国AT 公司.1.2mad 和adHB 混合斑(6D 的制备将高糖DMEM +10%F S (体积分数D 加入在6孔板培养的293细胞中至细胞50%铺满 改用含2%525第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究 收稿日期:2000-12-07基金项目:国家 863'项目(863-Z 20-02-01D ;国家自然科学基金(39880019D ;国家教育部优秀青年教师基金;教育部博士点基金(98024620D ;霍英东基金;全国优秀博士论文基金;教育部跨世纪人才基金资助作者简介:邰艳红(1970 D 女 医学硕士.625复旦学报(自然科学版D第40卷FCS的高糖DMEM培养基加入20pL mAd及AdHB混合液转染6h后倒去培养液.将加热的12g/L 琼脂糖与加温的2>DMEM液等量混匀调温至42C取2mL混合液轻轻地加入培养孔中室温冷却凝培养箱中.在转染第3天~第5天如法覆盖.第5~7天挑取含mAdcFIX与AdHB的混合病结后转至CO2毒颗粒的半透明空斑20个分别加入0.5mL Tris-HCl(0.01mol/mL pH=8.1D中反复吹打经37C和-80C(各5min D中冻融3次~3000r/min(4C10min D离心后留上清得到20个初次重组腺病毒斑的粗提液.用上述粗提液分别转染293细胞用琼脂糖覆盖~挑半透明感染空斑20个3次冻融和离心得到1 mL含混合腺病毒颗粒的粗提液.各取300pL粗提液转染293细胞.当观察到部分细胞有CPE反应(细胞毒性效应D时收集含混合腺病毒的293细胞用荧光显微镜和X-gal染色鉴定并筛选出荧光反应强~X-gal染色阳性率适中的克隆.1.3mad的大量扩增将首代鉴定的mAd粗提液感染在6孔板中培养的293细胞用含2%(体积分数D小牛血清的DMEM培养待90%的293细胞出现CPE反应时收集细胞~离心(3000r/min4C10min D;取沉淀细胞用0.01mol/L Tris-HCl(pH8.1D复悬(在约5>106细胞中加入0.3mL Tris-HCl液D经37C和-80 C(各5min D中冻融3次;冻融液离心取上清液为mAd粗提液.以同样方法大量扩增病毒粗提液-20 C保存;待收集培养的293-mAd细胞达150瓶(以100mL的培养瓶计算D一同超离心纯化.在每次收集病毒粗提液后取0.1mL感染105贴壁生长的RSF细胞6h后在492nm波长激发光下用荧光显微镜观察报告基因GFP的表达同时做X-gal染色.确保mAd的转染和包装良好.1.4mad的CSCI超离心纯化[3]共进行连续2次CsCl梯度超离心,在11.5mL的CsCl超离心管中依次加入0.5mL的1.5g/mL CsCl 2.5mL的1.35g/mL CsCl和2.5mL的1.25g/mL CsCl在CsCl液面上缓慢加入mAd及AdHB 5.5mL用石蜡油封顶并配平.离心条件为8150kg(S 41离心机STS型转头D1h.离心后抽取1.35 g/mL和1.25g/mL CsCl之间的单一病毒带.将抽取的病毒液与1.35g/mL CsCl按1:5混匀加入11. 5mL离心管内离心条件为8150kg18h.2条病毒带分别位于距管底2.7cm 3.5cm处.分别抽取至透析盒中用PBS透析3次(每次透析液3000mL D第4次透析液采用10%(体积分数D甘油-PBS每次2 ~3h;纯化产物分装于-20C暂时保存备用.1.5二种病毒的浓度测定取纯化的腺病毒颗粒5pL加120~125pL第4次透析液(PBS+10%(体积分数D甘油D混匀以第4次透析液为空白对照紫外分光光度计(波长260nm D比色根据D(260D值计算Ad颗粒数(mL-1D,即D(260D>稀释倍数>1012.1.6mad的纯度检测将2种病毒纯化液分别加入到70%融合的培养RSF细胞的6孔板内(102particles/cell D6h后在492nm激发光下以荧光显微镜观察一孔细胞的GFP表达另一孔细胞用4%(体积分数D多聚甲醛固定10min X-gal染色4h后再在荧光显微镜下观察GFP的表达同时在普通光学显微镜下观察B-gal的表达情况计算表达报告基因的细胞所占比例.2结果2.1GFP表达的稳定性检测在进行mAd大量扩增的过程中为了使得到的mAd始终保持较高活力我们对每一代扩增的病毒粗提液都进行报告基因GFP的表达检测发现GFP的表达很不稳定其中第1代mAd中GFP表达的细胞约占100%而到第5代降为60%到7代以后降到30%以下(图1所示D.