最新整理粗蛋白质之定量法.ppt
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粗蛋白质测定(共18张PPT)
排气泡
添加吸收液
第13页，共18页。
5、按分析程序键进入分析工作菜单（必要时修改设置程序后再进入分析菜单）。 6、选择合适的分析程序，选择BLANK结果输出，做空白测定。 7、测定取得连续3个稳定的空白值。 8、转到结果菜单单项，选择合适的测定结果输出（注：一般可先做回收率测定）
分析程序
设置程序
选 择
B、 未滴定盐酸前的颜色
（2）、常量蒸馏法（下面是国产半自动定氮仪的蒸馏过程）
m
——试质量，g；
7、测定取得连续3个稳定的空白值。
7、清洗几分钟后，取出消化管，关断电源，做日常清洁保养。
（2）、常量蒸馏法（下面是国产半自动定氮仪的蒸馏过程）
消煮过程会产生大量二氧化硫，需在通风橱内进行消
煮
第4页，共18页。
样品测定，否则可能造成测定结果不准确，甚至测定失败。 （2）关安全门之前，必须确认样品质量已输入面板上，消化管顶部
二、操作步骤
1、试样的消煮：（1）称取试样0.5～１g，准确至0.0002 g，放入消化管中。
A 、称量纸在天平上调零
C、 天平调零后，把样本小心倒入消化管中
B 、 在称量纸上称样本
第1页，共18页。
D 、再称称量纸
（2）加入催化剂：硫酸钾6g，硫酸铜0.4g 。
A、 在普通天平上称硫酸钾6g
C、 已称好样本和催化剂的消化管
B、 在普通天平上称硫酸铜0.4g
第2页，共18页。
注：蔗糖可在普通天平上称重(0.5g)
（3）加入浓硫酸12ml,于420℃下在消煮炉上消化，直至呈透明的蓝绿色，再继续 加热至少0.5h。
消化过程颜色变化：黑色→黑褐色→红褐色→黄绿色→蓝绿色（终点颜色）
饲料中粗蛋白的测定PPT课件
CHENLI
7
• 氨的蒸馏 试样消煮液冷却后加入20mL蒸馏水，转入 100mL 容量瓶内，冷却后用水稀释至刻度，摇匀， 作为试样分解液。将蒸馏装置的冷凝管末端浸入 装有 20mL 硼酸吸收液和 2 滴混合指示剂的锥形 瓶内。蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数 滴、硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色， 否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10～20mL 注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进 样入口，塞好入口玻璃塞，再加入10mL氢氧化钠 溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃 塞塞好，且在入口处加水密封，以防漏气。蒸馏 4min后降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面， 再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均 流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。
CHENLI
19
滴定
用0.1mol/L的盐酸标准溶液进行滴定。
CHENLI
20
结果计算
• 粗蛋白质含量（%）=
CHENLI
13
• 氮的蒸馏
采用定氮仪，将带消化液的管子插在蒸馏 装置上，以 25mL 硼酸为吸收液，加入两 滴混合指示剂，蒸馏装置的冷凝管末端要 浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消化 管中加入 50mL 氢氧化钠溶液进行蒸馏。 蒸馏时间以流出的液体呈中性为宜，可用 pH试纸测试。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗 冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。
• NaOH：40% 水溶液，化学纯； • 硼酸：2% 水溶液，化学纯； • 混合指示剂； • 0.1mol/LHCl标准溶液； • 0.02mol/LHCl标准溶液； • 蔗糖：分析纯； • 硫酸铵：分析纯，干燥； • 硼酸吸收液。
CHENLI
5
仪器
• 实验用样品粉碎机或研钵； • 40目分析筛； • 分析天平； • 电炉； • 酸式滴定管； • 凯氏蒸馏装置； • 凯氏定氮装置
高级生化试验-实验一蛋白质定量分析ppt课件
计算
〔1〕规范管法〔规范比较法〕 实践测定过程中，用一知浓度的测定物
按测定管同样处置显色，读出吸光度，再根 据前式计算。
A规范/A样品= KC规范/ KC样品 C样品=A样品/A规范×C规范
A：吸光度；K：吸光系数；C：溶液浓度；L： 液层厚度
〔2〕规范曲线法
配制一系列知不同浓度 的测定物溶液，按测定 管同样方法处置显色， 分别读取各管吸光度。
测定管
0.1
5.0
实验三 紫外分光光度法
【根本原理】 Tyr and Trp包含不饱和的共轭双键，因此蛋白质具
有吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm波优点， 可利用该吸收峰值估计蛋白质浓度; 核苷酸是蛋白质样品中的主要污染成分, 其在280nm 处也有吸收峰, 但最大吸收峰值出如今 260nm;
Protein Conc (mg/ml)=1.45A280-0.74A260; A280/A260>1.5 (核苷酸的污染可以接受) ; 不够准确，但较为简便，样品可回收利用; 灵敏度：50-100μg
2．比尔〔Beer〕定律 一束单色光经过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介
质的浓度的添加呈指数减少。 LgI0/I=KC
I0 :入射光强度； I :透射光强度；C ：介质浓度 K：吸光系数
mbert-beer’s law
一束单色光经过某溶液时，光波被溶液吸收一部分， 吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。
