G25脱盐柱使用指南课件
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葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结 构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富 于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网 眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼， 小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼 的物质分子则不能，故称为“分子筛”。 小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并 随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动， 从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒 的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝
胶
柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢； 大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不 能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶 颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、 流速快，比小分子先流出层析柱；小分 子最后流出。分子大小介于完全排阻不 能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质 分子，则居中流出。这样被分离物质即 被按分子的大小分开。
层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物理化学性 质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲 和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为 固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为 流动相）体系中的分布程度不同，从而使各组分 以不同的速度移动而达到分离的目的。
如盐析（粗分级分离）向蛋白质 溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4， Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白质脱去水化 层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。
可见，不同类型的各种凝胶溶涨所需 的最少时间是不相同的，请参考有关的技 术数据。 在凝胶溶涨的处理过程中，不能进行 剧烈搅拌，禁止使用电磁搅拌器，以为这 样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片。
2. 装柱
将层析剂装入柱中进行层析的方法称 柱层析法。 作层析用的柱子称层析柱。 柱子的一 端为进口，另一端为出口，出口端底部有 烧结玻璃砂板 ，能阻止层析剂流出，溶剂 则可流过。 层析柱的长短粗细根据实验的 目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长， 分离效果越好。但柱过长，层析时间长， 样品易稀释造成扩散。
G25脱盐柱使用指南PPT精选文档
10
Storage Store unused media 4°C to 30°C in 20% ethanol. Do not freeze. Wash used media with 2 column volumes of distilled water followed by 2 column volumes of 20% ethanol. Store at 4°C to 30°C. Alternatively, wash with 2 column volumes of distilled water followed by 2 column volumes 0.01 M NaOH. Sodium hydroxide solution is bacteriostatic, easily disposed of and does not shrink the medium. Degas the ethanol/water mixture thoroughly and use a low flow rate, checking the back pressure as the column equilibrates. Avoid changes in temperature which may cause air bubbles in the packing.
Desalting column protocol
Mr. Yu Wang
1
• Matrix Sephadex™ G-25 Fine, cross-linked dextran • Bed volume 53 ml • Bed height 100 mm • i.d. 26 mm • separation of high (Mr > 5 000) from low molecular
Storage Store unused media 4°C to 30°C in 20% ethanol. Do not freeze. Wash used media with 2 column volumes of distilled water followed by 2 column volumes of 20% ethanol. Store at 4°C to 30°C. Alternatively, wash with 2 column volumes of distilled water followed by 2 column volumes 0.01 M NaOH. Sodium hydroxide solution is bacteriostatic, easily disposed of and does not shrink the medium. Degas the ethanol/water mixture thoroughly and use a low flow rate, checking the back pressure as the column equilibrates. Avoid changes in temperature which may cause air bubbles in the packing.
Desalting column protocol
Mr. Yu Wang
1
• Matrix Sephadex™ G-25 Fine, cross-linked dextran • Bed volume 53 ml • Bed height 100 mm • i.d. 26 mm • separation of high (Mr > 5 000) from low molecular
G25脱盐柱使用的指南
Storage Store unused media 4°C to 30°C in 20% ethanol. Do not freeze. Wash used media with 2 column volumes of distilled water followed by 2 column volumes of 20% ethanol. Store at 4°C to 30°C. wash with 2 column volumes of distilled water followed by 2 column volumes 0.01 M NaOH. Sodium hydroxide solution is bacteriostatic, easily disposed of and does not shrink the medium. Degas the ethanol/water mixture thoroughly and use a low flow rate, checking the back pressure as the column equilibrates. Avoid changes in temperature which may cause air bubbles in the packing.
pH 7.0 • Flow rate: 20 ml/min at room temperature • Sample volume: 15 ml • Separations: Elute the column with 106 ml (2 CV) of
buffer
• Equilibration is not necessary between runs with the same buffer.