图1mAd 扩增后RSF 细胞GFP 的表达情况Fig .1The expreSSion of GFP in RSF cellS after mAd S amplification .A .第一代;.第五代;C .第七代;D .未感染腺病毒的RSF 细胞.GFP 位于核周(-)2.2mad 的超离心纯化及浓度测定通过连续2次CSCl 梯度超离心 最终在1.35g /mL 和1.25g /mL CSCl 之间得到2条界限不明显的病毒宽带 分别抽取2条病毒带(上方为浮密度小的mAd 距管底3.5cm 下方为浮密度大的Ad~B 距管底2.7cm 测D (26O) 计算病毒颗粒含量 mAd 为2.3>1O 11mL -1;Ad~B 为4.5>1O 11mL -1.2.3mad 的纯度检测感染mAd 组的RSF 细胞在荧光显微镜下可见表达GFP 的细胞占83% X -gal 染色后仅见极少蓝染细胞;感染Ad~B 组RSF 细胞在荧光显微镜下可见GFP 表达占23% X -gal 染色后蓝染细胞占97%(图2所示) 而未感染腺病毒的对照组未见荧光及蓝染(未显示).图2mAd 的纯度检测Fig .2The detection of mAd S purity .A .感染mAd 的RSF 细胞GFP 表达(-);.感染mAd 的RSF 细胞的GFP 表达(Y )及X -gal 染色(-);C .感染Ad~B 的RSF 细胞后GFP 表达(-);D .感染Ad~B 的RSF 细胞的GFP 表达(Y )及X -gal 染色(-)3讨论本实验通过大量扩增~CSCl 超离心纯化 成功地得到了颗粒含量较高且较为纯净的mAd 纯化液.其携带的报告基因GFP 的表达检测证明 mAd 介导外源基因可以在离体培养细胞内较高水平地表达 但同时也发现 mAd 感染的细胞中偶尔也可检测出B -gal 的表达 即mAd 中掺杂有约1%的Ad~B .这种现象应从微型腺病毒载体系统本身的结构分析(图3 此图为本室自制):(1)mAd 缺失所有结构基因 仅保留725第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究500bp 左右的顺式结构,它与野生型腺病毒的结构差异性最大,因此其结构的稳定性也最差,因此,Ad~B 的包装能力远大于mAd ,造成Ad~B 的优先包装(3D .(2D 由于mAd 的结构特点,在复制及包装时,必需有Ad~B 与其共转染293细胞(内含E 1区片断D 为其提供反式补偿.(3D mAd 与Ad~B 及293细胞内E 1区之间存在一定的同源序列.在一定条件下可发生同源重组而产生新的病毒(3,7D .由于以上三种原因,使扩增mAd 过程中产生大量重组病毒,其长度介于mAd 与Ad~B 之间.这样就导致mAd 携带的报告基因的逐步丢失,随扩增代数的增加,GFP 表达下降.而且在CSCI 超离心纯化时2种病毒带界限不清或形成宽带,造成分离的困难.因此在大量制备mAd 时,应注意仅保留扩增的前几代病毒,尽量减少同源重组的机会.尽管目前仅有几个实验室在进行微型腺病毒的研究,腺病毒的同源重组问题仍然引起了极大的关注,并尝试了各种解决的方法.除尝试不同的CSCI 超离心条件外,ParkS 等[8~11]在辅助型腺病毒的包装信号两侧插入IoXP 位点后,与mAd 共转染入293Cre (持续表达Cre 重组酶的293细胞D 细胞中扩增,这样可以通过同源重组将IoXP 位点之间的包装信号缺失,并保证辅助型腺病毒结构的稳定性,有效减少了辅助病毒与mAd 及包装细胞之间的同源重组,同时也降低了辅助病毒的包装效率,氯化铯梯度超离心后,辅助病毒的污染率明显降低.但并未从根本上将2种病毒完全分开.因此,要完全将2种病毒分开,从而得到高纯度的mAd ,除进一步摸索最佳的实验条件外,最根本的手段是进一步改进微型腺病毒载体系统本身的结构,增加其结构稳定性,最大限度地降低同源重组的发生.图3介导F X 的微型腺病毒载体系统简图Fig .3The SimpIe deScription of mAd vector Which mediateS factor XCA :CMV 人actin 启动子9EF :人延长因子启动子参考文献:[1]候云德.分子病毒学[M ].北京:学苑出版社,1990.151-180.[2]Piedra P A ,Poveda G A ,RamSey B .Incidence and prevaIence of neutraIizing antibodieS to commonadenoviruSeS in chiIdren With cyStic fibroSiS :ImpIication for gene therapy With adenoviruS vectorS [J ].PeClCtllCS ,1998,lol(6D :1013-1019.