聚谷氨酸的检测方法
复合肥料中γ-聚谷氨酸含量的测定 柱前衍生-高效液相色谱法 -回复
复合肥料中γ-聚谷氨酸含量的测定柱前衍生-高效液相色谱法-回复复合肥料中γ聚谷氨酸含量的测定是农业学和化学学等学科领域的重要研究内容。
γ聚谷氨酸是一种具有较高氮含量的天然多肽，是植物生长和发育中的重要调控物质，能有效提高作物的抗逆性和产量。
为了准确测定复合肥料中γ聚谷氨酸的含量，我们可以采用柱前衍生高效液相色谱法。
柱前衍生是一种在样品分析前对目标分析物进行修饰的方法，可以提高分析物的检测灵敏度和选择性。
结合高效液相色谱技术，可以实现对复合肥料样品中γ聚谷氨酸的准确测定。
下面，我们将详细介绍柱前衍生高效液相色谱法测定复合肥料中γ聚谷氨酸含量的步骤和操作方法。
第一步：准备样品首先，需要准备待测的复合肥料样品。
将样品粉碎并均匀混合，取适量样品，称取一个准确的样品质量，并转移至适量的容量瓶中。
然后，加入适量的溶剂，如硝酸钠溶液等溶解样品。
待样品完全溶解后，用0.45μm的微孔滤膜过滤，以去除杂质。
第二步：柱前衍生将样品中的γ聚谷氨酸进行柱前衍生。
选择适合的柱前衍生试剂，如酰氯试剂，将试剂添加到样品中，并进行充分混合反应。
可采用常温或者加热的方法进行反应，反应时间通常在30分钟至数小时不等，具体的反应条件需根据试剂和样品的特性进行优化。
第三步：固相萃取固相萃取是在衍生化反应后去除混合体，净化样品并提取目标化合物的方法。
将衍生化样品经过固相萃取柱处理，可以有效去除多余的试剂和杂质。
选择合适的固相萃取柱，如C18柱，并设定适当的洗脱溶剂，如甲醇和水的混合物。
用洗脱溶剂进行洗脱，收集洗脱液中的目标化合物。
第四步：制备标准曲线为了定量分析样品中的γ聚谷氨酸含量，需要制备一条标准曲线。
选择一系列浓度已知的γ聚谷氨酸标准溶液，分别进行柱前衍生和固相萃取处理，并用高效液相色谱仪分离检测。
采用不同浓度标准溶液的响应值绘制曲线，可得一条γ聚谷氨酸的标准曲线。
第五步：高效液相色谱分析将经过柱前衍生和固相萃取处理的样品用高效液相色谱仪进行分析。
紫外分光光度法测定γ-聚谷氨酸的含量
药用 高 分子 材料 ； 品领域 可 作为膳 食 纤维 、 食 保健 食 品 、 品增 稠剂 、 食 安定 剂 等 ； 农业 领 域可作 为 高吸水 树脂 、
肥 料增效 剂 而用 于改 良土 壤 ， 进农 作物 生长 ； 促 工业 领 域则 作为 生物 絮凝 剂 、 金属 吸 附剂 、 合 剂而用 于废 重 螯 水处 理 ， 还可 作为 滤膜 材料 、 热塑 料 、 湿 材 料 等 。 目前 ， 一聚谷 氨 酸 及 其盐 的测 定 ， 耐 保 ］ 常用 氨 基 酸 分 析 仪 、 胶色谱 法 ＿ 、 ］凝 ３ 柱前 衍 生高 效 液 相 色 谱 法 等 。笔 者 研 究 了将 ７～聚 谷 氨 酸 水 解 成 谷 氨 酸 的 水解 条 ］ 件 ， 研 究 了谷氨 酸与 四氯 对苯 醌 （ Ｂ 发生 络合 反应 形成 络合 物 的条件 ， 立 了一 种 紫外 分 光光 度 法测 并 ＴＣ Ｑ） 建 定 一聚谷 氨 酸含量 的方 法 ， 结果令 人满 意 。
７ 一聚谷氨 酸样 品（ 台湾 味丹企业股份 有 限公 司） 四氯对苯醌 （ Ｃ Ｑ） 硼砂 、 ； ＴＢ 、 氢氧化钠 、 盐酸等均 为分 析纯 。
１ ２ 溶 液制备 ［ ． ５
四氯对苯醌 （ Ｃ Ｏ 溶液 ： ．０ ０ ｍｏ Ｌ Ｔ ＢＤ ２５ ×１一 ｌ 。准确称取 ００ １２ｇＴ Ｂ 加无水乙醇稀释定容至 ５ 。 ／ ．３ Ｃ Ｑ， ０ｍＬ
a7一聚谷氨酸丫一pga作为一种可生物降解对环境和人体无害可用微生物发酵生产的高分子聚合物随着生产和应用的不断深入愈来愈显现出广阔的应用前景如在医药领域可作为药物载体粘合剂医药用高分子材料
第２卷 第 ３ ３ 期 ２０ ０８年 ９月
青岛大学 学报 （ 程技 术版 ） 工
比色法快速测定发酵液中γ-聚谷氨酸含量
比色法快速测定发酵液中γ-聚谷氨酸含量刘鹏丽;刘萍;黄琛;殷志敏【摘要】建立了发酵液中γ-聚谷氨酸(γ-PGA)含量快速测定的比色检测方法.其原理为γ-聚谷氨酸可以与亚甲基蓝溶液发生反应,并且使亚甲基蓝溶液颜色发生变化.配制不同浓度的γ-PGA标准品溶液,使其与亚甲基蓝溶液形成反应体系,并对亚甲基蓝溶液浓度、反应温度以及反应时间对反应体系的影响分别进行对比优化.结果显示,亚甲基蓝溶液质量浓度为10 mg/L,反应温度为30℃,反应时间为5 min,线性回归方程y=0.0024x+0.3289,R2=0.9965,空白加标平均回收率为106.8％,平均RSD值为1.51％,发酵液中加标平均回收率为118.3％,平均RSD值为1.89％.利用比色法测定发酵液中γ-PGA的含量简便快捷、重现性好、灵敏度较高、准确度好,可用于发酵液中γ-PGA浓度的检测.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(042)002【总页数】5页(P105-108,114)【关键词】γ-聚谷氨酸;亚甲基蓝;比色法;定量分析【作者】刘鹏丽;刘萍;黄琛;殷志敏【作者单位】南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子医学重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子医学重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子医学重点实验室,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,生物化学与生物制品研究所,江苏省分子医学重点实验室,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】Q5-33γ-聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)是一种具有生物相容性的新型生物高分子材料,是炭疽杆菌细胞荚膜的一种化学组成成分,由D-谷氨酸或L-谷氨酸以α-氨基和γ-羧基通过酰胺键缩合而成的,由多数杆菌产生的一种胞外水溶性的高分子氨基酸聚合物. 