色谱柱使用及维护ppt课件
柱填料：色谱柱担体，常用的填料为硅胶、多孔聚 合物、氧化铝等
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
硅胶填料的特性
优点
优良的物理特性 可控的成熟工艺 理想的表面活性 优良的溶剂兼容性（不存在不溶胀）
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
实验室常用色谱柱：C8柱、C18柱、氰基柱、苯基柱、 氨基柱、手性柱、离子交换柱
不同色谱柱的选择依据 色谱柱的结构 良好的色谱柱使用习惯及维护 建立方法时应注意的事项 色谱柱失效的特征指示
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 目
可能原因： a)填料丢失，多见于酸性物质 ，换柱 b) 溶剂效应，采用流动相溶解样品
解决方法： 换柱 采用流动相溶解 增加缓冲盐的浓度，抑制次保留效应 提高柱温，加快传质速率
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
产生次保留效应的因素--离子交换效应 离子交换效应：质子化的碱性分子与离子化的硅羟
基发生离子交换产生次级保留效应
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
硅胶填料的特性
优点
优良的物理特性 可控的成熟工艺 理想的表面活性 优良的溶剂兼容性（不存在不溶胀）
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
实验室常用色谱柱：C8柱、C18柱、氰基柱、苯基柱、 氨基柱、手性柱、离子交换柱
不同色谱柱的选择依据 色谱柱的结构 良好的色谱柱使用习惯及维护 建立方法时应注意的事项 色谱柱失效的特征指示
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 目
可能原因： a)填料丢失，多见于酸性物质 ，换柱 b) 溶剂效应，采用流动相溶解样品
解决方法： 换柱 采用流动相溶解 增加缓冲盐的浓度，抑制次保留效应 提高柱温，加快传质速率
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
产生次保留效应的因素--离子交换效应 离子交换效应：质子化的碱性分子与离子化的硅羟
基发生离子交换产生次级保留效应
认识到了贫困户贫困的根本原因，才 能开始 对症下 药，然 后药到 病除。 近年来 国家对 扶贫工 作高度 重视， 已经展 开了“ 精准扶 贫”项 目
葡聚糖凝胶G-25的使用方法
产品筑.明=葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1) 预处理称取Sephadex G-25 (50 —100 目)约5g，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h进行溶胀。
⑵装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。
柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝(约200目尼龙布)垫底或购买类似规格的商品柱。
然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。
同时大开下口慢速流出蒸馏水。
装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。
否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡 2 —3h即可加样品分离。
⑶加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐(或留一极薄液层)为止。
然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2 —3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。
(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。
本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8 — 1.0ml/mi n 。
洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ,共收集10管。
据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。
但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。
(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。
若使用数次，就需要再生处理。
用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCI 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。
若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95% 乙醇洗两次，在60 C烘箱中烘干，回收保存。
实验五 . 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1. 掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
G25脱盐纯化柱 BP003-1
寡核苷酸的储存
长期保存DNA，可储存于TE缓冲液中，并于-20℃保存。