2. 在试管架上有3中蛋白质样品 a. 规范血清，浓度70 mg/ml. 在Improved Lowry Assay中，用于 制备不同浓度的规范样品； b. 用于 Improved Lowry Assay的未知样品； c. 用于 Bradford assay的未知样品(勿稀释).。
饲料中粗蛋白质的测定
饲料中粗蛋白质的测定一、目的掌握饲料中粗蛋白质的测定方法，并测定饲料中粗蛋白质的含量。
二、原理饲料中纯蛋白质和非蛋白氮总称粗蛋白质。
凯氏法的基本原理是用浓H2SO4在还原性催化剂(CuSO4、K2SO4、Na2SO4等)的催化作用下消化饲料样本，使其中的蛋白质和非蛋白氮都变为NH４＋，NH４＋立即被浓H2SO4吸收成为(NH4)2SO4，(NH4)2SO4在浓碱作用下放出NH3，通过蒸馏，氨气随水蒸汽沿冷凝管流入硼酸吸收液被硼酸吸收并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿混合指示剂作指示剂，用标准HCL溶液滴定，求出氮含量，根据不同饲料再乘以一定的换算系数(通常用6.25计算)，即为粗蛋白质的含量。
上述原理的主要化学反应如下：2.(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3↑+2H2O+Na2SO43.H3BO３+NH3→NH4H2BO34.NH4H2BO3+HCL→NH4CL+H3BO3三、仪器设备1.实验室用样品粉碎机：40目网筛。
2.分析天平：感量0.0001。
3.电子天平: 感量0.001。
4. 六联电炉: 6×1000W。
5.改良式半微量凯氏定氮仪(图1)。
6.酸式滴定管:25ml。
7.凯氏烧瓶:100ml。
8.烧杯:250ml。
9.三角瓶:150ml。
10.容量瓶:100ml。
11.移液管:10ml。
12.量筒: 10ml 。
13.量筒:25ml。
四、试剂1.浓H2SO4：化学纯,含量为98%，无氮。
2.混合催化剂：CuSO4:Na2SO4=1:10 化学纯。
3.甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：0.1%甲基红酒精溶液与0.5%溴甲酚绿酒精溶液等体积混合，阴凉处保存期不超过三个月。
此混合指示剂在碱性溶液中呈蓝色，中性溶液中呈灰色，强酸性溶液中呈红色。
在硼酸吸收液中呈暗紫色，在吸收氨的硼酸溶液中呈兰色。
4.2%硼酸吸收液：溶2g化学纯硼酸于100ml蒸馏水中，加甲基红—溴甲酚绿混合批示剂0.4ml。
蛋白质的定量测定方法PPT课件
以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘 制出标准曲线。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下 测定其光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中 查出样品溶液的蛋白质含量。
第8页/共24页
【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
蛋白质染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定 的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2 分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏 度 高 ， 稳 定 性 好 ， 是 一 种 测 定 蛋第白20质页/含共量24页的 常 用 方 法 。
【实验材料】
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升 Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值 。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量。
第5页/共24页
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白
质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最
பைடு நூலகம்
广泛的方法之一。
第2页/共24页
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于／L氢氧化钠溶液中，再把 硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后 将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下 测定其光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中 查出样品溶液的蛋白质含量。
第8页/共24页
【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
蛋白质染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定 的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2 分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏 度 高 ， 稳 定 性 好 ， 是 一 种 测 定 蛋第白20质页/含共量24页的 常 用 方 法 。
【实验材料】
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升 Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值 。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量。
第5页/共24页
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白
质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最
பைடு நூலகம்
广泛的方法之一。
第2页/共24页