微生物合成的γ-PGA通常由5 000个左右的谷氨酸单体组成,相对分子质量一般在100 kD～1 000 kD[1-3]. γ-PGA是一种阴离子高分子聚合物,在其分子链的侧链上有很多活性较高的游离羧基(—COOH),可以在分子内部或分子之间形成氢键[4],具有极高的保湿性和吸水性,易于和一些药物结合形成稳定的复合物,是一种理想的可在体内生物降解的药用高分子聚合物[5-6]. γ-PGA安全无毒,对环境没有污染,具有可塑性、成纤维性、成膜性、保湿性等众多的理化性质和生物学特性,被广泛地应用于农业、医药、环境治理、食品加工与包装、化妆品工业等众多领域,是一种极具开发价值和应用前景的新型多功能生物制品[7-9].亚甲基蓝(Methylene blue),又被叫做次甲基蓝、亚甲蓝、次甲蓝、美蓝等,是一种芳香杂环化合物,被用作化学指示剂、生物染色剂、染料和药物等,在水溶液中呈正电性[10-11]. 根据异性电荷相吸的原理,带正电荷的亚甲基蓝分子可以和带负电荷(—COO-)的γ-PGA通过静电吸引力相结合,使亚甲基蓝水溶液颜色发生变化[12-13].1 材料1.1 菌种及培养基枯草芽孢杆菌(南京师范大学生化与生物制品研究所提供);种子培养基:葡萄糖20 g/L;谷氨酸钠 10 g/L;酵母粉5 g/L;七水合硫酸镁2.5 g/L;磷酸氢二钾2 g/L;一水合硫酸锰0.02 g/L;发酵培养基:谷氨酸钠50 g/L;磷酸氢二钾15 g/L;磷酸二氢钾2 g/L;七水合硫酸镁2.5 g/L;酵母粉5 g/L;氯化铵4 g/L;一水合硫酸锰0.2 g/L;葡萄糖40 g/L;pH 7.0.1.2 仪器UV-1800PC分光光度计上海美谱达仪器有限公司;Heraeus Multifuge×3R冷冻离心机美国赛默飞;ZQZY-C振荡培养箱上海知楚仪器有限公司;SHZ-IV循环多用真空泵南京科博尔仪器设备有限公司.1.3 材料亚甲基蓝上海瑞永生物科技有限公司;γ-PGA标准品南京轩凯生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯试剂.2 方法2.1 γ-PGA标准液的配制分别精确称取γ-聚谷氨酸标准品(4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5)g,置于干净的烧杯中,加入适量的蒸馏水溶解,然后定容至100 mL的容量瓶中,摇匀,分别得到40 g/L、35 g/L、30 g/L、25 g/L、20 g/L、15 g/L、10 g/L、5 g/L的γ-PGA标准品.2.2 γ-PGA的初步纯化发酵液稀释数倍后经10 000 r/min离心20 min,除去菌体,取上清液进行抽滤脱色,制得样液.2.3 亚甲基蓝配制根据文献[9]可知亚甲基蓝的干燥减量E=11.46%,因此根据干燥减量精确称取与所需亚甲基蓝干燥品质量0.050 0 g相当的未干燥品,将称取的亚甲基蓝(精确至0.000 1 g)溶解于蒸馏水中,待全部溶解后,移入100 mL容量瓶中,摇匀,配置成0.5 g/L的亚甲基蓝溶液,取该溶液1 mL至另一个50 mL的容量瓶中,用蒸馏水定容至50 mL,摇匀,得到10 mg/L的亚甲基蓝试液.2.4 亚甲基蓝比色法取3 mL标准液或样液于试管中,准确加入3 mL亚甲基蓝试液,然后置于恒温振荡箱中,在25 ℃振荡反应5 min后,将反应液倒入比色皿中,测定波长在664 nm下的吸光度(A664),以蒸馏水做相应处理作为空白.3 结果与分析3.1 亚甲基蓝试液浓度对测定的影响将浓度为(6、8、10、12、14、16)mg/L的亚甲基蓝试液分别与浓度为(5、10、15、20、25、30、35、40)g/L的γ-PGA标准品溶液在一定温度反应一定时间后,在664 nm下测定其吸光度A664,并绘制标准曲线,见图1.由图1可见,在不同浓度亚甲基蓝试液条件下,标准曲线都呈现较好的线性关系,但不同浓度的亚甲基蓝试液与γ-PGA标准液反应得到的标准曲线的R2值还是存在着不同,当亚甲基蓝试液浓度为10 mg/L时,标准曲线的准确度更好,因此在后续研究中,将亚甲基蓝试液浓度确定为10 mg/L.3.2 反应温度对测定的影响将浓度为(5、10、15、20、25、30、35、40)g/L的γ-PGA标准液与浓度为10 mg/L的亚甲基蓝试液分别在(25、30、35、40、45、50)℃下反应一定时间后,在664 nm处测定吸光度A664,绘制标准曲线.由图2可见,在不同温度条件下,标准曲线几乎重合,表明温度对测定结果的影响不大,可以忽略,因此选择温度为25 ℃,即室温.图1 不同亚甲基蓝浓度下的标准曲线Fig.1 Standard curves at different concentrations of methylene blue注:R2=0.994 8(25 ℃);R2=0.996 9(30 ℃);R2=0.994 0(35 ℃);R2=0.9946(40 ℃);R2=0.996 0(45 ℃);R2=0.995 5(50 ℃).图2 不同温度下的标准曲线Fig.2 Standard curves at different reaction temperature3.3 反应时间对测定的影响将浓度为(5、10、15、20、25、30、35、40)g/L的γ-PGA标准品溶液与浓度为10 mg/L的亚甲基蓝试液于25 ℃反应不同时间,在664 nm处测定其吸光度A664,并绘制标准曲线.由图3可见,反应不同时间的标准曲线都呈较好的线性关系,而且标准曲线没有太大的差异,表明反应时间对于测定结果影响不显著,因此,为了更加快速并且准确地检测γ-PGA含量,在后续的研究中,控制反应时间为5 min.3.4 亚甲基蓝比色法标准曲线按照上述实验得到的测定条件,将浓度为(5、10、15、20、25、30、35、40)g/L 的γ-PGA标准液与浓度为10 mg/L的亚甲基蓝试液于25 ℃反应5 min,在664 nm处测定吸光度A664,绘制标准曲线,如图4所示.图4 亚甲基蓝比色法标准曲线Fig.4 The standard curve of methylene blue colorimetry注:R2=0.994 8(5 min);R2=0.988 1(10 min);R2=0.985 0(30 min);R2=0.978 6(1 h);R2=0.960 7(2 h);R2=0.954 4(3 h);R2=0.961 3(4 h);R2=0.948 9(5 h).