[3]AIemany R ,Dai Yi -fan ,Yan Chun -Iou ,et Cl .CompIementation of heIper -dependent adenoviraI vector :Size effectS and titer fIuctuationS [J ].J vllol meth ,1997,68:147-159.[4]Moorhead J M ,CIayton G ~,Smith R L .A repIication -incompetent adenoviruS vector With thepreterminaI protein gene deIeted efficientIy tranSduceS mouSe earS [J ].J vllol ,1999,73(2D :1046-1053.825复旦学报(自然科学版D 第40卷[5]Morsy M A*Gu M C*Motzel S*et al.An adenoviral vector deleted for all viral coding seguences resultsin enhanced safety and extended expression of a leptin transgene[J].P1oc Natl Acac Sci*1998*95:7866-7871.[6]Kochanek S*Clemens P R*Mitani K*et al.Anew adenoviral vector:Replacement of all viral codingseguences with28kb independently expressing both full-length dystrophin and B-galactosidase[J].P1oc Natl Acac Sci*1996*93:5731-5736.[7]Lochmuller~*Jani A*~uaro J*et al.Emergence of early region1-containing replication-competentadenovirus in stocks of replication defective adenovirus recombinants(A E1A E3)during multiple passages in293cells[J].Pum Gene the1*1994*5:1485-1491.[8]Parks R J*Chen L*Anton M*et al.A helper-dependent adenovirus vector system:Removal of helpervirus by Cre-mediated excision of the viral packaging singal[J].P1oc Natl Acac Sci*1996*93:13565-13570.[9]Schiedner G*Morral N*Parks R J*et al.Genomic DNA transfer with a high-capacity adenovirusvector results in improved in UiUo gene expression[J].Natu1e Genet*1998*18:180-183.[10]~aecker S E*~ansell~*Stedman~*et al.Ln UiUo expression of full-length human 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novel adenoviral vector that contains only the viral inverted terminal repeat seguences(I T R)*packaging signal and ci S-acting elements reguired for viral DNA replication and packaging.MAd vector has larger capacity and lower immunogenicity*which showed its proprietary prospect in the field of gene therapy.F or amplification of mAd vector*the cells must be co-transfected with mAd and helper Ad that deleted E1region and packaging signal for packaging cells.T hrough plague assay*amplification and propagation*the density of purified mAd was2.3>1011mL-1.