实验二细菌单染与复染
实验二细菌的单染色及革兰氏染色
掌握染色步骤
选择适当的染料，对细菌进行固定、 染色、脱色、复染等步骤，确保染色 效果良好。
掌握革兰氏染色技术
了解革兰氏染色的原理
革兰氏染色是一种用于区分革兰氏阳 性菌和革兰氏阴性菌的染色技术。
掌握染色步骤
在涂片上涂抹细菌，然后使用结晶紫 、碘液和酒精等染料进行染色和脱色
，最后用番红和石炭酸复染。
识别染色结果
革兰氏染色结果分析
染色反应
革兰氏染色可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类 ，通过染色反应可以初步判断细菌的致病性。
颜色变化
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色，通过颜色变化可以判 断细菌类型。
染色准确性
革兰氏染色准确性较高，对于初步鉴别细菌种类具有重要意义。
实验结果在细菌鉴别中的应用
初步鉴别
通过单染色和革兰氏染色实验结果，可以对细菌进行初步鉴别，确 定可能的致病菌种类。
辅助诊断
在临床诊断中，细菌鉴别对于确定感染源、选择合适的治疗方案具 有重要意义。
科研应用
在科研领域，细菌鉴别可以为研究不同类型细菌的生物学特性、致病 机制等提供基础数据。
06
CATALOGUE
注意事项与实验改进
实验注意事项
实验前需确保实验室环境清洁 ，避免污染。
使用显微镜时，应确保镜头清 洁，以免影响观察效果。
在操作过程中，应避免细菌污 染，尤其是避免交叉污染。
实验结束后，应按照实验室规 定正确处理废弃物。
实验操作技巧与难点解析
01 涂片时，应保证涂片均匀，避免产生气泡 。
02 染色时，应控制染色时间，避免染色过度 或不足。
情况。
02
CATALOGUE
实验原理
实验二细菌单染色及革兰氏染色法
该方法通常使用结晶紫、姬姆萨 染料或瑞氏染料等染料进行染色。
染色过程中，染料能够进入细菌 细胞内，与细胞成分结合，使细
菌着色。
革兰氏染色法原理
革兰氏染色法是一种用于区分革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的染
色方法。
该方法通过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料和试剂，对细菌进行 初染、媒染、脱色和复染等步骤。
将涂片放入复染液中， 使细菌重新染色。
水洗
用流水冲洗涂片，去 除染色液。
干燥
将涂片自然干燥或用 吸水纸吸干。
结果观察与记录
在显微镜下观察染色后的细菌涂片，记录观察到的细菌形态、染色深浅等特征。 根据观察结果，判断细菌的革兰氏染色反应，即阳性或阴性。
记录实验数据和结果，并进行分析和解释。
05
实验结果与分析
细菌单染色结果分析
01
02
03
染色效果
通过细菌单染色，可以清 晰地观察到细菌的形态、 大小和排列情况，为后续 分析提供基础。
染色方法
本实验采用了结晶紫染色 法，该方法操作简便，染 色效果稳定。
注意事项
在染色过程中，需严格控 制染色时间，避免染色过 度或不足，影响观察效果。
革兰氏染色结果分析
染色效果
熟悉染色法的操作流程
细菌单染色法的操作流程
制备细菌涂片→加温固定→加染料染色→水洗→干燥→观察。
革兰氏染色法的操作流程
制备细菌涂片→加结晶紫染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→水洗→沙 黄复染→水洗→干燥→观察。
了解染色结果与细菌特性的关系
细菌单染色法的染色结果
通过观察染色后的细菌，可以初步判断细菌的形态和大小，有助于鉴别细菌种类 。
革兰氏染色法的染色结果
实验2 细菌的染色和形态观察
微生物学实验二
细菌的染色和形态观察
（验证性实验）
微生物学教研室 郭棵棵
实验内容
上节课实验结果观察
显微镜油镜头的使用与保护
示教：细菌的基本形态与特殊结构的观察
操作：单染色、革兰染色 材料：葡萄球菌、大肠杆菌肉汤培养物 载玻片 2张 /人 1支/6人
教学目标
了解：
1.显微镜油镜镜头的使用与保护
革兰染色的原理：
等电点学说
化学学说 通透性学说
等电点学说：
革兰阳性菌的等电点（PI 2-3)比革 兰阴性菌的等电点(PI 4-5)低，在pH=7 的染液中，革兰阳性菌所带的负电荷比 阴性菌多，因而摄取碱性染料比较多且 牢固，不易被酒精脱色。
化学学说 ：
革兰阳性菌的细胞内含有某些特殊化 学物质，一般认为是核糖核酸镁盐，能与 染料和碘液结合成为稳定的化学物，不易 被酒精溶解脱色。
思考题
1. 革兰染色的过程如何？
2. 有时候革兰阳性菌被染成革兰阴性菌的色调，
这是为什么？
革兰染色的步骤
1：制片 3：固定 2：干燥 4：染色： 初染：结晶紫 1分钟
媒染：碘液
脱色：95%酒精
1分钟
半分钟
复染：稀释复红
半分钟
革兰染色结果判断
紫
球
碘
阳
酒
杆
红,
阴,
一
阳
一
紫
半
阴半Leabharlann 红脑 淋 卡，白 抗 胞 除外
革兰氏染色的意义：
将细菌分为革兰阳性、阴性两大类。
分析细菌的致病性。 指导临床用药。
革兰染色法过程
1、涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后刮取菌 苔在盐水中乳化，涂成直径约为0.5cm 的膜。 2、干燥：在远离火焰上方微微烘干。 3、固定：火焰固定。 4、革兰染色过程： 初染：结晶紫 1分钟 媒染： 碘液 1分钟 脱色： 95%酒精 半分钟 复染： 稀释复红 半分钟 5、镜检：阳紫阴红 球阳杆阴
