琼脂稀释法操作步骤课件
琼脂稀释法操作步骤ppt课件
22
质控菌株
质控菌株
药敏
金黄色葡萄球菌
ATCC29213
+
大肠埃希菌
ATCC25922
+
大肠埃希菌
ATCC35218
+
肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌
ATCC700603
+
ATCC27853
+
其他
产β内酰胺酶 产超广谱β内酰胺酶
23
质控菌株
质控菌株
肺炎链球菌 粪肠球菌
流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌
ATCC49619 ATCC29212 ATCC49766 ATCC49247
淋病柰瑟球菌：
厌氧菌
ATCC49226 ATCC25285
药敏
+ + + + +
其他
检测胸腺嘧啶 氨苄西林敏感株 产β内酰胺酶(-) 氨苄西林耐药株
24
常见问题及解决指南
抗菌药 氨基糖苷类 喹诺酮类 多种药物
3
抗菌药物保存液的准备2
抗菌药物稀释 选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释,
稀释液需要量见下列公式：
抗菌药物实际称量*效价
稀释液体积= 保存液浓度（1920ug/ml）
4
抗菌药物保存液的准备3
实际操作： 先计算完成一批试验需几次完成,每次用量
多少,然后可一起称量,一起稀释,然后按每 次需要量分装在试管中,贴上标签,注明药 物名称,浓度,体积数及配制日期,置与≤20℃保存,备用。
现象 MIC太高 MIC太低 跳管
可能原因
解决办法
培养基PH太低 培养基PH太高
PH范围7.2-7.4。避 免CO2孵育降低PH
琼脂稀释法操作步骤
琼脂稀释法利用了琼脂培养基的固化特性，使得抗菌药物能够在培养基中均匀分布并保持相对稳定的浓度。当 接种了待测微生物后，微生物在含有不同药物浓度的琼脂平板上生长，通过比较不同平板上的菌落生长情况， 可以确定药物的最低抑菌浓度。
应用领域及意义
临床医学
用于指导临床用药，协助医生选择合 适的抗菌药物和剂量，提高治疗效果 。
02
实验准备
试剂与仪器
试剂
琼脂粉、培养基、抗生素标准品、无菌水等。
仪器
电子天平、pH计、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、移液器、无菌吸管、无菌平 皿等。
实验前准备事项
实验室环境准备
确保实验室干净整洁，定期进行消毒处理。 实验前开启紫外灯照射30分钟，确保无菌操 作环境。
试剂与仪器准备
检查所需试剂是否齐全，有无过期或污染现 象。对实验所需仪器进行清洗和烘干，确保 无菌状态。
用计数板或显微镜对菌落进行计数，记录每 个培养皿中的菌落数。
根据菌落计数结果计算菌液浓度，以CFU/ml 表示。同时记录实验过程中的操作细节和观 察结果，以便后续分析和比较。
04
结果分析与解读
菌落计数方法
平板菌落计数法
将待测样品经过适当稀释后，涂布在琼脂平板上，培养一定 时间后形成可见的菌落，通过计数菌落数量来推算样品中的 微生物数量。
药学研究
用于评价新药的抗菌活性，为药物研 发提供实验依据。
应用领域及意义
• 微生物学研究：用于研究微生物对抗菌药物的敏感性及其 耐药机制。
应用领域及意义
意义
可用于监测微生物的耐药性变迁，为临床抗感染治疗提 供重要参考。
提供了定量的药物敏感性试验方法，有助于准确评价抗 菌药物的疗效。
有助于指导临床合理用药，减少抗菌药物的滥用和误用， 降低医疗成本。
琼脂稀释法操作步骤
需氧菌
苛氧菌
MH肉汤或琼脂
嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base +补充因子SR158
链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血
卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维 羊血
淋球菌：CC Agar Base+L53
厌氧菌 Wilkins chalgren anaerobe 琼脂
测试菌液的点种2
开启多点接种器进行点种，因每一根点种 针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点 的菌液量约为2ｕl，所以接种量为104 CFU/ 点 点种时应先点种对照前的质控平板，然后 从最低药物浓度开始点种依次点种到药物 浓度最高的平板
药物平板的孵育
上述接种好的平板应在室温下静臵至接种点上的 菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒臵，于 35℃孵育16-20小时 如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，则需33-35℃， 绝对不能超过35℃，孵育24小时，阅读结果 万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24 小时后，阅读结果 淋病奈瑟球菌需在5%CO2空气环境中孵育20-24小 时，阅读结果
琼脂稀释法药敏平板的制备4
准备2只无药的平板,作点种前和点种后质 控对照 所有药物平板应保持表面干燥,不可有肉 眼可见的水珠(可在35℃孵箱内倒臵平板 开盖烘干15-20分钟)
琼脂稀释法药敏平板的制备5
如果需使用的药物平板为100Χ100mm的方平板, 则 每根玻璃管内需加入2.5ml的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4.5ml 每只方平板应加入2ml抗菌药物试液 无菌吸管内应存留下2.5ml与下一个浓度的玻璃 试管内的2.5ml稀释液进行充分混匀 药敏培养基应加入28ml
琼脂稀释法操作步骤
抗菌药物保存液的准备1
估算抗菌药物最小称量 琼脂稀释法最高药物浓度为128ｕg/ml 药物和培养基的体积比1:14,即药物浓度将成
15倍稀释，因此保存液为 128ｕg/mlΧ15 = 1920ｕg/ml
如果1次用量为10ml ,则: 抗菌药物最小称量= 1920ug/ml*10 ml 抗菌药物的效价
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药物平板的孵育
上述接种好的平板应在室温下静置至接种点上的 菌液被琼脂完全吸收，再将药敏平皿倒置，于 35℃孵育16-20小时