~owever*mAd genome was found unstable and with1%contamination of helper Ad.T he amplification and purification of mAd were discussed.Keywords:Mini-Adenovirus;amplification;purification 925第5期邰艳红等:微型腺病毒载体的扩增和纯化研究微型腺病毒载体的扩增和纯化研究作者：邰艳红， 王飞， 王琪， 卢大儒， 郑尊， 薛京伦作者单位：邰艳红(复旦大学生命科学学院遗传学研究所;第二军医大学基础部细胞生物学教研室)，王飞,王琪,卢大儒,薛京伦(复旦大学生命科学学院遗传学研究所)， 郑尊(第二军医大学基础部细胞生物学教研室)刊名：复旦学报(自然科学版)英文刊名：JOURNAL OF FUDAN UNIVERSITY年，卷(期)：2001,40(5)1.候云德分子病毒学 19902.Piedra P A;Poveda G A;Ramsey B Incidence and prevalenc e of neutralizing antibodies to common adenoviruses in children with cystic fibrosis:Implication for gene therapy with adenovirus vectors [外文期刊] 1998(06)3.Alemany R;Dai Yi-fan;Yan Chun-lou Complementation of helper-dependent adenoviral vector: Size effects and titer fluctuations 19974.Moorhead J M;Clayton G H;Smith R L A replication-incompetent adenovirus vector with the preterminal protein gene deleted efficiently transduc es mouse ears[外文期刊] 1999(02)5.Morsy M A;Gu M C;Motzel S An adenovi ral vector deleted for all viral coding sequences resultsin enhanced safety and extended expression of a leptin transgene[外文期刊] 1998(14)6.Kochanek S;Clemens P R;Mitani K Anew adenoviral vect or:Replacement of all viral coding sequences with 28 kb independently expressing both full-length dystrophin and β-galactosidase 19967.Lochmuller H;Jani A;Huaro J Emergence of early regio n 1-containing replication-competent adenovirus in stocks of replication defec 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1999(11)引用本文格式：邰艳红.王飞.王琪.卢大儒.郑尊.薛京伦微型腺病毒载体的扩增和纯化研究[期刊论文]-复旦学报(自然科学版) 2001(5)。
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南 昌大 学 学报 （ 医学 版 ）２ １ ０ ０年第 ５ Ｏ卷第 ８期
