鲎相关防御性蛋白的研究进展

鲎相关防御性蛋白的研究进展顾劲松，于江，顾威，闫润虎大连医科大学美容医学院，大连（116027）E-mail：pinegu@摘要：目的介绍近10年来国内外对鲎抗菌抗内毒素蛋白的研究进展。

方法查阅近10年国内外相关文献，总结归纳从鲎体内纯化的各种抗菌抗内毒素蛋白的结构和生物活性。

结果较为全面地叙述了鲎的先天防御体系以及从其体内提取纯化的抗内毒素因子、各种外源凝集素和C反应蛋白的结构特征和抗菌抗内毒素的生物活性，指出了该类生物蛋白在抗菌抗内毒素药物开发应用中的重要价值。

结论鲎体内多种抗菌抗内毒素蛋白具有中和内毒素和杀菌抑菌的高效生物活性，可以作为理想的药物先导化合物进行深入开发研究。

它们的结构也为基于结构的新型药物设计合成提供了丰富的数据资料。

关键词：鲎，抗菌蛋白，抗内毒素蛋白，结构，生物活性脓毒症休克的发病率和死亡率极高，仅美国每年就约有10万人死于脓毒症及其相关严重病理改变，且尚无特殊药物可治［１］。

革兰阴性细菌内毒素(LPS)是脓毒症休克发生的主要介质［２］。

LPS血症和前炎症介质的释放在ICU病人高死亡率和多器官功能衰竭的发生中起着重要作用［３］。

因此LPS所致疾病的防治研究一直是国际医药学界研究最为活跃的领域之一。

研制高亲和力、能中和细菌LPS的药物是当今世界医学领域研究的重点［４］。

本文就鲎抗菌抗LPS 蛋白及相关防御性蛋白的研究进展做一综述。

1. 鲎先天防御体系的认识鲎，亦称王蟹，是一种从古生代的三叶虫演化而来的低等无脊椎海洋动物，在动物学分类上隶属于节肢动物门（Arfhropoda），有螯肢亚门（Chelicerata），肢口纲（Merostomata），剑尾目（Xiphosura）。

鲎的种属很少，目前全世界仅存三属4种［５］，分别为：⑴. 美洲鲎(Limulus polyphemus Linnaeus)，分布在北美西海岸。

⑵.东方鲎(Tachypleuss tridentatus leach)，分布在中国、日本、菲律宾等地。

⑶.巨鲎(Tachypleuss gigas muller)，分布在泰国、印度尼西亚等地。

⑷.园尾鲎 (Carcinoscorpius rotundi cauda pocock)，分布马来半岛、印尼等地。

分布在我国沿海一带的鲎，都属于同一种，取名为中国鲎。

从1955年美国动物学家F.Bang发现细菌LPS使鲎血凝固的现象至今50余年来，科学家对鲎展开了全面系统的研究。

鲎的蓝色血液中有一个对病原体和外来物质非常敏感的复杂防御体系。

正是这种复杂的防御体系使缺乏获得性免疫的鲎得以在地球上生存200 万年至今，并被冠以“活化石”之称。

由三种丝氨酸蛋白水解酶原（C因子、B因子、前凝血酶）及一种可凝蛋白（凝结蛋白原）构成的凝血系统受LPS激活形成不溶性凝胶。

凝血系统也通过独特的异二聚体丝氨酸蛋白水解酶原（G因子）的激活对真菌表面普遍存在的β1，3葡聚糖作出反应。

因此，病原体被凝胶封闭，随后被具有各种特异性的抗菌物质杀灭。

实际上，鲎的血液凝集就是其对入侵物的一种防御反应，但这不是它唯一的防御机制，许多凝集素既存在于血淋巴浆，也存在于变形细胞中。

淋巴浆对外来细胞也具溶解作用。

循环于血淋巴中的唯一细胞成分——变形细胞能探测入侵微生物及其LPS分子痕迹量，并迅速做出反应，释放出各种颗粒成分到外周环境。

鲎的变形细胞含有两种颗粒［6］，即大颗粒和小颗粒。

这些颗粒成分通过胞外分泌释放，对入侵微生物作出反应。

近来分子生物学和免疫学对大小颗粒成分的研究表明，两种颗粒成分选择性地储存特异性颗粒蛋白，它们参与了宿主的防御反应。

大颗粒含有所有血淋巴凝集所必需的凝血因子、蛋白酶抑制物，包括serpins,cystatin,LALF(鲎抗LPS因子)和几种与LPS结合并带有细菌粘着活性的快速植物血凝素。