图3 反应时间对标准曲线的影响Fig.3 Effect of reaction time on the standard curve 3.5 方法的回收率和重现性3.5.1 空白加标回收法按照方法1.2.1配制得到浓度为8 g/L(相对低浓度)、16 g/L(相对中浓度)、32g/L(相对高浓度)3个不同浓度的γ-PGA标准液,分别取γ-PGA标准液3 mL,亚甲基蓝3 mL,充分振荡摇匀,5 min后测定A664,以蒸馏水做相应处理后作为空白,每个处理重复3次,实验结果见表1,结果显示,应用亚甲基蓝比色法测定γ-PGA含量,其回收率和重现性都较好.3.5.2 样品加标回收法配制浓度为8 g/L、16 g/L、32 g/L的γ-PGA标准液,每个浓度的标准液各取2 mL,然后分别加入等体积的经过稀释的样品溶液,充分混匀之后,加入4 mL的亚甲基蓝试液,充分振荡反应5 min之后,测定A664,以2 mL样液加2 mL蒸馏水做相应处理后作为空白,每个浓度重复3次. 测定结果见表2,结果显示γ-PGA在发酵液中的回收率也较好.表2 γ-PGA在发酵液中的回收率Table 2 The recovery of γ-PGA in the fermentation broths样品加标样量/(g/L)回收标样量的平均值/(g/L)回收率/%RSD/%188.53106.72.2121616.57103.61.1433232.67102.41.33表1 回收率与重现性实验Table 1 The recovery and reproducibility of test配制浓度/(g/L)测得浓度的平均值/(g/L)回收率/%RSD/%88.13101.62.411616.04100.31.253231.9499.80.613.6 样品提取过程中发酵液脱色对测定的影响R2=0.994 8(control);R2=0.962 7(七水合硫酸镁);R2=0.969 2(氯化铵);R2=0.965 1(磷酸氢二钾);R2=0.972 3(谷氨酸钠).图5 不同无机盐对标准曲线的影响Fig.5 Effect of different inorganic salts on the standard curve本实验主要采用粉末状活性炭进行抽滤脱色,脱色率在90%左右,在未脱色之前发酵液的颜色会干扰比色测定的结果,因此,在进行比色测定时要先对发酵液进行脱色处理,由3.5.2样品加标回收法中可以看出,经过脱色之后的发酵液对比色测定的结果干扰很小.3.7 发酵液中无机盐成分对测定的影响分别准确称取一定量的七水合硫酸镁、氯化铵、磷酸氢二钾、谷氨酸钠,然后分别溶于一定量的浓度为10 mg/L的亚基蓝试液中,使之浓度分别为2.5 g/L、4 g/L、15 g/L、50 g/L,对照组为不加任何上述无机盐的浓度为10 mg/L的亚甲基蓝溶液,然后再分别与浓度为(5、10、15、20、25、30、35、40)g/L的γ-PGA标准液于25 ℃反应5 min,在664 nm处测定吸光度A664,绘制标准曲线,如图5所示.由图5可知,加入不同无机盐的标准曲线都呈较好的线性关系,标准曲线虽然有所差异,但是差异并不明显,表明无机盐离子对于测定结果的影响并不显著.4 结论亚甲基蓝是一种带正电荷的芳香杂环化合物,而γ-PGA在发酵液中是以聚阴离子形式存在的. 在溶液中,亚甲基蓝的氮原子可以和γ-PGA中羧基的氧原子配对,使亚甲基蓝试液的颜色发生变化. 本研究表明,带有正电荷的亚甲基蓝与具有聚阴离子性质的γ-PGA发生反应之后在664 nm处的吸光度大小与γ-PGA浓度成正比,并且具有良好的线性关系. 该方法的反应温度为25 ℃,反应时间为5 min,采用该方法测定γ-PGA的含量,其重现性和回收率都较好,而且在发酵液中的回收率也较高,并且发酵液需要经过脱色之后再进行比色测定,且发酵液中的无机盐对于测定结果干扰性很小. 该方法快捷简便、准确度高、结果可靠、无需特殊的设备和试剂,可以应用于γ-PGA的生物发酵生产中的检测.[参考文献]【相关文献】[1] 刘婷. 发酵液中γ-聚谷氨酸的分离纯化及初步鉴定研究[D]. 西安:陕西科技大学,2016.[2] 桑秀梅. 利用聚谷氨酸高产菌NS-18制备γ-聚谷氨酸[D]. 南京:南京师范大学,2017.[3] 董健,吕颖,方丽,等. γ-聚谷氨酸的发酵制备及快速鉴定分析方法研究[J]. 中国酿造,2012,32(5):148-150.[4] MAKOTO A,KAZUYA S,HISAAKI N,et al. Enzymatic Synthesis of High-Molecular-MassPoly-γ-glutamate and regulation of its stereochemistry[J]. Applied and environmental microbiology,2004,7:4249-4255.[5] 张庆庆,金鑫强,陈剑翔,等. 发酵液中γ-聚谷氨酸含量快速测定方法研究[J]. 食品工业科技,2012,19:294-296.[6] ING-LUNG S,YI-TSONG V. The production of poly-(γ-glutamic acid)from microorganisms and its various applications[J]. Broresource technology,2001,79(3):207-225.[7] 朱凡,吕忠良,杨叶东,等. 高黏发酵液中γ-聚谷氨酸的分离纯化工艺[J]. 化学工程,2013,41(12):9-11.[8] EZZELL J W,WELKOS S L. The capsule of bacillus anthracis,a review[J]. J Appl Microbiol,1999,87(2):250.[9] 李德衡,赵兰坤,李树标. γ-聚谷氨酸的生物合成及应用研究进展[J]. 发酵科技通讯,2012,41(3):12-16.[10] 李江涛,郑涛. 介孔碳材料对亚甲基兰的吸附特性研究[J]. 西安文理学院学报(自然科学版),2010,13(1):48-53.[11] 肖敏,李丽,钟龙飞,等. 活性炭吸附法处理印染废水的研究[J]. 辽宁化工,2009,38(8):537-539.[12] 王静心,李政,张秋亚,等. 亚甲基蓝染液的γ-PGA水凝胶脱色处理[J]. 印染,2013,24:1-5.[13] MEHMET D,MAHIR A,AYDM T,et al. Kinetics and mechanism of removal of methylene blue by adsorption onto perlite[J]. Journal of hazardous materials,2004,109:141-148.。