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于／L氢氧化钠溶液中，再把 硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后 将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
第二章蛋白质的定性定量分析【共54张PPT】
2. SDS-PAGE凝胶的制备
制备分离胶
制备浓缩胶
装板
加样
电泳
卸板并进行凝胶染色
3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素
➢ SDS 十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大 于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的 电荷差异
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。
对各种纯化蛋白质反应不同
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定
SDS与蛋白质之间的结合程度
SDS-PAGE基本原理
封闭非特异结合位点 注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；
Watch SDS-PAGE原理
Watch SDS-PAGE原理
80-100 ug/cm2
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白
+
pH 3
pH 7.5
Isoelectric Focusing
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
3–10
3–10NL 4–7 3–6
5–8
7–10
ReadyStripTM IPG Strips
最新实验一蛋白质含量测定ppt课件
生物化学与分子生物学基础实验
TU1800 紫外可见分光光度计
波长范围：200－1100nm 钨灯：340－1100nm
测光系统：单光束
氘灯：200－340nm
功能指标：光度测量 光谱扫描 定量测量
生物化学与分子生物学基础实验
注意事项
1 测紫外吸收要用石英比色皿 ！ 2 定量实验取液要准确。 3 从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要润 洗。 因此3ml溶液足够测定。 4 测量完毕，请把光度计的盖打开 ！ 5 每次实验时提交上一次的实验报告。
生物化学与分子生物学基础实验
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
实验步骤
0 1234567
标准蛋白（1mg/ml）ul 0 20 40 80 120 160 200 0
待测样品 ul
-
- - - - - - 200
蒸馏水 ul
1000 980 960 920 880 840 800 800
Folin-酚试剂甲 ml
3、所有的样品（包括标准样品），都必须在规定时间 内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出 的样品浓度与实际的浓度不符。
生物化学与分子生物学基础实验
722型光栅分光光度计
光 源
单 色
样
光
读
品
电
数
器
池
源
单
件元
测量完毕，请把光度计的盖打开 ！
讲解完毕后，每个组出一个同学去 127听老师讲解仪器使用。
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
• 酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙 醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。
蛋白质定性定量分析课件.ppt
2024/10/8
蛋白质定性定量分析课件
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蛋白质定性定量分析课件
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蛋白质定性定量分析课件
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蛋白质定性定量分析课件
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免疫印迹技术的基本操作(例PKC)
1、细胞裂解物的制备 2、细胞裂解液蛋白含量测定 3、细胞裂解物SDS－PAGE电泳 4、蛋白质转膜 5、目的蛋白的检测
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蛋白质定性定量分析课件
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蛋白质定性定量分析课件
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蛋白质定性定量分析课件
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蛋白质定性定量分析课件
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蛋白质定性定量分析课件
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Ve＝K1－K2logMr
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蛋白质定性定量分析课件
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蛋白质定性定量分析课件
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蛋白质定性定量分析课件
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方法的局限性： 1、在pH6～8的范围内，直线关系比 较好，在极端pH时因蛋白质变性而引 起偏离； 2、分子量与分配系数Kav有关，当蛋 白质的轴比较大时，会引起测定偏离；