小颗粒则含有各种各样富含半胱氨酸、具有细菌粘着活性的碱性蛋白，如快速植物血凝素、防御素、tachycitin和 tachystatins。

颗粒中的这些蛋白的共区域化和它们释放进入血淋巴提示，它们协同性地构建了鲎的防御体系。

这些细胞和体液防御协同地保护鲎免受外来有机体的入侵［7］。

2. 鲎抗菌抗LPS蛋白－鲎抗LPS因子2.1鲎抗LPS因子的结构美洲鲎（Limulus polyphemus）抗LPS因子（LALF）的全部氨基酸序列已通过氨基末端序列和用赖氨酰肽链内切酶、梭菌蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8 蛋白酶消化这种蛋白质后产生的多种肽得以确定［8］。

通过自动Edman法，根据这些肽的序列获得了一级结构。

LALF 是一个含101个氨基酸残基的单一多肽链的碱性蛋白质，分子量约为11786Da或11800Da。

在产生这种蛋白质典型的两性分子特征的二硫键环中呈现出疏水的氨基末端序列和阳性电荷集簇。

LALF是变形细胞中的丝氨酸蛋白水解酶，它与LPS结合区位于36-45之间的氨基酸残基，由两个折叠构成，它们在顶部形成一个发夹环，在底部与一个二硫键相连，形成一个跨越8－10个氨基酸的最小LPS结合位点。

Carl等［9］认为LALF的功能区位于第28－54氨基酸残基之间，并根据此功能区合成了LALF28-54的合成肽，通过一系列体内外活性检测并与多粘菌素B比较，认为LALF28-54在体外和多粘菌素B一样具有强大的杀菌和中和LPS活性。

尽管LALF28-54和LALF一样抑制了细胞因子的产生，加速了细菌的清除率，但它对LPS攻击动物无明显的保护作用。

Hoess等［２］认为LALF的抗菌抗LPS活性功能区位于第31－52氨基酸残基之间。

据此，Maribel等［１0、１1］合成了LALF衍化肽LALF31-52，通过一系列生物活性检测发现，LALF31-52不仅能有效中和LPS，用它刺激后的人单核细胞悬浮物通过IFN-γ和 IFN-α介导可在体外对多代鸡胚Hep-2细胞系诱导出抗病毒作用。