《聚谷氨酸企标》
A.3.4.2 试样液的制备 称取约0.1g 试样（精确至0.0001g），加水20ml，搅拌1h后，转至100ml量瓶中，加水稀
释至刻度，摇匀。溶液离心10min（转速12000r/min），取上清液用0.45μm 的膜过滤器过滤。 A.3.4.3 测定
在A.3.3 参考色谱条件下，分别对标准溶液和试样液进行测定，记录主峰面积，根据公 式计算出试样中聚谷氨酸的含量。 A.3.5 结果计算
A.3.3 参考色谱条件
a) 色谱柱：Waters Ulttrahydrogel 1000或Waters Ultrahydrogel Linear（300mm×7.8mm）色
谱柱；或其他等效色谱柱。
b) 流动相：10mmol/L磷酸氢二钠和15nmol/L磷酸二氢钾混合缓冲液，用0.45μm 的膜过
冷却后，加入氢氧化钠溶液（6→25）调至弱酸性。取5ml加入茚三酮试液1ml，水浴加热5分
钟，溶液呈紫色。
A.3 聚谷氨酸含量的测定
A.3.1 试剂和材料
a) 聚谷氨酸对照品（自制，由聚谷氨酸进一步精制而成）。
b) 磷酸氢二钠。
c) 磷酸二氢钾。
A.3.2 仪器和设备
高效液相色谱仪：配紫外或阵列二极管检测器（检测波长为220nm）。
产品的标识应符合 GB/T 191-2008 包装储运图示标志的要求。 6.2 包装
产品的包装应采用国家批准的、并符合化妆品包装用卫生标准的材料，包装净含量偏差 应符合国家质量监督检验检疫总局第75号令。 6.3 运输
产品在运输过程中不得与有毒、有害及污染物质混合载运，避免雨淋日晒等。 6.4 贮存
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──国家质量监督检验机构或用户提出要求时。 5.5 判定规则
聚谷氨酸的检测方法
聚谷氨酸测试方法1.0 适用范围：本方法适用于聚谷氨酸半成品及成品的 HPLC 纯度分析(第4 段、第 5 段中，蓝字为食品级及化妆品级 PGA纯品粉末的样品制备方法;红字为 PGA发酵液的样品制备方法)2.0 仪器与设备：2.1 Pump：SHIMADZU LC-10AT2.2 Autosampler：PERKIN ELMER series 200 autosampler2.3 Col umn ：TOSOH TSK Guard columnTOSOH TSK-GEL G6000PWXLTOSOH TSK-GEL G3000SW2.4 Detector：PERKIN ELMER 785A UV/VIS Detector3.0 试剂的制备3.1 0.05M Na2HPO4(disodium hydrogenophosphate , MW. 141.96g/mol)称取Na2HPO47.1g ，加入去离水800mL溶解，最后以去离水定容至1L 。
3.2 0.05M NaH2PO4•H2O (Sodium dihydrogenophosphate monohydrate, MW.137.99g/mol)称取NaH2PO4•H2O 6.9g，加入去离水800mL 溶解，最后以去离水定容至1L。
3.3 磷酸缓冲溶液，pH7.0将0.05M Na2HPO4与0.05M NaH2PO4•H2O 以约10：7 的比例混合，微调至pH7.0，以0.45μm滤膜过滤。
4.0 PGA样品前处理4.1 称取PGA样品0.04-0.05g置入50mL烧杯中。
4.2 加入40mL的0.05M Na2HPO4溶液。
4.3 利用磁石搅拌使样品完全溶解。
4.4 移入50mL定量瓶，以0.05M Na2HPO4溶液定容至50mL。
4.5 以0.45μm滤膜过滤，装入样品瓶中。
4.6 将样品放入HPLC 分析。
5.0 发酵液样品前处理5.1 称取发酵液2 g置入100mL 烧杯中，加入去离子水80mL，利用磁石搅拌均匀。
含聚谷氨酸有机水溶肥料(微量元素型)-2023最新标准
含聚谷氨酸有机水溶肥料（微量元素型）1 范围本文件规定了含聚谷氨酸有机水溶肥料（微量元素型）的技术要求、试验方法、检验规则、标识、包装、运输和贮存。
本文件适用于以淀粉、淀粉糖、蔗糖、葡萄糖、糖蜜、甘油等为主要原料经微生物发酵得到的聚谷氨酸，添加到满足NY/T 3831-2021标准的有机水溶肥料中制成的含聚谷氨酸有机水溶肥料（微量元素型）。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 190 危险货物包装标志GB/T 191 包装储运图示标志GB 38400 肥料中有毒有害物质的限量要求GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 6679 固体化工产品采样通则GB/T 6680 液体化工产品采样通则GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 8569 固体化学肥料包装NY/T 887 液体肥料密度的测定NY/T 1108 液体肥料包装技术要求NY/T 1117 水溶肥料钙、镁、硫、氯含量的测定NY 1428 微量元素水溶肥料NY/T 1972 水溶肥料钠、硒、硅含量的测定NY/T 1973 水溶肥料水不溶物含量和pH的测定NY/T 1974 水溶肥料铜、铁、锰、锌、硼、钼含量的测定NY/T 1976 水溶肥料有机质含量的测定NY/T 1978 肥料汞、砷、镉、铅、铬、镍含量的测定NY/T 1979 肥料和土壤调理剂标签及标明值判定要求NY/T 1980 肥料和土壤调理剂急性经口毒性试验及评价要求NY/T 3036 肥料和土壤调理剂水分含量、粒度、细度的测定NY/T 3039 水溶肥料聚谷氨酸含量的测定QB/T 5189 γ-聚谷氨酸JJF 1070 定量包装商品净含量计量检验规则3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