蛋白质的含量测定
凯氏定氮法：1883年丹麦化学家 Kjeldhl建立，经后人改良后形成的一 种定量测定蛋白质最为精确、敏感的 方法。 原理：蛋白质的含氮量为16％，只要 测出样品中氮的含量，即可计算出蛋 白质的含量
样品中蛋白质的含量＝N×6.25
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蛋白质定性定量分析课件
1
凯氏定氮的基本流程： 1、消化：生物样品与浓硫酸共煮， 样品蛋白质被无机化，其中氮元素
蛋白质的定性定量分析及保存ppt课件.ppt
在 整 堂 课 的 教学中 ，刘教 师总是 让学生 带着问 题来学 习，而 问题的 设置具 有一定 的梯度 ，由浅 入深， 所提出 的问题 也很明 确
原理
➢蛋白质中的Trp、Tyr在 280nm有特征性吸收；肽键 在215nm附近有特异吸收。 可通过测定该波长的光吸收 度，计算蛋白质浓度。
➢C＝A/KL，其中A为吸光 度，K为摩尔消光系数，L 为光程。K值可通过各种方 法得到（包括软件分析等）。
芳香族氨基酸的紫外吸收
在 整 堂 课 的 教学中 ，刘教 师总是 让学生 带着问 题来学 习，而 问题的 设置具 有一定 的梯度 ，由浅 入深， 所提出 的问题 也很明 确
所需时间 • 几分钟
优 点 • 快速 • 对蛋白质无破坏性
缺 点 • 不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液
• 核酸可引起强干扰作用 灵 敏 度 • 0.2 mg/ml～2 mg/ml
在 整 堂 课 的 教学中 ，刘教 师总是 让学生 带着问 题来学 习，而 问题的 设置具 有一定 的梯度 ，由浅 入深， 所提出 的问题 也很明 确
基于蛋白质的化学显色反应
二、Bradford检测法
➢由Bradford等人于1976年建立 ➢ 这是一种迅速、可靠的通过染色法测 定溶液中蛋白质含量的方法
灵 敏 度 • 5 ug/ml～100 ug/ml
在 整 堂 课 的 教学中 ，刘教 师总是 让学生 带着问 题来学 习，而 问题的 设置具 有一定 的梯度 ，由浅 入深， 所提出 的问题 也很明 确
计算方法 • 标准曲线法
注意事项 • 在加入试剂30 min后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱
在 整 堂 课 的 教学中 ，刘教 师总是 让学生 带着问 题来学 习，而 问题的 设置具 有一定 的梯度 ，由浅 入深， 所提出 的问题 也很明 确
饲料中粗蛋白质的测定课件(共25张PPT)《畜禽营养与饲料》
模块七 饲料检测技术
单元二 饲料中粗蛋白质的测定
一、适用范围
二、测定原理
凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破 坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨 逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘 以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。
三、所需试剂
1、硫酸（GB 625） 2、混合催化剂 3、氢氧化钠（GB 629） 4、硼酸（GB 628） 5、混合指示剂 6、0.02mol/l盐酸标准溶液 7、蔗糖（HG 3—1001） 8、硫酸铵（GB 1396） 9、硼酸吸收液
六、分析步骤
（1）试样的消毒： 称取试样0.5~1g(含氮量5~80 mg)准确至0. 0002 g，放入凯氏烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均 匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热， 开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力(360~410℃ ) 直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。
取蔗糖 0.5g，代替试样，按以上步骤进行空白测定，消耗 0.02mol/L的盐酸标准溶液体积不得超过 0.3ml。
（三）分析结果的表述
1、计算结果如下式
2、重复性
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋白质含量在25%以上时，允许相对偏差为 1%。 当粗蛋白质含量在10%-25%之间时，允许相对偏差为2%。 当粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。
混合催化剂氧化钠溶液
蒸馏水
四、仪器设备
电子天平
滴定筒
牧医工程学院精品在线课程
通风橱内电炉及消煮架
锥形瓶
容量瓶
凯氏烧瓶
洗瓶
刻度吸管
移液管
单元二 饲料中粗蛋白质的测定
一、适用范围
二、测定原理
凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破 坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨 逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘 以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。
三、所需试剂
1、硫酸（GB 625） 2、混合催化剂 3、氢氧化钠（GB 629） 4、硼酸（GB 628） 5、混合指示剂 6、0.02mol/l盐酸标准溶液 7、蔗糖（HG 3—1001） 8、硫酸铵（GB 1396） 9、硼酸吸收液
六、分析步骤
（1）试样的消毒： 称取试样0.5~1g(含氮量5~80 mg)准确至0. 0002 g，放入凯氏烧瓶中，加入6.4g混合催化剂，与试样混合均 匀，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上加热， 开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力(360~410℃ ) 直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。