如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林，则需33-35℃， 绝对不能超过35℃，孵育24小时，阅读结果
万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24 小时后，阅读结果
用酒精棉球清洁多点接种器后，将点种针安装在 多点接种器架子上，再将加好菌液的点种板安置 上多点接种器的点种板位置上
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测试菌液的点种2
开启多点接种器进行点种，因每一根点种 针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点 的菌液量约为2ｕl，所以接种量为104 CFU/ 点
点种时应先点种对照前的质控平板，然后 从最低药物浓度开始点种依次点种到药物 浓度最高的平板
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培养基
需氧菌 苛氧菌
厌氧菌
MH肉汤或琼脂 嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base +补充因子SR158 链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血 卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维 羊血 淋球菌：CC Agar Base+L53 Wilkins chalgren anaerobe 琼脂
淋病奈瑟球菌需在5%CO2空气环境中孵育20-24小 时，阅读结果
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度MIC
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)|琼脂稀释法琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。
本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
1.培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。
淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。
2.含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
3.接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。
接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。
奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
4.结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
稀释琼脂法MIC
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)2008-01-27 22:27:10 相关论文相关书籍Tags：微生物学琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。
本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
1.培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。
淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。
2.含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
3.接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。
接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。
奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
4.结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
琼脂的溶解方法
琼脂的溶解方法
琼脂是一种常用的实验室试剂，它在生物学、生物化学、分子生物学
等领域中被广泛使用。
在实验中，我们经常需要将琼脂溶解成液态状态，以便于后续操作。
下面是一种简单易行的琼脂溶解方法。
材料：
1. 琼脂粉
2. 烧杯或容量瓶
3. 蒸馏水或去离子水
步骤：
1. 准备一个干净的烧杯或容量瓶。
2. 根据需要加入适量的琼脂粉。
通常情况下，每100ml液体中加入0.5-1g的琼脂粉即可。
3. 加入足够的蒸馏水或去离子水，搅拌均匀。
注意不要加入过多的水，否则会导致溶液过于稀释。
4. 将混合物加热至沸点，并持续搅拌直到琼脂完全溶解为止。
注意不
要让溶液沸腾过度，以免出现气泡和泡沫。
5. 将溶液倒入需要使用的容器中，并放置冷却至室温。
在冷却过程中，溶液会逐渐凝固成为琼脂凝胶。
注意事项：
1. 在制备琼脂溶液时，一定要使用干净的烧杯或容量瓶，并尽可能避免异物的污染。
2. 加入水时，最好使用蒸馏水或去离子水，以免影响实验结果。
3. 加热过程中要持续搅拌，以免出现结块和沉淀。
4. 在倒入容器之前，要等待溶液冷却至室温，以免出现变形和气泡。
总之，以上是一种简单易行的琼脂溶解方法。
在实验中使用时，请根据具体情况进行调整，并严格按照操作规程进行操作。
琼脂稀释法测抑菌率试验
琼脂稀释法测抑菌率一、试验原理目的在琼脂培养基中加入不同浓度的抑菌剂，配置成抑菌剂培养基，凝固后涂抹一定数量的菌悬液，根据增长情况计算出抑菌率。
最好在已知抑菌剂MIC的前体下做本试验减少无效操作。
二、试验器材、化学试剂及菌种培养皿、试管、5uL-50uL 微量移液器、100uL-1000uL微量移液器、以及配套的枪头、10mL离心管、麦氏比浊管、涂布棒、量杯、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、MH肉汤培养基、PBS缓冲液、无菌水。
菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌三、试验准备1、培养基的配置及工器具的灭菌称取营养琼脂培养基42g，蒸馏水900ml。
加热至澄清后，用量杯量取19ml 加入到大试管中，盖好塞子，同PBS缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。
将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。
实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
2、抑菌剂的配置抗菌药物的溶解与稀释，一般情况下，水溶性抗菌药物采用灭菌蒸馏水溶解，而对于不溶或者难溶于水的抗菌药物要根据其特性，采用甲醇，缓冲液，NaOH 溶液，DMSO溶液等，尽量将抗菌药物溶解后用蒸馏水或者缓冲液稀释后，作为抗菌药原液。
3.、菌悬液的配置从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。
吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌悬液悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第四支试管（即浓度约为103CFU/mL左右的菌悬液）待用。
四、试验步骤1、吸取2ml配置好的各稀释度抑菌剂加入到培养皿中，倒入冷却后试管中的培养基后迅速摇匀，（顺时针三圈逆时针三圈），待凝固。
琼脂稀释法
琼脂稀释法琼脂稀释法是一种常用的生物学实验方法，用于测定某种物质的活性和数量，包括蛋白质、抗原、抗体、染色体、微生物、核酸、细胞、等等。
它通过测定几种不同浓度的溶液的粘度来测定某种物质的活性和数量。
通过测定某比例琼脂溶液的粘度，便可以推断或测定该物质的活性和数量。
琼脂稀释法非常容易进行，原理也很简单：琼脂稀释法利用琼脂溶液测定某种物质（例如蛋白质、抗原、抗体）的活性和数量。
琼脂溶液的粘度随着溶质（即活性和数量）的增加而增加，随着溶质的减少而减少。
因此，通过测定某比例琼脂溶液的粘度，便可以推断或测定该物质的活性和数量。
琼脂稀释法的优势在于测定速度快、可以进行连续的快速稀释测定，并且API溶液和非API溶液均可测定，还可以实现高灵敏度的测定。
琼脂稀释法的缺点在于结果与标准值之间偏差比较大，而且试剂用量也比较大，需要特殊的设备进行测定。
琼脂稀释法用于做什么，首先要明确琼脂稀释法的原理，也就是通过琼脂溶液的粘度来测定活性和数量。
由于琼脂稀释法的灵敏度较高，可以进行高灵敏度的测定，所以它常常用于生物学实验、微生物分析、免疫学实验、蛋白质分析、检测病毒、抗原定量、细胞测定、基因定位等实验。
琼脂稀释法在实验中非常重要，因为它可以帮助科学家准确测定某些物质的活性和数量，进而推断出该物质对实验结果的影响。
此外，它还可以用于检测特定微生物、抗原、抗体、细胞等，以及评价抗生素等药物的有效性。
琼脂稀释法是实验中最为广泛的方法之一，它早已被广泛应用于生物学实验、免疫学实验、蛋白质分析、检测病毒、抗原定量、细胞测定、基因定位等实验中。
但是由于结果与标准值之间偏差较大，以及需要特殊的设备，所以它的应用仍然受到了一定的限制。
因此，在应用琼脂稀释法之前，科学家们有必要考虑其应用的可能性和局限性，以便于更好地发挥它的功效。
平板稀释法具体操作步骤
琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。
本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
1.培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。
淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。
2.含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
3.接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。
接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。
奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
4.结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
琼脂稀释法的具体步骤
琼脂稀释法的具体步骤
1. 先得准备好各种材料呀，就像厨师要准备食材一样！把琼脂呀、药液呀都准备齐全。
例子：你想想，做饭不准备食材能行嘛！
2. 然后要把琼脂融化咯，这可不能马虎，得慢慢搅拌均匀，就跟搅面糊似的。
例子：做蛋糕的时候面糊不搅匀能好吃吗？
3. 接着把药液加进去呀，要小心别洒出来，这可都是关键步骤呢！例子：倒水的时候不小心洒了多烦人呀！
4. 把混合好的倒在平板上，要平平稳稳的，可别晃出波浪来。
例子：端盘子不稳不就撒了嘛！
5. 等它凝固了，就像果冻一样，这时候就可以开始下一步啦。
例子：大家都见过果冻凝固吧！
6. 把细菌接种上去，要轻轻的，可别把琼脂弄破了。
例子：对待小宝宝是不是得轻点儿呀！
7. 然后把平板放好，让细菌好好生长，就像让小花朵慢慢开放一样。
例子：花不精心呵护能开得好吗？
8. 过一段时间观察结果，看细菌的生长情况，可有意思啦。
例子：就像观察小宠物的一举一动一样有趣！
9. 根据观察来判断药物的效果，这可需要仔细哟。
例子：找不同的时候不仔细能找到嘛！
10. 最后得出结论，知道哪种药最有效啦，是不是很神奇呀！例子：解开一个谜题是不是很有成就感！
我觉得琼脂稀释法虽然步骤不少，但真的很有趣也很重要呢，能帮助我们找到最有效的药物来对抗细菌。
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)|琼脂稀释法琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。
本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