茚三酮比色法测定聚谷氨酸含量的研究
茚三酮比色法测定聚谷氨酸含量的研究近年来，聚谷氨酸在药物研发以及生物化学领域都有着重要的应用，在聚谷氨酸的回收利用中，确定聚谷氨酸的含量是最重要的环节。
随着科技的发展，越来越多的检测方法不仅能够更加准确的检测聚谷氨酸的含量，而且只需要很少的时间。
因此，本研究中采用了“茚三酮比色法”css测定聚谷氨酸含量，并研究了其有效性和可靠性。
本研究在一个恒温恒湿室中测定了九个部分的聚谷氨酸样本，每个样本都是0.25克的聚谷氨酸溶液，用0.1M的柠檬酸缓冲液进行混合。
然后，将混合液分装到10毫升分离比色管中，在文献参考的茚三酮浓度范围内，分别添加适量的茚三酮，把偶氮亮蓝G比色剂添加到分离比色管中，用孔板室把九个分离比色管依次安装在室内，用专用仪器进行光度测量，检测结果显示，当茚三酮浓度范围从0.01mg/ml变为0.04mg/ml时，聚谷氨酸含量也从81.3mg/ml变为68.1mg/ml。
结果表明，当茚三酮较低的浓度时，聚谷氨酸含量较低，而当茚三酮浓度较高时，聚谷氨酸含量较高。
本研究用茚三酮比色法测定了聚谷氨酸的含量，结果表明，该方法是准确、快速、简便的，省时省力。
由于茚三酮具有显色定量分析的优势，因此，这种技术可以实现聚谷氨酸含量范围内快速、准确测定聚谷氨酸含量，是一种可靠精准的检测技术。
同时，该技术可以用于实验室和工厂考察，用于特定行业产业化生产。
随着生物技术手段、药物研发技术和其他技术的发展，检测技术也在不断提高。
此次研究中，使用“茚三酮比色法”测定聚谷氨酸的含量，取得了可靠的科学结果，数据显示，茚三酮浓度增大时，聚谷氨酸的浓度也随之改变。
而且，根据实验结果，该方法检测结果相当精准，与其他技术相比，在聚谷氨酸测定方面具有很强的优势，可以快速测定聚谷氨酸含量，且结果准确可靠。
农业级聚谷氨酸标准
Q/XKJS 南京轩凯生物科技有限公司企业标准Q/XKJS001-2011南京轩凯生物科技有限公司发布前言农业级聚谷氨酸目前尚无国家标准和行业标准，根据《标准化法》的规定，特制定本标准，作为企业产品检验的依据。
本标准的编写要求、格式、构成和表述方法，符合GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》和GB/T 1.2-2002《标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法》的要求。
本标准中主要技术要素是参照国外同类产品相关产品标准，并结合产品试剂的实际数据及市场需要确定。
本标准自发布之日起有效期三年，到期复审。
本标准由南京轩凯生物科技有限公司提出并负责起草。
本标准主要起草人：。
农业级聚谷氨酸1 范围本标准规定了农业级聚谷氨酸的技术要求、检验方法、检验规则、标志、包装、运输与贮存等。
本标准适用于以谷氨酸为原料制得的农业级聚谷氨酸。
结构式：2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 603-2002 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法NY/T 1115-2006 水溶肥料水不溶物含量的测定国家技术监督局令[1995]第43号定量包装商品计量监督规定3 技术要求产品性能应符合表1的要求序号项目指标1 物理外观黄色或褐色粉末2 含量≥20%3 全氮≥5%5 全磷≥15%6 全钾≥18%7 不溶物含量≤0.5%8 pH 5.0-7.0净含量允许误差应符合《定量包装商品计量监督管理办法》的规定。
4 检验方法4.1 物理外观在自然光线下用肉眼检查产品的外观。
农业级聚谷氨酸标准.
Q/XKJS 南京轩凯生物科技有限公司企业标准Q/XKJS001-2011南京轩凯生物科技有限公司发布前言农业级聚谷氨酸目前尚无国家标准和行业标准，根据《标准化法》的规定，特制定本标准，作为企业产品检验的依据。
本标准的编写要求、格式、构成和表述方法，符合GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》和GB/T 1.2-2002《标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法》的要求。
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农业级聚谷氨酸1 范围本标准规定了农业级聚谷氨酸的技术要求、检验方法、检验规则、标志、包装、运输与贮存等。
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结构式：2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
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GB/T8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 603-2002 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法NY/T 1115-2006 水溶肥料水不溶物含量的测定国家技术监督局令[1995]第43号定量包装商品计量监督规定3 技术要求产品性能应符合表1的要求净含量允许误差应符合《定量包装商品计量监督管理办法》的规定。
4 检验方法4.1 物理外观在自然光线下用肉眼检查产品的外观。
4.2 含量4.2.1 方法提要以硫酸钠溶液为流动相，用凝胶渗透色谱法（GPC）分离测定聚谷氨酸含量4.2.2 试剂及溶液4.2.2.1 硫酸钠溶液（0.2mol/L）称取28.412g硫酸钠溶于水并稀释至1L，用乙酸调节pH至4.0，用孔径0.22μm混合纤维素酯微孔滤膜过滤，超声波脱气15min。
聚谷氨酸实验室提取方法和流程
聚谷氨酸实验室提取方法和流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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复合肥料中γ-聚谷氨酸含量的测定 柱前衍生-高效液相色谱法
复合肥料中γ-聚谷氨酸含量的测定柱前衍生-高效液相色谱法