注意事项
缓冲液：期望将物质置换到的缓冲液 洗脱时可以用ddH2O或者TE(10 mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)。如果长期保存 D研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
试剂
TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA ，pH 8.0
操作步骤
柱子的准备 柱平衡：用缓冲液平衡脱盐柱，5-10 CV。
纯化步骤 1.上样：最大样品量可达 30%柱体积； 2.洗脱：使缓冲液通过G25脱盐柱，所有的样品物质都应在一个柱体积之内洗脱出来； 3.清洗：常用的清洗液为 0.2 M NaOH 或非离子型去垢剂。可用一倍的柱体积清洗。
版本号：BP003-1
G25 脱盐纯化柱
G-25脱盐纯化柱介质是一类以葡聚糖为基质的凝胶过滤层析介质，其工作原理主要是 利用具有网状结构的葡聚糖凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离。 层析时，大于凝胶孔径的大分子，被阻于凝胶相外，沿着凝胶颗粒之间的间隙走，下 移速度最快，故最先洗脱下来，中分子物质部份进入凝胶内部，洗脱速度为其次，而小分 子物质因全部进入凝胶，受到阻力最大，故最后被洗脱下来，如此物质得到分离。
长期保存DNA，可储存于TE缓冲液中，并于-20℃保存。
注意事项
缓冲液：期望将物质置换到的缓冲液 洗脱时可以用ddH2O或者TE(10 mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)。如果长期保存 D研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
试剂
TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA ，pH 8.0
操作步骤
柱子的准备 柱平衡：用缓冲液平衡脱盐柱，5-10 CV。
纯化步骤 1.上样：最大样品量可达 30%柱体积； 2.洗脱：使缓冲液通过G25脱盐柱，所有的样品物质都应在一个柱体积之内洗脱出来； 3.清洗：常用的清洗液为 0.2 M NaOH 或非离子型去垢剂。可用一倍的柱体积清洗。
版本号：BP003-1
G25 脱盐纯化柱
G-25脱盐纯化柱介质是一类以葡聚糖为基质的凝胶过滤层析介质，其工作原理主要是 利用具有网状结构的葡聚糖凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离。 层析时，大于凝胶孔径的大分子，被阻于凝胶相外，沿着凝胶颗粒之间的间隙走，下 移速度最快，故最先洗脱下来，中分子物质部份进入凝胶内部，洗脱速度为其次，而小分 子物质因全部进入凝胶，受到阻力最大，故最后被洗脱下来，如此物质得到分离。
葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结
G –25 G-50 G-75 G-100
6 6 24 48
2 2 3 5
1000~5000 1500~30000 3000~70000 4000~1500000
目前多用“热法”溶涨，这样可大大 加速溶涨平衡，通常1—2h即可完成。 “热法”溶涨还可以消毒，杀灭凝胶中污 染的细菌，同时也排除了凝胶内的汽泡。
一实验目的1掌握葡聚糖凝胶柱层析法脱盐分离蛋白质的原理2学会葡聚糖凝胶柱层析法脱盐和分离蛋白质实验操作技术凝胶过滤层析技术二基本原理当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时根据它们分子大小不同而进行分离的技术
葡聚糖凝胶Sephadex G – 25柱 层析法脱盐分离蛋白析法也称色谱法，是1906年俄国植物学 家Michael等发现并命名的。他将植物叶子的色 素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的 速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名 为“色谱法”（Chromatography) 。后来无色 物质也可利用吸附柱层析分离。1944年出现纸层 析， 以后层析法不断发展，相继出现气相层析、 高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析 等。
6. 检测
在收集的同时，用 20%磺酰水扬酸检 测；加入奈氏试剂检测蛋白质中的硫酸铵， 蛋白管中不出现棕色。 合并纯化后的蛋白质管以待用。以光密 度值为纵坐标（紫外检测，因时间长） ，以 收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图。 可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线， 用以表示被分离物质流出的状态。
在凝胶层析中，不仅要保持静水压的 恒定，还要保持适当的静水压。这是因为 G–75以上的软胶胶体柔软易变形， 最初 流速会很快，其后随着静水压力过大将使 软胶变形压紧，流速逐渐降低，最后甚至 流不出。 保持恒定正确的静水压是凝胶层 析时获得满意结果的必要条件。 脱盐一般使用的是G–25属于硬胶，硬 胶不易变形，受静水压的影响较小。
凝胶过滤中的脱盐柱的使用
廖红军
是一种由限制分子通过多孔基质，按分子大小 分离混合分子的技术；
凝胶过滤主要可以用在两个领域：1、组群分离， 根据大小的范围将样品的成分分成两个主要组 群，主要应用于除去样品中高分子量或低分子 量污染物（如细胞培养液中酚红）、脱盐或更 换Buffer；2、生物分子高分辨组分的收集（根 据生物分子的分子量差距进行分离）；
Sephadex G-25有粗、中、细、超细四种不同 颗粒大小可选择；
