微粒体制备

微粒体制备

一、工作原理

微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构,这些小囊泡的直径大约100nm左右, 是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微粒体能够在不同的离心速度之下，从其他的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并分离，而P450、内质网碎片及其他可溶性酵素则保留在上清中。取上清在更快速的100,000g离心旋转之下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状，而可溶性酵素则保留在上清中，将沉淀重悬即可得到微粒体。因此，微粒体在细胞生物学中定义为从内质网的碎片所得到的小型囊泡。微粒体含有细胞色素P450 (CYP)，由于P450中的辅助因子、血基质含有铁元素，微粒体常呈现红褐色。肝（或其他组织）微粒体体外温孵实验是采用从肝脏（或其他组织）中提取的微粒体，加入还原型辅酶II(NADPH)再生系统，在体外模拟生理环境下进行代谢反应，采用高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验方法.

二、实验准备

以制备肝微粒体为例：

1、器材：匀浆机、大剪刀（断头）、手术剪、眼科剪3个、眼科镊3个、头皮针、注射器20ml、烧杯（500ml）4个、冰盒、冰板、匀浆管（5/10ml）、离心管（生科院借）、冻存管N个、培养皿N个。

2、试剂：冰生理盐水

PBS 缓冲液：1000ml缓冲液中含磷酸钾缓冲盐0.1mol·L-1、KCl 0.15 mol·L-1和1mmol·L-1EDTA,即1000ml超纯水中含K2HPO4 (228.23)18.304g、KH2PO4 (136.09)2.695g、KCl(74.55) 11.2g和EDTA0.372g，分装，4℃保存。

含20%甘油的PBS缓冲液200ml：40ml甘油+160ml上述PBS（存争议）三、实验步骤

以制备肝微粒体为例：

1、获取肝脏

大鼠禁食不禁水24h 后，将大鼠断头处死并置冰板上，打开腹腔，自门静脉注入预冷的冰生理盐水20-50ml，冲洗肝脏至土黄色，快速摘除肝脏，再用生理盐水将肝脏外周血水冲洗干净，称重、记录。

2、组织匀浆

在冰板上将肝组织剪为2-3g左右的小块，称重并记录，将每小块肝组织在培养皿中（置冰板上）剪碎，转入匀浆管中并加入一定体积的（1mL/g肝组织）PBS 缓冲液，于冰水浴中制成肝匀浆。

3、差速离心

将每组肝匀浆合并，装于9000g离心管中（生科院借），配平后4℃9000g离心20min取出，可见匀浆液基本分为三层：最上层白色漂浮物可能为脂肪组织、最下层沉淀为组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线粒体、中间上清层为后续离心所需。

撇开表层脂肪，取上清液于100000g离心管中（生科院借）中，精确配平后4℃100000g离心60min，弃上清，并用PBS再次冲洗下层沉淀（动作轻微），弃PBS，得下层粉红色沉淀即为所需的肝微粒体（microsome）。

4、重悬沉淀

将沉淀物悬浮于含20%甘油的磷酸钾缓冲液中（1g组织加入1mL含20%甘油的磷酸钾缓冲液），反复在冰水浴中吹打均匀，冻存管分装后置-80℃冰箱内保存待用。

5、蛋白定量

采用BCA法测定肝微粒体蛋白浓度。