取蔗糖 0.5g，代替试样，按以上步骤进行空白测定，消耗 0.02mol/L的盐酸标准溶液体积不得超过 0.3ml。
（三）分析结果的表述
1、计算结果如下式
2、重复性
每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋白质含量在25%以上时，允许相对偏差为 1%。 当粗蛋白质含量在10%-25%之间时，允许相对偏差为2%。 当粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。
混合催化剂氧化钠溶液
蒸馏水
四、仪器设备
电子天平
滴定筒
牧医工程学院精品在线课程
通风橱内电炉及消煮架
锥形瓶
容量瓶
凯氏烧瓶
洗瓶
刻度吸管
移液管
粗蛋白分析
品放入蒸馏室， 即可自动蒸馏、 滴定、比色、换 算结果）。 蒸 馏 系 统
打 印 系 统
蒸 馏 管
比 色 滴 定 系 统
四、结果计算
14 6.25 1000
(V V0 ) C 1 粗蛋白%
V——
2
H 2 SO4
W
100
样品所耗标准酸体积(ml)
V0——空白所耗标准酸体积(ml)
**
样品处理注意事项
4.浓H2SO4的用量主要取决于称样的干物质的重量。 小于1g的干物质至少加3~8ml H2SO4，每增加1g干物 质需增加6~12ml H2SO4。
5.如果条件允许的话，样品加酸以后浸泡2小时或者
过夜更好。
三、测定步骤
2. 消解
将上述样品置红外消解炉 上200℃ 30分钟，直到样 品中没有大的结块，400℃ 30分钟，消解后溶液呈清 亮的蓝绿色 * 消煮的温度不能超过410℃，否则将剂。
**
样品处理注意事项
1.称样一定要精确，样品一定要均一，因为此方法用的是 半微量凯氏定氮法，样品用量较少。 2. 为防止样品粘在管壁上，应采用称量纸包样，直接将 投入消煮管底部，做空白时，带上称量纸，抵消其影响。
2.称样量大小决定于各类样品的含氮量。如健壮茎叶干样 含 氮 约 1~5% ， 称 样 应 为 0.2g ， 老 熟 秸 秆 干 样 含 氮 约 0.4~0.6%，称样量为0.5g，种子干样含氮约1~4%，称样 量应为0.2~0.5g，新鲜的茎叶样品可按干样称量的5倍称取。
蛋白质的常用定量法
物理法(折射率法、比浊法、放射性同位素法) 蛋 白 质 定 量 法
利用共性
凯氏法 双缩脲法 Lowry法 比 色 法
利用特定 氨基酸残基 紫外法 色素结合法
打 印 系 统
蒸 馏 管
比 色 滴 定 系 统
四、结果计算
14 6.25 1000
(V V0 ) C 1 粗蛋白%
V——
2
H 2 SO4
W
100
样品所耗标准酸体积(ml)
V0——空白所耗标准酸体积(ml)
**
样品处理注意事项
4.浓H2SO4的用量主要取决于称样的干物质的重量。 小于1g的干物质至少加3~8ml H2SO4，每增加1g干物 质需增加6~12ml H2SO4。
5.如果条件允许的话，样品加酸以后浸泡2小时或者
过夜更好。
三、测定步骤
2. 消解
将上述样品置红外消解炉 上200℃ 30分钟，直到样 品中没有大的结块，400℃ 30分钟，消解后溶液呈清 亮的蓝绿色 * 消煮的温度不能超过410℃，否则将剂。
**
样品处理注意事项
1.称样一定要精确，样品一定要均一，因为此方法用的是 半微量凯氏定氮法，样品用量较少。 2. 为防止样品粘在管壁上，应采用称量纸包样，直接将 投入消煮管底部，做空白时，带上称量纸，抵消其影响。
2.称样量大小决定于各类样品的含氮量。如健壮茎叶干样 含 氮 约 1~5% ， 称 样 应 为 0.2g ， 老 熟 秸 秆 干 样 含 氮 约 0.4~0.6%，称样量为0.5g，种子干样含氮约1~4%，称样 量应为0.2~0.5g，新鲜的茎叶样品可按干样称量的5倍称取。
蛋白质的常用定量法
物理法(折射率法、比浊法、放射性同位素法) 蛋 白 质 定 量 法
利用共性
凯氏法 双缩脲法 Lowry法 比 色 法
利用特定 氨基酸残基 紫外法 色素结合法
43饲料中粗蛋白的测定知识课件知识讲稿
2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2
二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸 作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
H2SO4＋2NH3 ＝ (NH4)2SO4
2/3/2022
二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量
1. 原理
② 蒸馏
2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O 2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液 将发生倒吸！
2/3/2022
二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量
3. 测定步骤 第二步 氨的蒸馏
注意事项：
凯氏定氮蒸馏过程中，要求整套装置呈密闭状态，蒸馏前应检查定氮仪各导 管间的连接处是否密闭，以免产生泄露；
测定样品前应清洗蒸馏装置，即用蒸馏水空蒸一次或数次；
空白试验：取与处 理样品相同量的硫 酸铜，硫酸钾，硫 酸按同一方法作试 剂空白试验。
2/3/2022
二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量
3. 测定步骤 第一步 样品消化
硫酸铜/无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）
（1）K2SO4或Na2SO4的作用：提高溶液的沸点而加快有机物的分解；
K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3
何计算出来的？）
2/3/2022
二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量
5. 方法的评价
✓ 凯氏法的优点是适用范围广，可用于