复合肥料中γ-聚谷氨酸的含量可以通过柱前衍生-高效液相色谱法（Pre-column Derivatization - HPLC）进行测定。
方法步骤如下：
1. 样品准备：将待测复合肥料样品适量粉碎，并通过筛网过滤获得均匀的样品粉末。
2. 柱前衍生：取适量的样品粉末，加入适量的衍生剂，如荧光标记剂，混匀反应一定时间，使γ-聚谷氨酸与衍生剂发生反应生成具有荧光标记的产物。
3. 反应停止：加入适量的反应停止剂终止反应。
4. 样品提取：将反应混合物进行适当的提取，如使用有机溶剂进行提取，使荧光产物转移到有机相中。
5. 样品净化：通过旋转蒸发或其他方法将有机溶液浓缩。
6. 样品溶解：将浓缩后的有机溶液使用适当的有机溶剂溶解，得到最终的待测样品溶液。
7. HPLC测定：将待测样品溶液注入高效液相色谱仪中进行分析，使用适当的柱和流动相进行分离和定量分析。
8. 数据处理：根据标准品的浓度和峰面积，计算样品中γ-聚谷氨酸的含量。
这种方法的优点是测定灵敏度高，结果准确可靠。
但需要注意的是，衍生剂的选择以及反应条件的优化对测定结果有重要影响，需要进行实验验证。
复合肥料中γ-聚谷氨酸含量的测定 柱前衍生-高效液相色谱法 -回复
复合肥料中γ-聚谷氨酸含量的测定柱前衍生-高效液相色谱法-回复复合肥料中γ聚谷氨酸含量的测定，可以使用柱前衍生高效液相色谱法。
本文将一步一步回答相关问题，并解释涉及的步骤和原理。
引言复合肥料是一种由多种营养元素组合而成的肥料，可以提供植物生长所需的多种养分。
其中，γ聚谷氨酸是一种天然的植物抗氧化物质，对植物的生长和发育具有重要影响。
因此，准确测定复合肥料中γ聚谷氨酸的含量对于评估肥料质量和植物生长效果至关重要。
问题1: 为什么选择柱前衍生高效液相色谱法？柱前衍生高效液相色谱法具有高灵敏度、高分离度和高准确性的优点，是测定复合肥料中γ聚谷氨酸含量的有效方法。
同时，该方法还具有操作简便、快速分析和高通量分析的优点。
问题2: 实验准备a) 仪器：需要高效液相色谱仪、紫外检测器和柱温控制器等设备。
b) 试剂：需要丙酮、二硫化碳、N-乙酰-L-半胱氨酸、吡啶酮酸、1-丁磺酸胺基甲酸酯等试剂。
问题3: 样品前处理a) 取适量的复合肥料样品，并将其研磨成细粉末。
b) 将粉末样品加入丙酮中，并回流提取2小时。
c) 过滤提取液，并将其蒸干至干燥。
问题4: 样品衍生化a) 将样品溶解在适量的二硫化碳中。
b) 加入N-乙酰-L-半胱氨酸和吡啶酮酸作为衍生剂。
c) 在恒温条件下反应12小时。
问题5: 色谱条件a) 色谱柱：选择合适的高效液相色谱柱，如C18柱。
b) 流动相：可以选择甲醇和含0.1三氟乙酸的水作为流动相。
c) 流速：根据具体情况进行优化，一般范围在0.5-1.0 mL/min之间。
d) UV检测器：设置波长为254 nm。
问题6: 样品分析a) 将衍生化后的样品注入高效液相色谱仪。
b) 以优化的色谱条件进行分析。
c) 记录样品峰的保留时间，并通过外标法或内标法进行定量分析。
问题7: 结果分析根据所测定的样品峰的面积或峰高，结合标准品的浓度曲线，可以计算出复合肥料中γ聚谷氨酸的含量。
结论通过柱前衍生高效液相色谱法，我们可以准确测定复合肥料中γ聚谷氨酸的含量。
比色法快速测定发酵液中γ-聚谷氨酸含量
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:ｐｏｌｙ￣γ￣ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄꎬｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅꎬｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄꎬｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
γ －聚谷氨酸( ｐｏｌｙ￣γ￣ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄꎬγ￣ＰＧＡ) 是一种具有生物相容性的新型生物高分子材料ꎬ是炭疽杆
Ｒ２ ＝ ０.９９６ ５ꎬ空白加标平均回收率为 １０６.８％ꎬ平均 ＲＳＤ 值为 １.５１％ꎬ发酵液中加标平均回收率为 １１８.３％ꎬ平均 ＲＳＤ
值为 １.８９％. 利用比色法测定发酵液中 γ￣ＰＧＡ 的含量简便快捷、重现性好、灵敏度较高、准确度好ꎬ可用于发酵液中
γ￣ＰＧＡ 浓度的检测.
[ 关键词] γ－聚谷氨酸ꎬ亚甲基蓝ꎬ比色法ꎬ定量分析
Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＮａｎｊｉｎｇ ２１００２３ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ａ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ γ￣ＰＧＡ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ. Ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
菌细胞荚膜的一种化学组成成分ꎬ由 Ｄ －谷氨酸或 Ｌ －谷氨酸以 α －氨基和 γ －羧基通过酰胺键缩合而成的ꎬ
由多数杆菌产生的一种胞外水溶性的高分子氨基酸聚合物. 微生物合成的 γ￣ＰＧＡ 通常由 ５ ０００ 个左右的
基蓝溶液发生反应ꎬ并且使亚甲基蓝溶液颜色发生变化. 配制不同浓度的 γ￣ＰＧＡ 标准品溶液ꎬ使其与亚甲基蓝溶
紫外分光光度法测定γ- 聚谷氨酸的含量
紫外分光光度法测定γ- 聚谷氨酸的含量
张艳丽;高华;侯飞;于兹东
【期刊名称】《青岛大学学报（工程技术版）》
【年(卷),期】2008(023)003
【摘要】建立紫外分光光度法测定γ- 聚谷氨酸含量的方法.利用γ- 聚谷氨酸水解成谷氨酸,在pH 9.6硼砂缓冲溶液中,能与四氯对苯醌形成1∶1的络合物,该络合物在波长350 nm处有最大吸收,通过测定其吸光度确定γ- 聚谷氨酸含量.结果表明,γ- 聚谷氨酸在8～12 μg/mL范围内线性关系良好(r为0.998 1),平均回收率为99.5%,相对标准偏差为1.0%.该方法简便准确、重现性好,可作为γ- 聚谷氨酸含量的测定方法.