Ｊｕ ｎｌ ｆ ｎｈ ｎ ｉｅｓ ｙ Ｍｅ ｉ ｌ ｃ ｎｅ ０ ０ Ｖｏ． ０Ｎｏ ８ ｏ ｒ ａ ｏ ｃ ａｇＵｎｖ ｒｉ （ ｄｃ ｉ ｃ）２ １ ， １５ ． Ｎａ ｔ ａＳ ｅ
ｍｉ 一 Ｒ １腺病 毒 载体 的构 建Fra bibliotek 表 达分 析
在 Ｂ ５ ８ 菌 中进 行 同 源 重 组 。 重 组 质 粒 ｐ ｄ ｐ ｅ ｕ ｏ － Ｒ １线 性 化 后 ，转 染 ２ ３ 细 胞 ， 行 病 毒 包 装 ， 到 重 Ｊ１３ Ａ — ｒｃ ｓ ｒ ｍｉ 一 ９Ａ 进 得 组 腺 病 毒 颗 粒 Ａｄｍｉ － 。Ａｄ ｍｉ 一 ～ Ｒ１ — Ｒ １与 ＡｄＧＦ — Ｐ病 毒 转 染 培 养 的乳 鼠心 肌 细 胞 ， 过 实 时 荧 光 定 量 Ｐ Ｒ 方 法 检 测 通 Ｃ
３ Ｄｅ ａ ｔ ｎ Ｊ Ｐ ｙ ｉｌｇ ｔ ｅ ｅｏ ｄ Ｍ ｉｉ ｒ ｄｃ ｌＵｎｖ ｒｉ ． ｐ ｒｍｅ ｔ ’ ｈ ｓｏｏ ｙ， ｃ ｎ ｌｔ ｙ Ｍｅ ｉ ｉｅｓｔ ｏ ｈ Ｓ ａ ａ ｙ，Ｓ ａ ｇ ａ ０ ４ ３， ｈ ｎ ） ｈ ｎ ｈ ｉ２ ０ ３ Ｃ ｉａ ＡＢ ＴＲＡＣ Ｓ Ｔ：Ｏｂｅ ｔｖ Ｔｏ ｃ ｎ ｔｕ ｔａ ｄ ｉ ｅ ｔｆ ｅ ｒ—ｎ ｉｈ ｄ ｍｉｒ ＲＮＡｓａ ｅ ｏ ｉｕ ｅ ｔ ｒ ｊ ｃｉｅ ｏ ｓｒ ｃ ｎ ｄ ｎ ｉｙ ｈ ａ ｔｅ ｒｃ ｅ ｃ ｏ ｄ ｎ ｖｒ ｓｖ ｃｏ
许旭 东 宋 晓伟 李 ， ， 青 林 ， 丽。袁 文俊 。 荆 ， ， 清 ， 永文 秦 （． １ 第二 军 医大 学长海 医 院心血 管 内科 ， 海 ２ ０ ３ ； 上 ０ ４ ３
２ 中国科 学院上海 生命科 学研 究院健康 科 学研 究所 ， ． 上海 ２ ０ ２ ； ０ ０ ５
ｃ ｎｔ ｉ ｎ ｉ １ ｏ ａｎｉ ｇ ｍ Ｒ一 ｐｒ ｃ ｓ ｇ ｎ ．Ｍ ｅｈｏ ｓ Ｔ ｈ ｐ ｉ ｅ ｓ ｏｆ ｍ ｉ １ ｒ ｃ ｒ ｏ ａ ｄ ｓｇｎ ｄ ｎ ｅ ｕｒ ｏｒ ｅ ｅ ｔ ｄ ｅ ｒｍ ｒ Ｒ一 ｐ ｅ ｕ ｓ ｒ ｗ ｓ ｅ ｉ ｅ ａ ｄ
关键 词 ： 心肌细胞 ； 腺病毒 ； ｉ ｏ Ｎ ｓ ｍ Ｒ１ ｍ ｃ Ｒ Ａ ； ｉ一 ｒ 中 图 分 类 号 ：Ｒ ４． ５２２ 文献标 志码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ００ ２９ （０００—００—０ １０ － ２４２１）８ ０１ ３
Ｅｓ ａ ｌｓ ｍ ｅ ｔ ａ ｄ Ｅｘ ｅ ｓｏ ａ ｙ ｉ ｆ ｔ ｂ ｉｈ ｎ ｎ ｐｒ ｓ ｉ ｎ Ａｎ ｌ ｓｓ ｏ ｍ ｉ １ Ａｄｅ ｏ ｉ ｕ ｃ ｏ Ｒ－ ｎ ｖ ｒ ｓ Ｖｅ ｔ ｒ
３ 第 二 军 医 大 学 生理 学教 研 室 ， 海 ２ ０ ３ ） ． 上 ０ ４ ３ 摘 要 ：目的 构建并鉴 定 ｍｃ Ｒ Ａ１ｍＲ １ ｉｏ Ｎ ～（ ｉ一）的腺病毒表达 载体 。方法 ｒ Ｐ Ｒ扩增 含大 鼠 ｍ Ｒ１ Ｃ ｉ－ 前体 的 Ｄ Ａ Ｎ
片 断 ， 将 其 克 隆 到 腺 病 毒 穿 梭 质 粒 ｐ ｄ ａｋ Ａｄ ａｋ经 Ｐ ｅＩ 切 线 性 化 后 与 腺 病 毒 骨 架 质 粒 ｐ Ｅ ｓ— 并 Ａ Ｔｒｃ 。ｐ Ｔｒｃ ｎ ｉ 酶 Ａｄ ａｙｉ
ｕ ｅ ｏ ＰＣＲ ａ ｐ ｉ ｃ ｔｏ ｓｄ ｆｒ ｍ ｌｆ ａ ｉ ｎ．Ｔｈ ｐｒ ｄ ｔ ｗｅ ｅ ｈ ｎ ｌ ｎｅ ｉ ｔ ａ ｎｏ ｒ ｓ ｈｕ ｔｅ ｌ ｓ ｄ ｔ ｅ ｏ ｕｃ ｓ ｒ ｔ ｅ ｃｏ ｄ ｎ ｏ ｄｅ ｖｉｕ ｓ ｔ ｌ ｐ ａ ｍｉ ＰＡｄ ａ ｋ ａ ｉ ａ ｉｅ ｅ ｖ ｅ Ｐｍｅ Ｉ ｈｅ ｒ ｓ ｌａ ｌ ｓ ｉ ｓ ｃ — ｒ ｎｓ ｅ ｔ ｄ ｉ ｔ ｃ ｌ Ｔｒ ｃ ｎｄ ｌｎｅ ｒｚ ｄ ｂｖ ｎｚ ｍ ；ｔ ｅ ｕ ｔ ｎｔ ｐ ａ ｍ ｄ ｗａ ｏ ｔ ａ ｆ ｃ ｅ ｎ ｏ Ｅ ｏ ｉ
ｍｉ一 的 表 达 效 率 。结 果 基 因 测 序 及 酶 切 鉴 定 证 实 重 组 Ａｄｐｅｕ ｓｒ Ｒ １ 病 毒 载 体 构 建 成 功 ； 病 毒 Ａｄ Ｒ１ —ｒｃ ｒｏ－ 一 腺 ｍｉ 腺 —
ｍｉ— Ｒ ｌ转染 心 肌 细胞 后 ， 时 荧 光 定 量 Ｐ Ｒ方 法 证 实 腺 病 毒 Ａｄｍｉ一 够 显 著 提 高 心 肌 细 胞 内 ｍｉ — 表 达 水 实 Ｃ — Ｒ １能 Ｒ Ｉ的 平。结论 利 用 同 源 重 组 的 方 法 构 建 的 ｍｉ一 腺 病 毒 能 够 提 高 心 肌 细 胞 内 ｍｉ一 的 表 达 水 平 。 Ｒ１ Ｒ１