动植物的各种组织，器官、各种饲料 等成组复杂样品的测定，只要细心操 作都能得到较准确的结果，至今仍被 作为标准检验方法。但此法灵敏度低， 适用于0.2-1.0mg 氮，操作比较复杂， 所需时间长。
二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸 作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
H2SO4＋2NH3 ＝ (NH4)2SO4
2/3/2022
二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量
1. 原理
② 蒸馏
2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O 2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液 将发生倒吸！
2/3/2022
二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量
3. 测定步骤 第二步 氨的蒸馏
注意事项：
凯氏定氮蒸馏过程中，要求整套装置呈密闭状态，蒸馏前应检查定氮仪各导 管间的连接处是否密闭，以免产生泄露；
测定样品前应清洗蒸馏装置，即用蒸馏水空蒸一次或数次；
空白试验：取与处 理样品相同量的硫 酸铜，硫酸钾，硫 酸按同一方法作试 剂空白试验。
2/3/2022
二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量
3. 测定步骤 第一步 样品消化
硫酸铜/无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）
（1）K2SO4或Na2SO4的作用：提高溶液的沸点而加快有机物的分解；
K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3
何计算出来的？）
2/3/2022
二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量
5. 方法的评价
✓ 凯氏法的优点是适用范围广，可用于
动植物的各种组织，器官、各种饲料 等成组复杂样品的测定，只要细心操 作都能得到较准确的结果，至今仍被 作为标准检验方法。但此法灵敏度低， 适用于0.2-1.0mg 氮，操作比较复杂， 所需时间长。
4.7饲料中粗蛋白质含量测定 课件(共23张PPT)《动物营养与饲料》同步教学(中国农业出版社)
式中： V2 ——滴定试样消耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升（mL）； V1 ——滴定空白消耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升（mL）； c ——盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； M ——试样质量，单位为克（g）； 14 ——氮的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/moL）； 6.25——氮换算成粗蛋白的平均系数。
饲料中粗蛋白质含量测定
1 检测分析依据 2 检测分析原理 3 检测试剂材料 4 检测仪器设备 5 检测分析步骤 6 检测数据处理 7 检测清场工作
规定了测定饲料中粗蛋白质的凯氏定氮法
GB/T 6432-2018
适用范围
适用于饲料原料及饲料产品中粗蛋白质 的测定
方法广泛应用于粗蛋白质的检测
试样在催化剂的作用下，经硫酸消解，含氮 化合物转化成硫酸铵，加碱蒸馏使氨逸出，用硼 酸吸收，再用盐酸标准滴定溶液滴定，测出氮含 量，乘以6.25，计算出粗蛋白质含量。
硫酸铜的作用
（1）催化作用：加速有机物的氧化分解。 硫酸铜的作用机理如下： C+ 2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+CO2↑ Cu2SO4+2Ｈ2SO4 =2CuSO4 +SO2+2H2O
（2）消化终点指示剂：蓝绿色澄清透明 （3）做蒸馏时碱性指示剂
分析纯试剂 水：符合GB/T6682中规定的三级水
粉碎机
0.42mm孔径分析筛
吸量管 移液管
容量瓶
烧杯
1ml 3支
2ml 1支
5ml 2支
10ml 1支
20ml 1支
10ml 大肚移液管 1支
50ml 8个
100ml 2个
1000ml 2个 （透明棕色各一）
50ml 1个 500ml 4个 2000ml 1个
饲料中粗蛋白质含量测定
1 检测分析依据 2 检测分析原理 3 检测试剂材料 4 检测仪器设备 5 检测分析步骤 6 检测数据处理 7 检测清场工作
规定了测定饲料中粗蛋白质的凯氏定氮法
GB/T 6432-2018
适用范围
适用于饲料原料及饲料产品中粗蛋白质 的测定
方法广泛应用于粗蛋白质的检测
试样在催化剂的作用下，经硫酸消解，含氮 化合物转化成硫酸铵，加碱蒸馏使氨逸出，用硼 酸吸收，再用盐酸标准滴定溶液滴定，测出氮含 量，乘以6.25，计算出粗蛋白质含量。
硫酸铜的作用
（1）催化作用：加速有机物的氧化分解。 硫酸铜的作用机理如下： C+ 2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+CO2↑ Cu2SO4+2Ｈ2SO4 =2CuSO4 +SO2+2H2O
（2）消化终点指示剂：蓝绿色澄清透明 （3）做蒸馏时碱性指示剂
分析纯试剂 水：符合GB/T6682中规定的三级水
粉碎机
0.42mm孔径分析筛
吸量管 移液管
容量瓶
烧杯
1ml 3支
2ml 1支
5ml 2支
10ml 1支
20ml 1支
10ml 大肚移液管 1支
50ml 8个
100ml 2个
1000ml 2个 （透明棕色各一）
50ml 1个 500ml 4个 2000ml 1个
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有 N 機 K c 2 S o 4 2 C S O 物 n 4 4 O u c S H N 4 O 2 S 0 H 4 H 2 O C 2 O
- N C H H C R n O H 2 S 4 Δ O c a , t C a 2 l y S O s 2 t O H 2 O (N 4 ) 2 S 4H O