【总页数】4页(P86-89)
【作者】张艳丽;高华;侯飞;于兹东
【作者单位】青岛大学医学院药学系,山东,青岛,266021;青岛大学医学院药学系,山东,青岛,266021;青岛大学医学院药学系,山东,青岛,266021;青岛大学医学院药学系,山东,青岛,266021
【正文语种】中文
【中图分类】O631.6
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《聚谷氨酸企标》
4.2 理化指标：应符合表 2 的规定。
表2 理化指标
第 1 页 共 8 页
项
目 ≥
指 标 90.0 5.0~7.5 ≤ ≤ 10.0 0.07 标识值±20% ≤ 20
检验方法 附录A 中A.3 附录A 中A.4 附录A 中A.5 附录A 中A.6 附录A 中A.7 中国药典二部附录Ⅷ H 重金属检查法第二法a
聚谷氨酸 (以钠盐按干基计)， w/% pH值 （1%水溶液） 干燥失重，w/% 吸光度（4%水溶液,400nm） 特性黏度，[η]/ ( dL/g ) 重金属（以Pb计）/（mg/kg）
a
称样量约为1g。
4.3
微生物指标：应符合表 3 的规定。
表 3 微生物指标 项 菌落总数/（cfu/g） 目 ≤ 指 标 100 检验方法 GB 4789.2-2010
COOH
O
[
3.4
HN HC CH2 CH2 C
]n
CAS号：25513Байду номын сангаас46-6
4 技术要求 4.1 感官要求：应符合表1 的规定。
表1 项 色泽 气味 状态 目 要求 白色或褐色 几乎无臭 颗粒或粉末 感官要求 检验方法 取适量样品置于清洁、 干燥的白瓷盘 中， 在自然光线下， 观察其色泽和组 织状态，并嗅其味。
X 1=
MS CS AU 100% %………………………（A.1） MU （1-X 0） AS
式中： X1——试样中聚谷氨酸的含量，%； AU——试样液色谱分析得到的主峰面积； AS——标准溶液色谱分析得到的主峰面积； MU——试样的质量，单位为克（g）； MS——聚谷氨酸标准品的质量，单位为克（g）； X0——实测试样的干燥失重，%； CS——聚谷氨酸标准品中标示的聚谷氨酸的含量，%； 实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果 的绝对差值不大于算术平均值的2 %。 A.4 pH的测定 称取适量试样，配制成10mg/mL 的试样水溶液，用pH 计测定pH。 A.5 干燥失重 A.5.1 仪器和设备 快速水分测定仪(METTLER-TOLEDO Halogen Moisture Analyzer,HR83)。 A.5.2 测定条件 样品量：1g；温度：105℃；时间：15分钟。 A.5.3 测定方法 取本品约 1.0 g，置 HR83 型卤素水分测定仪托盘内。105℃测定 15 分钟，以仪器自动打 印结果计为 h（%）。
聚谷氨酸理化指标
聚谷氨酸理化指标一、聚谷氨酸的基本概念聚谷氨酸（y-PGA），又称纳豆菌胶、多聚谷氨酸，是一种水溶性、生物降解、不含毒性的生物高分子材料。
它最早在纳豆发酵豆中被发现，并通过微生物发酵法制得。
聚谷氨酸具有粘性，广泛应用于食品、化妆品、药品等领域。
二、聚谷氨酸理化指标的重要性聚谷氨酸理化指标是评判产品质量优劣的关键因素。
这些指标包括聚谷氨酸的含量、分子量、粘度、溶解性等。
稳定的理化指标意味着产品具有较好的品质和性能。
三、聚谷氨酸理化指标的评判标准1.聚谷氨酸含量：正常情况下，聚谷氨酸产量稳定在35g/L即为优质产品。
生产过程中，不同批次的含量波动应控制在一定范围内，以保证产品性能的稳定。
2.分子量：聚谷氨酸分子量分布对产品性能有一定影响。
理想的分子量分布应在一定范围内，以满足不同应用场景的需求。
3.粘度：聚谷氨酸溶液的粘度是其性能的重要指标。
合适的粘度可以保证产品在应用过程中的流动性和稳定性。
4.溶解性：聚谷氨酸在水、醇等溶剂中的溶解性能对其应用范围有较大影响。
良好的溶解性有助于提高产品在实际应用中的效果。
四、聚谷氨酸理化指标检测方法1.高效液相色谱法：这是一种准确的检测方法，可以对聚谷氨酸含量进行精确测定。
2.酒精法（醇沉法）：这种方法在一定程度上可以检测聚谷氨酸含量，但受发酵液中其他成分的影响，检测结果可能出现偏差。
五、总结聚谷氨酸理化指标是评判产品质量和性能的重要依据。
稳定的产量、适当的分子量分布、良好的溶解性和合适的粘度都是优质聚谷氨酸产品的必备条件。
选择合适的检测方法，确保产品符合相关指标，对于提升产品质量和市场竞争力具有重要意义。
聚谷氨酸分子量和含量
聚谷氨酸分子量和含量1. 介绍聚谷氨酸聚谷氨酸是一种生物大分子多肽，由谷氨酸（glutamic acid）单体通过肽键连接而成。
它具有多种生物学功能，包括调节细胞的生长、分化和凋亡等过程。
聚谷氨酸在医药、食品、农业等领域都具有广泛的应用前景。
2. 分子量的定义和计算方法分子量是指一个分子中所有原子的质量之和。
对于聚谷氨酸这样由多个谷氨酸单体组成的大分子来说，其分子量可以通过以下公式计算：M = n * m其中，M表示聚谷氨酸的分子量，n表示聚合物中谷氨酸单体的个数，m表示每个谷氨酸单体的分子量。
3. 聚谷氨酸含量的测定方法3.1 琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法是一种常用于测定聚谷氨酸含量的方法。
通过将样品加入琼脂糖凝胶电泳胶液中，利用电场将样品分离成不同的带状条带，根据条带的强度和位置可以确定聚谷氨酸的含量。
3.2 高效液相色谱法高效液相色谱法是一种精确测定聚谷氨酸含量的方法。
通过将样品溶解后注入高效液相色谱仪中，利用色谱柱对样品进行分离，并通过检测器测量各组分的峰面积或峰高来计算聚谷氨酸的含量。
4. 聚谷氨酸在医药领域的应用4.1 肿瘤治疗聚谷氨酸具有较好的药物传递性能和生物相容性，可以作为肿瘤治疗药物的载体。
将抗肿瘤药物与聚谷氨酸结合，可以提高药物在体内的稳定性和靶向性，减少毒副作用。
4.2 创伤修复聚谷氨酸作为一种生物可降解材料，在创伤修复中具有广泛的应用。
聚谷氨酸可以促进伤口愈合过程中的细胞增殖和组织再生，加速创伤的愈合。
5. 聚谷氨酸在食品领域的应用5.1 食品添加剂聚谷氨酸可以作为一种食品添加剂，用于提高食品的营养价值和口感。
它可以增加食品的黏稠度、弹性和保水性，改善食品的口感和质地。
5.2 食品保鲜剂聚谷氨酸具有较好的保水性能，可以作为一种食品保鲜剂使用。
将聚谷氨酸添加到食品中，可以延长食品的保质期，减少腐败和变质。
6. 聚谷氨酸在农业领域的应用6.1 土壤改良剂聚谷氨酸可以改良土壤结构，提高土壤肥力和养分利用率。
一种检测新型生物高分子材料聚_谷氨酸的新方法
解 ,配成 200μg /m l的溶液 B。精密量取 A 溶液 2m l,加 PGA 粗品 。
入 B 溶液 2m l,充分震荡 ,室温放置 ,与波长 680nm 处 , 1. 3. 6 粗品的测定 精密称取 γ2PGA 粗品 5mg,用蒸