实验二细菌革兰氏染色
（一）革兰氏染色 涂片—风干—固定—初染—水洗—媒染—水洗—
脱色—水洗—复染—水洗—干燥—镜检
菌悬液
涂片
干燥
滴加无 菌水
取菌苔
涂片
固定
Smear preparation
Heat fixing
Staining
crystal violet stain
wash with water
Counterstain with Safranin
3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。
4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色
成分
肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质源自占细胞壁干重的%革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等 4、标本片：芽孢、荚膜、孢子丝
四、实验方法
注意事项：
（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀， 固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色 时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革 兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。
（3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。 （4）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。
实验二细菌的简单染色与革兰氏染色
通过显微镜观察，判断细菌是否着色，从而初步判断细菌的种类。
了解革兰氏染色的原理和操作方法
了解革兰氏染色的原理
了解染色结果
通过使用两种不同的染料，使细菌呈 现不同的颜色，从而区分革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌。
通过显微镜观察，判断细菌是否被染 色以及呈现的颜色，从而确定细菌的 革兰氏类型。
革兰氏染色的目的是区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，因为这两种类 型的细菌在染色结果上存在明显的差异。
03 实验材料
菌种察。
金黄色葡萄球菌
另一种常见的细菌样本，具有不 同的染色特性。
染色液
结晶紫染色液
用于细菌的简单染色。
革兰氏染色液
用于区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
简单染色的原理是利用染料对细菌的亲和力不同，将细菌染成不同的颜色，从而区 分不同类型的细菌。
简单染色方法简便、快速，但染色效果不如革兰氏染色。
革兰氏染色原理
革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，通过使用结晶紫、碘液和酒精 等染料对细菌进行染色。
革兰氏染色的原理是利用结晶紫和碘液对细菌的亲和力不同，将细菌染 成紫色或红色，再通过脱色剂酒精将细菌脱色，最后用番红和碘液复染。
其他试剂和器材
显微镜
用于观察染色后的 细菌。
酒精灯和接种环
用于加热染色液和 接种细菌样本。
无菌水
用于清洗玻片和细 菌样本。
载玻片和盖玻片
用于放置和观察细 菌样本。
吸管和滴管
用于吸取染色液和 其他试剂。
04 实验步骤
细菌的简单染色
01
02
03
涂片制作
将细菌均匀涂在载玻片上， 晾干后进行染色。
染色
出细菌的细胞壁结构特点。
实验二++细菌的形态学检查(1)
实验二细菌的形态学检查【目的和要求】1．熟悉细菌染色的常用染料和一般程序。
2．掌握革兰染色的方法、原理、结果观察及意义。
3．熟悉不染色标本检查法（压滴法和悬滴法）的方法与结果观察。
4．熟悉细菌的特殊染色法。
【试剂与器材】1．菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌。
2．试剂：革兰染色液、细胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理盐水等。
3．其他：载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂等。
【实验内容】一、细菌染色的一般程序细菌染色法分单染法和复染法。
单染法是用一种染料去染，所有细菌都染成一种颜色；复染法是用多种染料对细菌进行染色，不同细菌可染成不同的颜色。
大部分细菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根据实验目的选择不同的染色方法，在实际工作中，应用最广泛的是革兰染色法。
二、革兰染色1．染色原理（1）等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pI2～3）比革兰阴性菌（pI4～5）低，在同一pH条件下革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合性牢固，不易脱色。