和鳥胺酸Ornithine ) 三聚氰胺
我們在檢驗食品中蛋白質時，往往只限於測定總氮量，然 後乘以蛋白質核算等數，得到蛋白質含量，實際上包括核 酸、生物鹼、含氮類脂、卟啉和含氮色素等非蛋白質氮化 合物，故稱為粗蛋白質量(crude protein)
原理
將含氮試料，以濃硫酸加熱分
Acid
解成為無機的硫酸銨
N 3 H H 2 S4 O N 4 2 S H 4 O H 2 S4O
粗蛋白質之定量法
器材及藥品 器材：
分析天平
分解瓶 球型吸管10ml 濾紙 蒸餾裝置： 玻璃安全管 直示冷凝管 平或圓底燒瓶
燒杯
蒸餾裝 三角瓶
六孔及三孔電熱包 MULTI-UNIT Mantle heater
定容瓶250ml
如微量凱氏定氮、雙縮脲反應、Folin-phenol試劑法(又名Lowry method)。
但因食品種類繁多，食品中蛋白質含量各異，特別是其他成 分，如碳水化合物、脂肪和維生素等干擾成分很多，因此蛋 白質的測定通常利用凱氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾， 用標準酸液吸收，用標準酸或鹼液滴定，由樣品中含氮量計 算出蛋白質的含量。
3. 30％ NaOH 取30 g NaOH加入70ml H2O攪拌溶解
4. 0.1N H2SO4(吸收液) 取0.69ml 36N H2SO4用水定容至250ml（※硫酸加入水中）
吸收液有：
A.0.05NH2SO4
用標準鹼返滴定，甲醛紅指示劑
B.硼酸
目前都H響用2指S硼O示4酸是劑吸強變收酸色液，範，要圍用求，硼較另酸嚴外代，硼替而酸H硼為2S酸O吸是4收，弱這液酸濃樣，度可在省在滴略3%定了以時反上，滴可不定將影， 氨完全吸收，為保險期間一般用4%。用HCl進行滴定，混合 指示劑
其次將銨離子（NH4+）以鹼中 和成為氨
以水蒸汽在鹼性下，將氨蒸餾 出來，同時以稀硫酸吸收
最後滴定稀硫酸的殘餘硫酸， 可以求得含氮量
再乘以該試樣之氮係數，所得 之值稱為粗蛋白質量(crude protein)。
消化(分解)
樣品與硫酸一起加熱消 化，硫酸使有機物脫水。 並破壞有機物，使有機 物中的C、H氧化為CO2 和H2O蒸汽逸出，而蛋 白質先分解為胺基酸， 再分解為氮，則與硫酸 結合成硫酸銨(NH4)2SO4 ， 留在酸性溶液中
到400 ℃，凱氏定氮法至今仍在使用。
由於食品中蛋白質含量不同，，凱氏法分為：
凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都 是一樣的。
凱氏法是測定總有機氮的最準確和操作較簡便的方法 之一。
實驗目的：
了解物質中蛋白質含量的測定方法 分解裝置的操作學習 了解各種凱氏定氮蒸餾裝置的操作練習 掌握凱氏定氮法的原理和操作技術
凱氏定氮法
此試而所法樣不以是，能只1來闡使88定明用3年HH量22K穀SSOOje物44l分分d中a解解h的l發有試蛋明機樣白，氮，質當化需，時合要他凱物較只氏生長知只成時用使氨 間H用的。2SHO反24S應分O歷解4來程試分，樣解， Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl (1849 – 1900) G樣u加nn快ing分改解進速的度辦，法因是為在溫消度化由時原加來入硫K酸2S沸O4點使的沸3點80上℃升上，升這
蒸餾吸收
因分解液中除了硫酸銨 外，尚含有很多其他分 解物質，所以蒸餾分解 液時，須添加氫氧化鈉 (NaOH)，使其在鹼性 條件下游離出氨氣 (NH3)，以供稀酸吸收 成硫酸銨而留在吸收液 中，方程式如下：
N 4 2 S 4 H N O a N O 4 H a 2 O H N S 3 O H
滴定管
量筒
球型吸管20ml 滴管
橡皮管 鐵架 橡皮塞
廢液管 石綿心網 玻璃彎管
蒸餾瓶 管路夾(3-4支)
粗蛋白質之定量法--藥品：
1. 濃硫酸（36N）：不可含(NH4)2SO4 2. 分解促進劑CuSO4：K2SO4 = 1：9
取10g CuSO4加90g K2SO4混合（以固態混合用研砵磨碎）
粗蛋白
酸分解
蛋白質測定的方法
測定蛋白質的方法很多，一般是根據蛋白質的理化特 性來進行定量的方法，這些方法可分為兩大類：
一類是利用蛋白質的物理化學性質
即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質含量如折射率、比重、 紫外吸收等測定得知，
另一類是利用化學方法測定蛋白質含量
利用蛋白質中特定胺基酸殘基、酸、鹼性基因和芳香基團等 測定蛋白質含量。
凱氏定氮法凱氏常量定氮法：源自由於食品中蛋白質含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微 量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。
步驟如下：
(1)消化：將含氮試料，以濃硫酸加熱分解成為無機的硫酸銨
(2)蒸餾：樣液中的硫酸銨在鹼性條件下釋放出氨，在這操作中， 一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。
滴定
游離出來之氨以定量之 稀硫酸中和吸收，再度 產生純的(NH4)2SO4，未 與氨中和之剩餘稀硫酸 則以定濃度之氫氧化鈉 滴定至中性。最後由氫 氧化鈉之滴定量，可得 知被中和之稀硫酸量， 進而換算出試料之總含 氮量(total nitrogen)。再 乘以該試樣品之氮係數， 所得之值稱為粗蛋白質 量(crude protein)。
(3)吸收：以水蒸汽在鹼性下，將氨蒸餾出來，同時以稀硫酸吸收
(4)滴定： 蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標準硫酸或標準鹽酸
溶液進行氨的吸收，然後再用標準氫氧化鈉溶液反滴定過剩 的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量。
(5)計算
氮的來源
生物體含氮化合物
蛋白質 少量的非蛋白質的含氮部分
醯胺化合物 生物鹼 含氮類脂 色素 卟啉 含氮碳水化合物(胺醣) 核酸、嘌呤、嘧啶及肌酸(creatine)等皆為含氮物質 非蛋白態胺基酸(游離胺基酸)及 尿素循環之胺基酸(瓜胺酸 citrulline
