激光共聚焦(简化版)页PPT文档

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紫外光 (激发滤色片 330-400 nm)
什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？
共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning
Fluorescence Microscope；LSFM）
以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭
聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的 荧光显微镜系统
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
488nm
520nm
450nm
490nm
FITC
普通荧光显微镜是广视场显微镜
荧光相互干扰－－图象清晰度降低
普通荧光显微镜是广视场显微镜
激发的特异性差－－背景荧光高
高压汞灯：
蓝光 绿光
(激发滤色片 (激发滤色片
420-485 460-550
根据荧光染料的性质可将荧光串色分为二类：第一 类串色是：两个荧光染料的激发光谱没有重迭， 但发射光谱有重叠。因为两种荧光染料的激发 光谱不重迭，所以可以使用序列扫描的方法来 排除串色的影响：即先使用第一种荧光染料的 激发光扫描一张图像，再使用第二种荧光染料 的激发光扫描第二张图像。
第二种串色是：两个荧光染料的发射光谱和吸收光 谱都有重迭。使用光谱扫描的方法可以排除这 类串色的影响。在后面会详细介绍光谱扫描方 法。
如果发现有荧光串色，则根据不同情况，使用序列扫描或光谱 扫描的方法来排除串色的影响。
1. 最简单的用来确定有无自发荧光的方法是使用与观察标记标本相同的 仪器参数去观察一个未经染色的对照标本。
2. 为了尽量排除荧光串色的影响，在实验中应注意以下几点：
① 尽量选择发射光谱较少重迭的荧光染料； ② 尽量选择吸收光谱较少重迭的荧光染料； ③ 使用只能激发一种染料的激光线来扫描标本，并采用序列扫描的方法；
荧光发生的原理
wenku.baidu.com光和荧光显微镜
一、荧光的基础术语
荧光物质：
488nm 520nm
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发 出波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能 产生荧光的物质称荧光物质或荧光素
激发光(EXCITATION)：
能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸 收波峰(最大吸收波长)
共聚焦系统 细胞CT
共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置
Computer
计算机
Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置
Microscope 荧光显微镜
Laser and electronic Control Unit
激光光源及 控制装置
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
荧光显微镜
二、荧光显微镜术的基本原理
高
紫外
被荧光
压 汞 灯
滤镜 分光
蓝 绿
探针染 激发 色的生
物样本
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490
长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
1. 最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作 对照：
首先观察第一种荧光染料单标记的标本，使用第一种荧光染料的激发
光，在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色；然后观察第 二种荧光染料单标记的另一个标本，使用第二种荧光染料的激发光， 在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。
药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量
蛋白质的转位 活细胞内H+浓度（ pH值）的测量 线粒体膜电位的测量 4.荧光漂白恢复（FRAP）技术 6.荧光能量共振转移（FRET）技术
1. 定位
荧光串色
荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射 光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染 料标记标本时，或当标本具有很强的自发 荧光时，很容易产生串色现象。
活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+ 等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复 细胞连接间的信息沟通……
直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共 聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白
基本应用
1. 定位、定量 2. 三维重组 3. 动态测量
活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的检测
异硫氰酸荧光素(FITC)
发射光(EMISSION):
发射光谱；发射波峰(最大发射波长)
荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）
自发荧光(AUTOFLUORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。
伊文斯蓝、硼化氢钠处理
漂白(BLEACH)：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 — 漂白。
激光扫描共聚焦显微镜原理 及应用
来滨 复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室
显微镜＋ 各种染色 标记技术
荧光标记技术
优点：1.灵敏度高，比常规免疫组织化学的灵 敏度高1000倍。
2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观 察多种物质的共定位。
3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态 变化
荧光显微镜 激光共聚扫描焦显微镜 双光子激光扫描显微镜
Antivibration table 防震台
激光扫描共聚焦显微镜与普通荧光显微镜的主要区别
不同波长的激光光源如：340nm、488nm、543nm等 点照明 共轭聚焦 扫描装置 数字化图像合成
光源针孔 光源
聚集平面
光电倍增管 检测针孔
分色镜
物镜 样本
激光扫描共聚焦显微镜光学原理
检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点(共轭聚焦)，使聚 焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔 高分辨率 的光学切片
激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获 得高标准的连续光学切片
实现三维重建
荧光显微镜
激光扫描共聚焦显微镜应用领域
只要目的结构是用荧光探针标记的，都可
用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察。 形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联
系、肿瘤细胞分类…… 分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，
DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、 定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变 、受体与配体相互作用……