（2）化学学说：革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%酒精脱色；而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。
（3）通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层较厚，含脂质少，脱色时，乙醇不易进入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘复合物渗出。
而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层较薄，含脂质多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色。
2．方法（1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。
用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。
（2）干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。
初中八年级(初二)生物 实验二细菌的简单染色、革兰氏染色
实验二细菌的简单染色、革兰氏染色虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。
由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。
当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。
而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。
一、目的要求1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
2．巩固显微镜的使用方法。
二、基本原理1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。
碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。
例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。
常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。
细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。
2.革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
细菌单染色法实验报告
细菌单染色法实验报告引言。
细菌单染色法是一种常用的实验方法，用于观察和分析细菌的形态和结构特征。
本实验旨在通过单染色法对大肠杆菌进行染色处理，然后观察其形态结构特征，为后续的细菌实验研究提供基础数据。
材料与方法。
1. 实验材料：大肠杆菌培养液。
甲醇。
碘酒。
碱性溶液。
碱性洗涤液。
蓝色染色液。
95%乙醇。
水平台。
无菌玻璃片。
2. 实验步骤：1）取一滴大肠杆菌培养液涂抹在无菌玻璃片上，晾干。
2）用甲醇固定玻片上的细菌，然后在水平台上滴加碘酒，静置1分钟。
3）倒掉碘酒，用碱性溶液洗涤玻片，然后用碱性洗涤液洗涤。
4）将蓝色染色液滴在玻片上，静置1分钟，然后用95%乙醇洗涤。
5）将玻片晾干后，用油镜装片，用显微镜观察细菌的形态和结构特征。
结果。
经过染色处理后，观察到大肠杆菌呈现出长圆柱形，长度约为2-3微米，直径约为0.5微米。
细菌细胞呈现出蓝色，细胞壁清晰可见，细胞内部呈现出均匀的染色。
讨论。
细菌单染色法是一种简单有效的方法，通过染色处理可以清晰地观察到细菌的形态和结构特征。
在本实验中，大肠杆菌呈现出典型的长圆柱形，这与其在生物学上的特征相符合。
染色后的细菌细胞壁清晰可见，细胞内部染色均匀，为后续的细菌研究提供了基础数据。
结论。
通过细菌单染色法的实验操作，成功地对大肠杆菌进行了染色处理，并观察到了其形态和结构特征。
这为后续的细菌实验研究提供了重要的基础数据。
细菌单染色法是一种简单有效的实验方法，可用于观察和分析细菌的形态和结构特征，对于细菌研究具有重要的意义。
实验二 细菌革兰氏染色法
实验三细菌革兰氏染色法一、目的要求1. 掌握油镜的原理和使用方法；2. 了解革兰氏染色原理；3. 学习并掌握革兰氏染色的方法。
二、基本原理1. Gram与革兰氏染色革兰氏染色（Gram stain）是以丹麦医生Hans Christain Joachim（1853-1938）的名字命名的。
Gram在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时发现某些细菌对特定染料有很高的亲和力。
革兰氏染色法的基本步骤是：a．初染：结晶紫染色；b．媒染：碘液媒染；c．脱色：乙醇脱色；d．复染：番红复染。
经过这样的染色后，发现肺炎球菌保持蓝紫色，肺部组织背景为浅黄色，达到了将细菌与被感染的肺部组织区分开的目的。
几年以后，德国病理学家Carl Weigert （1845-1904）在Gram染色方法基础上加上番红复染，使其成为微生物学研究领域最常用的染色方法之一。
2. 基本原理革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。