- N C H H C R n O H 2 S 4 Δ O c a , t C a 2 l y S O s 2 t O H 2 O (N 4 ) 2 S 4H O
和鳥胺酸Ornithine ) 三聚氰胺
我們在檢驗食品中蛋白質時，往往只限於測定總氮量，然 後乘以蛋白質核算等數，得到蛋白質含量，實際上包括核 酸、生物鹼、含氮類脂、卟啉和含氮色素等非蛋白質氮化 合物，故稱為粗蛋白質量(crude protein)
原理
將含氮試料，以濃硫酸加熱分
Acid
解成為無機的硫酸銨
N 3 H H 2 S4 O N 4 2 S H 4 O H 2 S4O
粗蛋白質之定量法
器材及藥品 器材：
分析天平
分解瓶 球型吸管10ml 濾紙 蒸餾裝置： 玻璃安全管 直示冷凝管 平或圓底燒瓶
燒杯
蒸餾裝 三角瓶
六孔及三孔電熱包 MULTI-UNIT Mantle heater
定容瓶250ml
如微量凱氏定氮、雙縮脲反應、Folin-phenol試劑法(又名Lowry method)。
但因食品種類繁多，食品中蛋白質含量各異，特別是其他成 分，如碳水化合物、脂肪和維生素等干擾成分很多，因此蛋 白質的測定通常利用凱氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾， 用標準酸液吸收，用標準酸或鹼液滴定，由樣品中含氮量計 算出蛋白質的含量。
3. 30％ NaOH 取30 g NaOH加入70ml H2O攪拌溶解
4. 0.1N H2SO4(吸收液) 取0.69ml 36N H2SO4用水定容至250ml（※硫酸加入水中）
吸收液有：
A.0.05NH2SO4
用標準鹼返滴定，甲醛紅指示劑
B.硼酸
目前都H響用2指S硼O示4酸是劑吸強變收酸色液，範，要圍用求，硼較另酸嚴外代，硼替而酸H硼為2S酸O吸是4收，弱這液酸濃樣，度可在省在滴略3%定了以時反上，滴可不定將影， 氨完全吸收，為保險期間一般用4%。用HCl進行滴定，混合 指示劑
其次將銨離子（NH4+）以鹼中 和成為氨
以水蒸汽在鹼性下，將氨蒸餾 出來，同時以稀硫酸吸收
最後滴定稀硫酸的殘餘硫酸， 可以求得含氮量
再乘以該試樣之氮係數，所得 之值稱為粗蛋白質量(crude protein)。
消化(分解)
樣品與硫酸一起加熱消 化，硫酸使有機物脫水。 並破壞有機物，使有機 物中的C、H氧化為CO2 和H2O蒸汽逸出，而蛋 白質先分解為胺基酸， 再分解為氮，則與硫酸 結合成硫酸銨(NH4)2SO4 ， 留在酸性溶液中
到400 ℃，凱氏定氮法至今仍在使用。
由於食品中蛋白質含量不同，，凱氏法分為：
凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都 是一樣的。
凱氏法是測定總有機氮的最準確和操作較簡便的方法 之一。
實驗目的：
了解物質中蛋白質含量的測定方法 分解裝置的操作學習 了解各種凱氏定氮蒸餾裝置的操作練習 掌握凱氏定氮法的原理和操作技術
凱氏定氮法
此試而所法樣不以是，能只1來闡使88定明用3年HH量22K穀SSOOje物44l分分d中a解解h的l發有試蛋明機樣白，氮，質當化需，時合要他凱物較只氏生長知只成時用使氨 間H用的。2SHO反24S應分O歷解4來程試分，樣解， Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl (1849 – 1900) G樣u加nn快ing分改解進速的度辦，法因是為在溫消度化由時原加來入硫K酸2S沸O4點使的沸3點80上℃升上，升這
蒸餾吸收
因分解液中除了硫酸銨 外，尚含有很多其他分 解物質，所以蒸餾分解 液時，須添加氫氧化鈉 (NaOH)，使其在鹼性 條件下游離出氨氣 (NH3)，以供稀酸吸收 成硫酸銨而留在吸收液 中，方程式如下：
N 4 2 S 4 H N O a N O 4 H a 2 O H N S 3 O H
滴定管
量筒
球型吸管20ml 滴管
橡皮管 鐵架 橡皮塞
廢液管 石綿心網 玻璃彎管
蒸餾瓶 管路夾(3-4支)
粗蛋白質之定量法--藥品：
1. 濃硫酸（36N）：不可含(NH4)2SO4 2. 分解促進劑CuSO4：K2SO4 = 1：9
取10g CuSO4加90g K2SO4混合（以固態混合用研砵磨碎）
粗蛋白
酸分解
蛋白質測定的方法
測定蛋白質的方法很多，一般是根據蛋白質的理化特 性來進行定量的方法，這些方法可分為兩大類：
一類是利用蛋白質的物理化學性質
即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質含量如折射率、比重、 紫外吸收等測定得知，
另一類是利用化學方法測定蛋白質含量
利用蛋白質中特定胺基酸殘基、酸、鹼性基因和芳香基團等 測定蛋白質含量。
凱氏定氮法凱氏常量定氮法：源自由於食品中蛋白質含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微 量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。
步驟如下：
(1)消化：將含氮試料，以濃硫酸加熱分解成為無機的硫酸銨
(2)蒸餾：樣液中的硫酸銨在鹼性條件下釋放出氨，在這操作中， 一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。
滴定
游離出來之氨以定量之 稀硫酸中和吸收，再度 產生純的(NH4)2SO4，未 與氨中和之剩餘稀硫酸 則以定濃度之氫氧化鈉 滴定至中性。最後由氫 氧化鈉之滴定量，可得 知被中和之稀硫酸量， 進而換算出試料之總含 氮量(total nitrogen)。再 乘以該試樣品之氮係數， 所得之值稱為粗蛋白質 量(crude protein)。
(3)吸收：以水蒸汽在鹼性下，將氨蒸餾出來，同時以稀硫酸吸收
(4)滴定： 蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標準硫酸或標準鹽酸
溶液進行氨的吸收，然後再用標準氫氧化鈉溶液反滴定過剩 的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量。
(5)計算
氮的來源
生物體含氮化合物
蛋白質 少量的非蛋白質的含氮部分
醯胺化合物 生物鹼 含氮類脂 色素 卟啉 含氮碳水化合物(胺醣) 核酸、嘌呤、嘧啶及肌酸(creatine)等皆為含氮物質 非蛋白態胺基酸(游離胺基酸)及 尿素循環之胺基酸(瓜胺酸 citrulline