每隔 10m in测定吸收度 A680。 1. 3. 2 线 性 关 系 研 究 精 密 称 取 γ2PGA 标 准 品
馏水溶解并在 50m l的容量瓶中定容 ,摇匀 ,精密量取 2. 0m l,加入 200μg /m l的 CPC溶液 2. 0m l,在 680nm 处
25mg,置 100m l容量瓶中 ,用蒸馏水溶解并定容摇匀 , 精密量取该溶液 0, 0. 05, 0. 1, 0. 15, 0. 2, 0. 25, 0. 3 和
2. 2 方法的线性关系 CPC浓度在 12. 5 ～50μg /m l范围内 ,线性关系良 好 ,回归方程为 : y = 4. 416x20. 0059 (图 1) 。
图 1 比浊法测定 γ2PGA含量的标准曲线 F ig. 1 Cr iter ion curve of the concen tra tion ofγ2PGA
表 4 粗品的测定 Table 4 The determ ina tion ofγ2PGA in crudeγ2PGA
序号
粗品的质量 (mg) A 68 0. 465 2. 66
2 3. 87 0. 490 2. 87
3 3. 87 0. 479 2. 74
多聚 γ2谷氨酸 (γ2Poly ( glutam ic acid ) , γ2PGA ) 是一种特殊的带负电荷的多肽 (聚氨基酸 ) ,是由某些 杆菌 ( B acillus) 合成的一种细胞外水溶性高分子氨基 酸聚合物 ,是由 L 2谷氨酸 、D 2谷氨酸两种构型的单体通 过 γ2酰胺键聚合形成的 [1 ] 。γ2PGA 具有极佳的成膜 性 、成纤维性 ,阻氧性 、可塑性 、粘结性 、保湿性和可生 物降解等许多独特的理化和生物学特性 [2 , 3 ] 。因此 ,γ2 PGA 可以被广泛用于医药制造 ,食品加工 ,蔬菜 、水果 、 海产品防冻 、保鲜 ,化妆品工业 ,烟草 、皮革制造工业和 植物种子保护等许多领域 ,是一种有极大开发价值和 前景的多功能新型生物制品 [4～6 ]. 作为一种生物高分 子 ,其定量通常采用冻干后称重的方法 , 特别长的 γ2 PGA 可测定 SDS2PAGE电泳条带后的光密度确定浓度 后者使用凝胶渗透色谱和折射监测器 [7, 8 ] ,以上几种方 法对于 γ2PGA 的发酵生产来讲 ,冷冻干燥的方法 ,由于 杂质的存在 ,使得 γ2PGA 含量的测定无法精确 ;后两种 方法仪器设备要求较高 ,过程繁琐 ,目前尚无一种理想 的简单易行的 γ2PGA 含量的测定方法 。 由于 γ2PGA 在发酵液中以聚阴离子形式存在 ,带
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聚谷氨酸测试方法
1.0 适用范围：本方法适用于聚谷氨酸半成品及成品的 HPLC 纯度分析(第4 段、第 5 段中，蓝字为食品级及化妆品级 PGA纯品粉末的样品制备方法;红字为 PGA发酵液的样品制备方法)
2.0 仪器与设备：
2.1 Pump：SHIMADZU LC-10AT
2.2 Autosampler：PERKIN ELMER series 200 autosampler
2.3 Col umn ：TOSOH TSK Guard column
TOSOH TSK-GEL G6000PWXL
TOSOH TSK-GEL G3000SW
2.4 Detector：PERKIN ELMER 785A UV/VIS Detector
3.0 试剂的制备
3.1 0.05M Na2HPO4(disodium hydrogenophosphate , MW. 141.96g/mol)
称取Na2HPO47.1g ，加入去离水800mL溶解，最后以去离水定容至1L 。
3.2 0.05M NaH2PO4•H2O (Sodium dihydrogenophosphate monohydrate, MW.137.99g/mol)
称取NaH2PO4•H2O 6.9g，加入去离水800mL 溶解，最后以去离水定容至1L。
3.3 磷酸缓冲溶液，pH7.0
将0.05M Na2HPO4与0.05M NaH2PO4•H2O 以约10：7 的比例混合，微调至pH7.0，以0.45μm滤膜过滤。
4.0 PGA样品前处理
4.1 称取PGA样品0.04-0.05g置入50mL烧杯中。
4.2 加入40mL的0.05M Na2HPO4溶液。
4.3 利用磁石搅拌使样品完全溶解。
4.4 移入50mL定量瓶，以0.05M Na2HPO4溶液定容至50mL。
4.5 以0.45μm滤膜过滤，装入样品瓶中。
4.6 将样品放入HPLC 分析。
5.0 发酵液样品前处理
5.1 称取发酵液2 g置入100mL 烧杯中，加入去离子水80mL，利用磁石搅拌均匀。
5.2 以1N H2SO4调整pH4.0。
5.3 移入100mL定量瓶，以去离子水定容至100mL。
5.4 取离心管秤取样品约80g（重量包含离心管、盖、标签、样品）。
5.5 利用高速离心机将菌体及杂质分离。
离心条件为：转速12,000rpm，时间10min，温度控制在4℃下。
5.6 离心后取上层液，以0.45μm滤膜过滤后，装入样品瓶中。
5.7 将样品放入HPLC 分析。
6.0 标准品配制
6.1 称取PGA标准品1g，加入0.05M Na2HPO4溶解，最后定
容至100mL，作为PGA标准稀释溶液，浓度为10000μg/mL。
6.2 取 5 只50mL 定量瓶，分别加入PGA标准稀释溶液(10000μg/mL) 1、2、3、4、5mL，以0.05M Na2HPO4定容至50mL，其各点浓度分别为200、400、600、800、1000μg/mL。
(分装储存于-20℃，使用时取出解冻，分析完后丢弃)
6.3 分别以0.45μm滤膜过滤，装入样品瓶中，待上机分析。
7.0 HPLC 分析条件
Column ：TOSOH TSK Guard column
TOSOH TSK-GEL G6000PWXL
TOSOH TSK-GEL G3000SW
Mobile phase ：磷酸缓衝溶液，pH7.0
Flow ：0.5mL/min
Detector ：UV220 nm
7.1标准品与样品分别以Autosampler取20μl注入HPLC作定性定量分析。
7.2 另作空白组，操作步骤同检液。
7.3 以波峰面积为纵座标，γ-PGA-H标准品的含量为横座标，绘制标准曲线，并建立线性回归方程式。
7.4 将样品的波峰面积数值，代入标准品线性回归方程式中，求得γ-PGA样品溶液的浓度，再带入计算公式，换算γ-PGA纯度。
8.0 计算
γ-PGA 样品溶液的浓度以回归方程计算y = ax + b
x ＝(y－b) / a
a：斜率
b：截距
y：样品的波峰面积
x：样品的浓度,μg/mL
γ-PGA的纯度(%) = ×100 =（C樣× D.F）/W ×100
C 样：样品的浓度(μg/mL)
D.F：样品的稀释倍数
W ：称取样品重量, μg
作为拌种剂使用一般稀释5-10倍拌种。