通过LPS刺激的腹膜巨噬细胞分析LALF31-52对TNF 和氧化氮产物的作用揭示，用这种肽预处理可降低TNF产物，但却不影响氧化氮的产生。

这表明，LALF修饰了LPS诱导的反应。

在鼠暴发性腹膜脓毒症模型中，当预防性给药后，LALF31-52保护了小鼠，这种作用与降低了全身的TNF水平有关。

他们通过G－菌腹膜脓毒症模型检测这种肽的作用并分析了用这种肽处理后的小鼠肝、脾组织细胞因子表达。

用LALF31-52预处理改善了全身性的TNFα反应，减少了器官损害，增加了感染小鼠的生存率。

组织学检查发现，这种肽防止了大剂量绿脓杆菌诱导的组织损伤，并调节细胞因子在这些组织的表达，刺激IL-2, IL-12 和 IL-13 mRNA的合成。

另外，在全身性炎症反应开始后给予这种肽治疗也有效，显著增加了感染小鼠的生存率。

东方鲎（Tachypleuss tridentatus）抗LPS因子（TALF）是一个由102个氨基酸构成的蛋白质［１2］, 阳性电荷残基主要集中于二硫键环区。

在17个带阳性电荷氨基酸残基中，8个位于由22个氨基酸残基构成的二硫键环区，在Leu-42和Lys-50之间，这些阳性电荷残基每隔两个间断排列。

此外，在Arg-62和Arg-77之间也发现5个阳性电荷残基。

如果从Leu-42－Lys-50及Arg-61－Arg-76间的区域各自形成β片层和α螺旋，这些阳性电荷就会在该蛋白质分子的同一侧形成集簇。

这两个阳性电荷集簇可能与LPS的阴性电荷区，特别是LPS的磷酸基团发生相互作用。

这个特点可能对表达这种分子的LPS结合活性具有重要意义。

另外，TALF还可能通过氨基末端的疏水区域与类脂A部分结合。

通过以TALF序列为基础的重叠合成肽结合和中和LPS能力分析，认为TALF 41－53是结合LPS最小的序列；TALF29-59具有与LPS结合最大潜能；TALF29-59减少了LPS诱导鲎变形细胞溶解物的凝集；削弱诱导人单核细胞细胞因子，且降低了LPS诱导的致敏小鼠的死亡率［１2］。

分布于我国沿海的中国鲎也统称为东方鲎（Tachypleuss tridentatus leach），有学者采用分子克隆技术已获得了编码中国鲎的cDNA，并将此基因序列投入GenBank，加入号为AF227150。

且首次在幼蚕体内用昆虫杆状病毒表达系统获得了重组中国鲎抗LPS因子（rTALF），通过体外LPS中和及抑菌试验检测，rTALF显示了良好的抑菌及中和LPS活性［１3］。

福建医科大学也从我国鲎血细胞中成功分离纯化了中国鲎抗LPS因子，也具有中和LPS活性，但其活性较美洲鲎和日本鲎活性低［１4］。

2.2 鲎抗LPS因子的生物活性LALF具有强大而广泛的生物学活性，它不仅能杀灭G－菌，且能中和LPS［２］。

它高亲和性地以剂量依赖方式结合LPS并封闭其生物学活性。

用半致死量大肠杆菌LPS腹膜内处理小鼠［１5、１6］，在处理后的各时间段给予LALF，在LPS处理后4h、10h甚至24h后给予LALF，小鼠72h生存率得到显著改善，分别为73％、78％、65％和对照组的15％。

LPS处理后10h或24h后静脉给予LALF，具有生物活性的LPS血浆水平突然下降，LPS水平仅为处理前的1/1000。

可见，LALF显著降低血浆活性LPS浓度，且避免了小鼠死亡，甚至是在持续LPS血症发作之后再给予LALF。

有人［２］通过体外抗铜绿色假单孢菌和抑制LPS诱导的TNFα分泌测定LALF杀菌和中和LPS能力，结果显示，LALF具有与多粘菌属B（PmB）相当的杀菌和LPS中和活性（P<0.01）。

还有报道［１7］，LALF可抑制脑膜炎双球菌LPS诱导的鲎变形细胞溶解物的凝胶化作用。

用10％致死量（10mg.kg-1）的LPS 在体外预先与LALF混合后处理的兔比单纯用LPS处理的兔具有较高水平的平均动脉压、动脉血Ph及重碳酸盐浓度，生存率前者为90％，后者为8％（P=0.005）。

用LALF 处理后动物循环LPS 活性及TNF浓度也显著降低。

因此，LALF削弱了兔脑膜炎球菌LPS的毒性作用。

TALF也具有与细菌LPS结合的极高亲和性，且在无数的试验中均可阻断其生物活性［１2］。

3. 鲎其他防御性蛋白3.1 外源凝集素系统发生学上，古老的宿主防御系统是以具有胚系编码的防御分子识别病原微生物的先天免疫为基础的。

这种免疫发现于所有的多细胞有机体。

尽管脊椎动物拥有了获得性免疫，但宿主的这种获得性免疫需要相关病原体的足够信息，而这些信息就由宿主的先天免疫系统来提供。

先天免疫系统能识别特殊的碳水化合物形式，这种化合物形式对感染微生物来说是独特的或必须的。

外源凝集素样效应器蛋白是脊椎动物和无脊椎动物先天免疫的必须成分。

因此，先天免疫并未废弃，而是有助于获得性免疫的第一道防御机制。