1.培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。
淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。
2.含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
3.接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。
接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。
奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
4.结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50C左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。
本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
1.培养基制备使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。
淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1% 添加剂；其它链球菌使用含5% （V/V ）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。
琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）|琼脂稀释法2.含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50C水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1 : 9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8C冰箱可贮存5天。
3.接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1 ： 10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1〜2 u 1）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU,形成直径为5〜8mm的菌斑。
接种好后置35°C孵育16〜20h （甲氧西林耐药葡萄球苗、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h）, 观察结果。
奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
4.结果判断将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MICo 在含甲氧节胺曙呢或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
平板稀释法具体操作步骤
平板稀释法具体操作步骤琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加⼊融化并冷⾄50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌⽣长情况，以抑制细菌⽣长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。
本法优点是可在⼀个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费⼒。
1.培养基制备使⽤MH琼脂，按商品说明书进⾏配制，pH7.2~7.4。
淋病奈瑟菌使⽤GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使⽤含5%（V/V）绵⽺⾎的MH琼脂（当试验磺胺药时，使⽤溶解的马⾎）。
2.含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍⽐稀释的不同浓度的抗菌药物分别加⼊已加热溶解，并在45~50℃⽔浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平⽫，琼脂厚度3~4mm。
通常按1∶9⽐例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
配制好的含药琼脂平板应装⼊密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
3.接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦⽒标准⽐浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2µl）接种于琼脂平板表⾯，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。
接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。
奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%⼆氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
4.结果判断将平板置于暗⾊、⽆反光物体表⾯上判断试验终点，以抑制细菌⽣长的最低药物浓度为MIC。
在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌⽣长，与⽣长对照⽐较抑制80%以上细菌⽣长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落⽣长于含药浓度⾼于终点⽔平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长⽽⾼浓度药物琼脂平板上⽣长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