颗粒越小分辨率越高，但流速也越慢；
样品在粒径粗的介质中更容易扩散，所以 SephadexG-25 Coarse (粗) 的上样量在四种介 质中最少；
粗颗粒介质流速快，Sephadex G-25 Coarse 在 每个单位时间、单位柱床体积所纯化的产品， 即生产率最高；
Sephadex在所有常用的缓冲体系中稳定， 以及添加剂，如离子和非离子去污剂、变性 剂（8M尿素或6M盐酸胍）；
在短链醇类中稳定，如乙醇、甲醇、丙醇， 但是超过25%浓度不经常使用；
注意： Sephadex在醇类中填料会收缩；
一般保存在4~25 ℃20%乙醇中，不要冰冻， 或者0.01M NaOH中， NaOH是抑菌的，该溶 液非常好去除，而且填料不会收缩。
不同生产规模的天然生物制品及基因工程产品 生产工艺中使用Sephadex G-25介质的例子有 很多。
包括植物中抽提的过敏源蛋白、血浆蛋白、奶 中的乳清蛋白、交细胞培养单抗、重组过氧化 物歧化酶、重组肿瘤坏死因子、基因工程乙肝 疫苗等。源自处理的样品体积由数百毫升至近千升不等。
度的变化与温度有关； 柱高：10cm；
一般生物大分子的分子量比盐等小分子大许多 倍，用凝胶过滤方法为生物产品脱盐十分简单、 可靠；
层析方法可透过紫外和电导检测器监控整个层 析脱盐的过程、产品的纯度和回收率，又可以 连续自动进样和收集，自动化程度高，容易放 大；
是一种由限制分子通过多孔基质，按分子大小 分离混合分子的技术；
凝胶过滤主要可以用在两个领域：1、组群分离， 根据大小的范围将样品的成分分成两个主要组 群，主要应用于除去样品中高分子量或低分子 量污染物（如细胞培养液中酚红）、脱盐或更 换Buffer；2、生物分子高分辨组分的收集（根 据生物分子的分子量差距进行分离）；
Sephadex G-25有粗、中、细、超细四种不同 颗粒大小可选择；
颗粒越小分辨率越高，但流速也越慢；
样品在粒径粗的介质中更容易扩散，所以 SephadexG-25 Coarse (粗) 的上样量在四种介 质中最少；
粗颗粒介质流速快，Sephadex G-25 Coarse 在 每个单位时间、单位柱床体积所纯化的产品， 即生产率最高；
Sephadex在所有常用的缓冲体系中稳定， 以及添加剂，如离子和非离子去污剂、变性 剂（8M尿素或6M盐酸胍）；
在短链醇类中稳定，如乙醇、甲醇、丙醇， 但是超过25%浓度不经常使用；
注意： Sephadex在醇类中填料会收缩；
一般保存在4~25 ℃20%乙醇中，不要冰冻， 或者0.01M NaOH中， NaOH是抑菌的，该溶 液非常好去除，而且填料不会收缩。
不同生产规模的天然生物制品及基因工程产品 生产工艺中使用Sephadex G-25介质的例子有 很多。
包括植物中抽提的过敏源蛋白、血浆蛋白、奶 中的乳清蛋白、交细胞培养单抗、重组过氧化 物歧化酶、重组肿瘤坏死因子、基因工程乙肝 疫苗等。源自处理的样品体积由数百毫升至近千升不等。
度的变化与温度有关； 柱高：10cm；
一般生物大分子的分子量比盐等小分子大许多 倍，用凝胶过滤方法为生物产品脱盐十分简单、 可靠；
层析方法可透过紫外和电导检测器监控整个层 析脱盐的过程、产品的纯度和回收率，又可以 连续自动进样和收集，自动化程度高，容易放 大；
G25脱盐柱使用指南
pH 7.0 • Flow rate: 20 ml/min at room temperature • Sample volume: 15 ml • Separations: Elute the column with 106 ml (2 CV) of
buffer
• Equilibration is not necessary between runs with the ances (Mr < 1 000). • Storage +4 to +30 °20% ethanol
• 长期不用后再使用，应该用5CV平衡柱子 （5*60=300ml buffer）
• Try these conditions first • Buffer(35ms/cm): 50 mM phosphate buffer, 0.15 M NaCl,
• (去除气泡）Reverse the flow direction and pump 200 ml well de-gassed buffer at a flow rate of 15 ml/min through the column. The quality of the packed bed will not normally be affected.
Desalting column protocol
Mr. Yu Wang
• Matrix Sephadex™ G-25 Fine, cross-linked dextran • Bed volume 53 ml • Bed height 100 mm • i.d. 26 mm • separation of high (Mr > 5 000) from low molecular
buffer
• Equilibration is not necessary between runs with the ances (Mr < 1 000). • Storage +4 to +30 °20% ethanol
• 长期不用后再使用，应该用5CV平衡柱子 （5*60=300ml buffer）
• Try these conditions first • Buffer(35ms/cm): 50 mM phosphate buffer, 0.15 M NaCl,
• (去除气泡）Reverse the flow direction and pump 200 ml well de-gassed buffer at a flow rate of 15 ml/min through the column. The quality of the packed bed will not normally be affected.