然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。
之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。
而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。
三、实验用品准备：灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器四、操作：1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
细菌单染色法实验报告
细菌单染色法实验报告
实验目的，通过细菌单染色法，观察和分析细菌形态结构，为细菌的鉴定和分
类提供基础数据。
实验材料和方法：
1. 实验材料，大肠杆菌培养液、甲醇、青霉素、蒸馏水、无菌玻璃片、炉头、
染色盒、显微镜等。
2. 实验方法：
a. 取一滴细菌培养液放在玻璃片上，用火炉加热烘干。
b. 用甲醇固定，将甲醇滴在细菌上，使其固定在玻璃片上。
c. 用青霉素染色，将青霉素滴在细菌上，静置1分钟。
d. 用蒸馏水冲洗，将蒸馏水滴在细菌上，冲洗去除多余的染色剂。
e. 用滤纸吸干，用火炉加热干燥。
f. 将玻璃片放在显微镜下观察。
实验结果：
经过细菌单染色法处理后，观察到细菌呈现出明显的形态特征，包括大小、形状、排列方式等。
通过显微镜观察，可以清晰地看到细菌的细胞壁、细胞质等结构。
实验分析：
细菌单染色法是一种简单、快速的染色方法，可以使细菌在显微镜下呈现出明
显的形态特征，为后续的鉴定和分类提供了重要的参考。
通过本次实验，我们成功地观察到了大肠杆菌的形态特征，为我们进一步了解和研究细菌提供了重要的数据支持。
实验总结：
细菌单染色法是一种常用的细菌染色方法，通过简单的步骤，可以使细菌在显微镜下呈现出清晰的形态特征。
本次实验取得了良好的实验效果，为我们进一步研究细菌提供了重要的基础数据。
在今后的实验中，我们将进一步应用这一方法，深入了解和研究不同类型的细菌，为微生物学研究提供更多的支持和数据。
实验二细菌的单染色
实验二细菌的单染色、革兰氏染色及芽孢染色实验二细菌的单染色、革兰氏染色及芽孢染色一、实验目的1. 掌握细菌的涂片技术。
2. 掌握细菌单染色、革兰氏染色和芽孢染色技术。
3. 初步学习无菌操作技术。
二、实验内容1. 学习细菌单染色革兰氏染色和芽孢染色的操作技术。
2. 初步学习无菌操作技术。
三、实验材料和用具大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)的斜面菌种。
吕氏美蓝染色液、革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液、香柏油、擦镜液、无菌水；显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸等。
四、操作步骤（一）细菌的单染色1．涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。
2．干燥将涂片于室温中自然干燥。
3．固定手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。
在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。
不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。
4．染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。
5．水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。
6．干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体7．待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察（二）细菌的革兰氏染色1．涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。
涂菌后将接种环火焰灭菌。
2．干燥于空气中自然干燥。
亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。
3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。
【微生物学实验】实验二 细菌的单染色与革兰氏染色
• 染色剂 • 草酸铵结晶紫染液 • 卢戈氏碘液 • 95%乙醇 • 番红染色液 • 仪器或其他用具 • 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。
操
作
步
采用三区涂片法制片
骤
大肠杆菌
大肠杆菌与枯草芽孢杆菌 混合涂片
枯草芽孢杆菌
操 作 步 骤
萌发芽孢的枯 草芽孢杆菌
大肠杆菌
大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合涂 片油镜下形态（革兰氏染色）
• 实验结果
• 列表说明你所观察到的细菌形状、颜色和 革兰氏染色反应。
菌种
形态
Байду номын сангаас颜色
结果（Ｇ＋、Ｇ－）
• 思考题 • 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正 确性？其中最关键的环节是什么？