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抗菌药物保存液的准备2
抗菌药物稀释 选择合适的抗菌药物稀释液进行药物稀释,
稀释液需要量见下列公式：
抗菌药物实际称量*效价
稀释液体积= 保存液浓度（1920ug/ml）
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菌液准备4
如一次实验需完成50株或100株细菌,则细 菌要编上工作序号1-50或1-100,并在结果 记录纸上要一一对应写上工作序号和菌种 编号
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菌液准备1
生长法： 无菌环取4-5个菌落大小形态一致的菌落
顶部后接种于4-5mlMH肉汤内 35℃ 培养4-6小时到对数生长期，亦可过
夜培养,但不允许超过18小时 用肉汤/生理盐水校正至0.5麦氏管浓度1-
2X108CFU/ml
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菌液准备2
直接菌落悬浮法： 从孵育了18-24h新鲜培养物的平板上，用
无菌环取单个菌落 接种于无菌肉汤/生理盐水内 校正至0.5麦氏管浓度1-2X108CFU/ml 推荐用于苛氧菌和潜在的MRS
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菌液准备3
对绝大多数细菌来说,上述用生长法或直接 菌落悬浮法制备的0.5麦氏浊度的菌悬液, 应该再用无菌肉汤或生理盐水行1:10稀释, 此时菌液浓度为1-2*107CFU/ml,调整好 的菌液应该在制备后的15分钟内完成点种
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抗菌药物保存液的准备1
估算抗菌药物最小称量 琼脂稀释法最高药物浓度为128ｕg/ml 药物和培养基的体积比1:14,即药物浓度将成
15倍稀释，因此保存液为 128ｕg/mlΧ15 = 1920ｕg/ml
如果1次用量为10ml ,则: 抗菌药物最小称量= 1920ug/ml*10 ml 抗菌药物的效价
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原理：
将抗菌药物配制到琼脂培养基中成：128ｕ g/ml 、64ｕg/ml 、32ｕg/ml ……0.06ｕ g/ml对倍稀释的浓度系列
多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点 种到琼脂表面,经35℃16-20小时培养
肉眼观察细菌生长,以未见细菌生长平板的 最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)
琼脂稀释法药敏平板的制备 1
配制融化的MH琼脂或适合其他苛氧菌、 厌氧菌等特殊细菌的培养基,待冷却到4850℃，浇制药物平板。
取灭菌的90mm平板12只,用记号笔在平 板底部作好“点种标记”、“药物名称”、 “药物浓度”,浓度从0.06ｕg/ml……128 ｕg/ml,每种浓度1只平板共12个浓度系列。
抗菌药物保存液的准备3
实际操作： 先计算完成一批试验需几次完成,每次用量
多少,然后可一起称量,一起稀释,然后按每 次需要量分装在试管中,贴上标签,注明药 物名称,浓度,体积数及配制日期,置与≤20℃保存,备用。
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培养基
需氧菌 苛氧菌
移液管内剩余的1.5ml再加入到480ｕg/ml标记 的玻璃试管内;混匀后再吸取2.5ml
依次类推,直至最后一个0.06ｕg/ml标记的平皿 内加入1ml,则抗菌药物稀释完成
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琼脂稀释法药敏平板的制备4
准备2只无药的平板,作点种前和点种后质 控对照
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琼脂稀释法药敏平板的制备2
取11支无菌玻璃试管(13Χ100mm),每支 试管标记为： 960,480,240,120,60,30,15,7.5,3.75,1.87 5,0.935ｕg/m,并于上述每根管子中用无 菌移液管加无菌稀释液1.5ml
所有药物平板应保持表面干燥,不可有肉眼 可见的水珠(可在35℃孵箱内倒置平板开 盖烘干15-仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
琼脂稀释法药敏平板的制备5
如果需使用的药物平板为100Χ100mm的方平 板,则 每根玻璃管内需加入2.5ml的抗菌药物稀释液； 每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4.5ml 每只方平板应加入2ml抗菌药物试液 无菌吸管内应存留下2.5ml与下一个浓度的玻 璃试管内的2.5ml稀释液进行充分混匀 药敏培养基应加入28ml
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测试菌液的点种1
预先将点种针和点种板高压灭菌,并在孵箱内烘干 （52孔、100孔、或21孔）
将已调整好浊度(1-2Χ107CFU/ml)的菌液用微量 加样器将菌液依次加入菌液点种板小孔内,并作好 与药物平板相应的点种标记,一般每小孔内应加入 菌液270ｕl。每批试验均须保留有质控菌位置和 无菌菌液位置
厌氧菌
MH肉汤或琼脂
嗜血杆菌属：Haemophilus test medium base +补充因子SR158 链球菌属：MHA琼脂+5%脱纤维羊血
卡他莫拉菌属： MHA琼脂+5%脱纤维 羊血
淋球菌：CC Agar Base+L53
Wilkins chalgren anaerobe 琼脂
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琼脂稀释法药敏平板的制备3
将保存在≤-20℃冰箱中的1920ｕg/ml浓度的 抗菌药物保存液取出融化后,用无菌移液管吸取 2.5ml加入到128ｕg/ml标记的平板内1ml
移液管内剩余的1.5ml加入到960标记的试管内, 混匀后再吸取2.5ml加入到64ｕg/ml标记的平 板内1ml