Desalting column protocol
Mr. Yu Wang
• Matrix Sephadex™ G-25 Fine, cross-linked dextran • Bed volume 53 ml • Bed height 100 mm • i.d. 26 mm • separation of high (Mr > 5 000) from low molecular
用Sephadex+G-25+凝胶过滤层析脱盐和缓冲液置换应用报告
产品资料
图 8. 用Sephadex G-25填装INdEX柱的示意图。
1. INdEX/Sephadex G-25 使用 6 mm 手动生产用脱盐系统请向安玛西亚公司各办事处查询——
香港：(852) 2811 7575；北京：(010) 8838 5742；上海：(021) 6445 5290；广州：(020) 8732 0255。
图 6. Sephadex G-25 SF从标记了 125I的胰岛素中去除胰岛素 和氯氨T。
2. L生化制剂样品: 用Sephadex G-25 (超细) 填充的BPG 450柱纯化植物中抽提的过敏源，去除低分子量杂质(7)。 柱体积 25 L，样品体积可高达24% 柱体积。流速66 cm / hr。柱床高 15 cm，循环时间很短，仅 17 分钟；样品 稀释仅 1.4 倍。以上两个例子可见用 Sephadex G-25 脱 盐，短层析柱一样能达到很好的效果，并可缩短生产 周期，增加产量。
表 1. 用Sephadex G-25大规模脱盐的例子
柱尺寸
粒度
(长×内径，厘米)
应用
上样 (%) 一次操作 参考文献 时间 (分)
15×45
超细 过敏源抽提物中等纯化
24
17
7
60×40
粗
杂交细胞培养物上清
20
54
11
100×40
粗
白蛋白脱盐
25
27
9
60×60
粗
血浆蛋白t脱盐
15
20
12
100×180
1. 300 ml重组蛋白样品: 酒精酵母表达的重组过氧化物歧 化酶 (rhSOD) 用 1.1 L Sephadex G-25 (超细) 在十厘米 内径的BPG 100柱中进行初步下游纯化,去除了影响下 一步层析的低分子量杂质 (7)。样品体积达 300 ml (即 27% 柱体积)，流速 60 cm / hr，一个周期 30 分钟，样 品稀释 1.2 倍。再用阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯 化至 99% 纯度。用自动层析系统循环工作，16 小时可
G脱盐柱使用指南
• Sephadex G-10 is well suited for the separation of biomolecules such as peptides (Mr >700) from smaller molecules (Mr <100).
• Sephadex G-50 is suitable for the separation of molecules Mr >30 000 from molecules Mr <1 500 such as labeled protein or DNA from unconjugated dyes. The medium is often used to remove small nucleotides from longer chain nucleic acids.
• Sephadex G-25 is recommended for the majority of group separations involving globular proteins. These media are excellent for removing salt and other small contaminants away from molecules that are greater than Mr 5000.
Desalting column protocol
Mr. Yu Wang
• Matrix Sephadex™ G-25 Fine, cross-linked dextran • Bed volume 53 ml • Bed height 100 mm • i.d. 26 mm • separation of high (Mr > 5 000) from low molecular
实验一+卵清白蛋白盐析及G-25脱盐(1)
卵清白蛋白盐析及凝胶过滤脱盐
一、实验目的
• 了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操 作. • 了解葡聚糖凝胶脱盐的基本原理和凝胶柱 的制备及洗脱技术.
二、实验原理
• 盐析的原理:蛋白质是亲水胶体 在高浓度的中性盐影 盐析的原理 蛋白质是亲水胶体,在高浓度的中性盐影 蛋白质是亲水胶体 响下脱去水化层,同时 蛋白质分子所带的电荷被中和,结果 同时,蛋白质分子所带的电荷被中和 响下脱去水化层 同时 蛋白质分子所带的电荷被中和 结果 蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。 蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。盐析不同的蛋 白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及pH有关 有关.分子量大 白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及 有关 分子量大 的蛋白质(球蛋白 比分子量小(白蛋白 易析出。 球蛋白)比分子量小 白蛋白)易析出 的蛋白质 球蛋白 比分子量小 白蛋白 易析出。改变盐浓 使不同分子量的蛋白质分别析出。 度,使不同分子量的蛋白质分别析出。 使不同分子量的蛋白质分别析出 脱盐的原理：含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时， 脱盐的原理：含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时，小 分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中， 分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中，向下移动的速度较 而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔， 慢；而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔，以较快的速 度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。 度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。 G-25:1000---5000 G-50:1500---30000 G-75:3000---80000
三、实验用品
• 仪器：层析装置一套、752型紫外可见分光 光度计、离心机 • 器皿：5ml离心管2支、5ml试管20支、 50ml烧杯2个、试管架、玻棒、石英比色皿、 玻璃层析柱 • 药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱 和硫酸铵溶液、凝胶G-25
一、实验目的
• 了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操 作. • 了解葡聚糖凝胶脱盐的基本原理和凝胶柱 的制备及洗脱技术.
二、实验原理
• 盐析的原理:蛋白质是亲水胶体 在高浓度的中性盐影 盐析的原理 蛋白质是亲水胶体,在高浓度的中性盐影 蛋白质是亲水胶体 响下脱去水化层,同时 蛋白质分子所带的电荷被中和,结果 同时,蛋白质分子所带的电荷被中和 响下脱去水化层 同时 蛋白质分子所带的电荷被中和 结果 蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。 蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。盐析不同的蛋 白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及pH有关 有关.分子量大 白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及 有关 分子量大 的蛋白质(球蛋白 比分子量小(白蛋白 易析出。 球蛋白)比分子量小 白蛋白)易析出 的蛋白质 球蛋白 比分子量小 白蛋白 易析出。改变盐浓 使不同分子量的蛋白质分别析出。 度,使不同分子量的蛋白质分别析出。 使不同分子量的蛋白质分别析出 脱盐的原理：含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时， 脱盐的原理：含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时，小 分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中， 分子量的盐分子因进入凝胶的筛孔中，向下移动的速度较 而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔， 慢；而大分子的蛋白质不能进入凝胶的筛孔，以较快的速 度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。 度流过凝胶柱，从而使蛋白质与盐分开。 G-25:1000---5000 G-50:1500---30000 G-75:3000---80000
三、实验用品
• 仪器：层析装置一套、752型紫外可见分光 光度计、离心机 • 器皿：5ml离心管2支、5ml试管20支、 50ml烧杯2个、试管架、玻棒、石英比色皿、 玻璃层析柱 • 药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱 和硫酸铵溶液、凝胶G-25
脱盐柱的原理
脱盐柱的原理脱盐柱是一种用于去除水中盐分的设备，其原理是通过特定的材料和工艺将水中的盐分吸附或分离出来，从而实现去盐的效果。
脱盐柱在海水淡化、饮用水处理、工业生产等领域有着广泛的应用，其原理和工作机制对于理解水处理技术和提高水质具有重要意义。
首先，脱盐柱的原理基于离子交换技术。
离子交换是指在一定条件下，离子之间发生置换反应的化学现象。
脱盐柱内部填充有离子交换树脂，当含盐水通过脱盐柱时，树脂表面的功能基团与水中的盐离子发生置换反应，使盐离子被吸附在树脂上，从而实现去盐的目的。
这种原理可以高效去除水中的盐分，使水质得到改善。
其次，脱盐柱的原理还涉及逆渗透技术。
逆渗透是利用半透膜将水中的溶质与溶剂分离的物理过程。
脱盐柱内部通常包含逆渗透膜，当水通过膜时，由于膜的特性使得水分子能够通过而盐离子无法通过，从而实现了盐分的分离。
逆渗透技术在脱盐柱中的应用，可以高效去除水中的盐分和其他杂质，得到高纯度的水。
此外，脱盐柱的原理还包括蒸馏和结晶技术。
蒸馏是利用水的沸点低于盐溶液的沸点的特性，通过加热蒸发和冷凝凝结的方式将水和盐分离。
结晶则是通过控制溶液中盐的浓度，使得盐在一定条件下结晶析出，从而实现盐分的分离。
这些技术在脱盐柱中的应用，可以根据具体的情况选择合适的方法去除水中的盐分。
总的来说，脱盐柱的原理是多种技术的综合应用，通过离子交换、逆渗透、蒸馏和结晶等方式去除水中的盐分。
这些原理的应用使得脱盐柱成为了一种高效、可靠的水处理设备，对于改善水质、满足人们对清洁水的需求起着重要的作用。
随着科学技术的不断发展，脱盐柱的原理和技术也在不断完善和创新，为人们提供更加优质的水资源。
PD-10 脱盐柱 产品手册说明书
PD-10脱盐柱产品手册52130800BD1简介产品货号17085101PD-10脱盐柱产品包含•30根预装PD-10脱盐柱每根含有8.3mL Sephadex™G-25树脂•4个离心接头•使用说明书应用PD-10脱盐柱专为蛋白质和其他大分子样品(>5000Mr)进行快速、方便的样品净化。
PD-10脱盐柱可用于脱盐、缓冲液置换和去除样品里的低分子量化合物。
保存储存温度：4°C至30°C。
储存溶液：0.15%Kathon CG/ICP biocide。
2原理PD-10脱盐柱内装有Sephadex G-25树脂，可以进行高分子量和低分子量物质的组分分离。
PD-10脱盐柱用于脱盐和缓冲液置换。
小分子如盐，自由的标签和其他杂质可以有效地被从感兴趣的高分子量物质中分离。
脱盐柱主要是利用了凝胶过滤的原理，根据分子大小的不同来进行组分分离。
•比Sephadex基质中最大孔径还要大的分子被排除在基质之外并首先被洗脱。
•比Sephadex基质孔径小的分子会不同程度地渗入到孔径中。
因此它们在大分子之后洗脱。
3使用建议脱盐柱可以使用重力和离心两种方式。
重力方式液体在重力作用下通过柱子。
•重力方式的回收和脱盐能力比离心方式略高。
•样品会被稀释。
离心方式通过离心进行使用。
•样品不会被稀释。
回收率样品的回收率取决于样品类型。
通常回收率在70%到90%。
增加样品浓度可以改善回收率。
4离心接头组装使用PD-10脱盐柱离心方式时，必须与接头和收集管组装在一起，组装方式如下图所示。
5使用方法5.1重力方式一、PD-10脱盐柱的准备1、取下顶部的盖子并倒出柱子里的储存液。
2、剪开脱盐柱底部槽口处。
二、脱盐柱平衡1、用平衡缓冲液填满脱盐柱并且让缓冲液完全进入柱床内。
2、重复4次。
3、丢弃流出液。
笔记：大约会用到25mL平衡缓冲液。
平衡缓冲液成分没有要求，可以根据需要自由选择。
三、样品上样1、最多加入2.5mL样品到脱盐柱中。
G25脱盐柱使用指南课件
• Sephadex G-25 is recommended for the majority of group separations involving globular proteins. These media are excellent for removing salt and other small contaminants away from molecules that are greater than Mr 5000.
• (去除气泡）Reverse the flow direction and pump 200 ml well de-gassed buffer at a flow rate of 15 ml/min through the column. The quality of the packed bed will not normally be affected.
Desalting column protocol
Mr. Yu Wang
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1
• Matrix Sephadex™ G-25 Fine, cross-linked dextran • Bed volume 53 ml • Bed height 100 mm • i.d. 26 mm • separation of high (Mr > 5 000) from low
molecular weight substances (Mr < 1 000). • Storage +4 to +30 °20% ethanol
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•长期不用后再使用，应该用5CV平衡柱子
（5*60=300ml buffer）
•Try these conditions first
• (去除气泡）Reverse the flow direction and pump 200 ml well de-gassed buffer at a flow rate of 15 ml/min through the column. The quality of the packed bed will not normally be affected.
Desalting column protocol
Mr. Yu Wang
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1
• Matrix Sephadex™ G-25 Fine, cross-linked dextran • Bed volume 53 ml • Bed height 100 mm • i.d. 26 mm • separation of high (Mr > 5 000) from low
molecular weight substances (Mr < 1 000). • Storage +4 to +30 °20% ethanol
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•长期不用后再使用，应该用5CV平衡柱子
（5*60=300ml buffer）
•Try these conditions first
Sephadex G-25凝胶层析
（1）各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否 则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随 着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。 操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏 气之处，应仔细检查并加以纠正。 （2）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝 胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液 体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。
（1）说明凝胶层析的原理 （2）层析柱中的“纹路” 、气泡和凹凸不平 的床表面对层析效果有何影响？ （3）连接高位贮液瓶与层析柱之间的U形导 管，有防止层析床液体流干的作用，说明其 原理。 （4）恒压贮液瓶为何能保证操作压的恒定？
凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗粒， 颗粒内部不是实心的，而是呈三维多孔网状结构。在洗 脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因其直 径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部，只能 沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快， 先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网孔结 构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速度慢， 比大分子物质后流出层析柱，分子大小不同的混合物因 此得到分离。
层析技术分离纯化生物大分子利用那些物 理化学性质上的差异？
血红蛋白的相对分子质量与核黄素的相对 分子质量差异很大，采用什么技术分离它 们？ 采用该技术分离血红蛋白与核黄素需要到 哪些实验器材与试剂？
（1）掌握凝胶层析的原理 （2）掌握柱层析的基本装置 （3）熟悉凝胶层析的操作过程
常用的层析方法：凝胶层析、离子交换层 析、亲和层析、吸附层析、分配层析。 本次试验用的是凝胶层析，凝胶层析的固 定相是凝胶颗粒，流动相是单一缓冲液或盐 溶液，利用的是混合物中各种成分大小不同 这种原理特性来分离混合物。
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• Sephadex G-10 is well suited for the separation of biomolecules such as peptides (Mr >700) from smaller molecules (Mr <100).
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molecular weight substances (Mr < 1 000). • Storage +4 to +30 °20% ethanol
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2Hale Waihona Puke •长期不用后再使用，应该用5CV平衡柱子
（5*60=300ml buffer）
•Try these conditions first
•Buffer(35ms/cm): 50 mM phosphate buffer, 0.15 M NaCl, pH 7.0
• Sephadex G-25 is recommended for the majority of group separations involving globular proteins. These media are excellent for removing salt and other small contaminants away from molecules that are greater than Mr 5000.
•Flow rate: 20 ml/min at room temperature
•Sample volume: 15 ml
•Separations: Elute the column with 106 ml (2 CV) of buffer
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• Equilibration is not necessary between runs with the same buffer.
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sample volumes of up to 30% of the total volume of the desalting column can be processed. not exceed approximately 70 mg/ml。
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Column: HiTrap Desalting, 1 × 5 ml, 3 × 5 ml, 5 × 5 ml Sample: 2 mg/ml BSA in 50 mM sodium phosphate, 0.5 M sodium chloride, pH 7.0 Sample volume: 28% × Vt (1.4, 4.3 and 7.1 ml respectively) Buffer: 50 mM sodium phosphate, 0.15 M sodium chloride, pH 7.0 Flow rate: 5 ml/min
• (去除气泡）Reverse the flow direction and pump 200 ml well de-gassed buffer at a flow rate of 15 ml/min through the column. The quality of the packed bed will not normally be affected.
• Sephadex G-50 is suitable for the separation of molecules Mr >30 000 from molecules Mr <1 500 such as labeled protein or DNA from unconjugated dyes. The medium is often used to remove small nucleotides from longer chain nucleic acids.
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Storage Store unused media 4°C to 30°C in 20% ethanol. Do not freeze. Wash used media with 2 column volumes of distilled water followed by 2 column volumes of 20% ethanol. Store at 4°C to 30°C. Alternatively, wash with 2 column volumes of distilled water followed by 2 column volumes 0.01 M NaOH. Sodium hydroxide solution is bacteriostatic, easily disposed of and does not shrink the medium. Degas the ethanol/water mixture thoroughly and use a low flow rate, checking the back pressure as the column equilibrates. Avoid changes in temperature which may cause air bubbles in the packing.
Desalting column protocol
Mr. Yu Wang
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• Matrix Sephadex™ G-25 Fine, cross-linked dextran • Bed volume 53 ml • Bed height 100 mm • i.d. 26 mm • separation of high (Mr > 5 000) from low