大肠杆菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合涂片大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合涂片油镜下形态革兰氏染色大肠杆菌萌发芽孢的枯草芽孢杆菌实验结果列表说明你所观察到的细菌形状颜色和革兰氏染色反应
实验二 细菌的单染色及革兰氏染色
（一）简单染色法 • 目的要求
• 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌 的简单染色法；
• 巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技 术。
• 基本原理
• 借助物理因素（如：细胞及细胞物质对染料的 毛细现象、渗透、吸附作用等）和化学因素 （如：正负离子之间的相互吸引等）的作用而 进行的。
• 实验器材 • 菌种 • 藤黄八叠球菌 • 染色剂 • 草酸铵结晶紫染液 • 番红染液 • 仪器或其他用具 • 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。
实验二：细菌涂片的制备和染色镜检1
革兰氏染色法过程示意图 革兰氏染 色法动画
细菌的单染色
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
染色1~2min
细菌形态与结构检查法
显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能
直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、 电子显微镜）放大后才能观察。
染色法——细菌体小半透明，经染色后才能
观察较清楚。
显微镜放大法
芽胞染色原理：细菌的芽孢壁比营养 体的细胞壁结构复杂而且致密，透性 低，着色和脱色都比营养体细胞困难。
方法：采用碱性染料微加热着染或延长染 色时间，使营养体（菌体）和芽胞都着色 后，再脱去营养体细胞的颜色而保留芽胞 的颜色，再用其他颜色的染液着染营养体 方法，并可在显微镜下区别。
孔雀石绿—沙黄法染色步骤
1、要用幼龄培养物作革兰染色； 2、涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳性
革兰阳性菌：细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致
密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与 碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫 色。
革兰阴性菌：细胞壁肽聚糖层薄，网状结构交联少，类脂含量较
普通光学显微镜(light microscope)
普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于 0.25um，故可用普通光学显微镜观察。
显微镜放大法
电子显微镜(electron microscope)
电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形， 内部超微结构可一览无余。
荚膜
肺炎链球菌荚膜
透射电镜
扫描电镜
细菌的大小与形态
观察细菌常用光学显微镜，其大小用测 微尺在显微镜下进行测量，以微米(μm) 为单位。不同种类的细菌大小不一，同 一种细菌也因菌龄和环境因素的影响而 有差异。 球菌
细菌单染色法实验报告
细菌单染色法实验报告实验报告：细菌单染色法实验目的：本实验旨在了解细菌的基本特征、分离方法和单染色法的操作步骤，达到掌握基本的细菌学实验操作技能的目的。
实验材料和设备：培养基：nutrient agar medium菌液：大肠杆菌（Escherichia coli）理化反应器材：培养皿、酒精灯、移液管、镊子、显微镜、染色剂实验步骤：1.取培养皿，将20ml的nutrient agar medium倒入培养皿中，均匀摇匀，培养皿放置到无菌座上。
2.用均质的大肠杆菌籽数微量滴在培养皿表面，倾斜培养皿让菌液均匀涂布在培养基表面上，避免空气震荡。
3.将培养皿加盖，并在37℃温度下孵育18-24小时，待菌落形成。
4.取无菌的玻片片上，用滴管吸取适量静态培养的大肠杆菌稀释，滴至玻片表面，然后用搅拌杆均匀地把菌液涂布于玻片表面,让其均匀分布，晾干。
5.将干燥后的玻片放置于酒精灯上烘烤3-5秒钟，在显微镜下观察。
6.将玻片在蒸馏水中烫一下，滴一滴甲基紫液，加热过程中淋涂蒸馏水，颜色变浅停止加热，静置1分钟。
7.再将玻片漂洗干净，用酒精洗一下，用酒精背面烘烤干,在显微镜下进行观察。
实验成果：1.孵育完毕后经观察，nutrient agar medium表面菌落的数量和大小均匀分布，无杂菌污染。
2.染色处理后，在显微镜下观察到玻片表面有清晰明亮的该种细菌，细胞大小及数量均匀。
结果分析：本次实验成功地将大肠杆菌进行分离，通过单染色法技术，观察到大肠杆菌在玻片表面生长的细胞形态。
注意事项：1.实验前，先做好安全和无菌操作。
2.氧气、灰尘、霉菌、游离病原微生物都会影响结果，要多加注意。
3.培养皿倒入时要快速并均匀，以免培养基固化。
4.染色加热时间过长或过短都会影响颜色和分辨率，要注意加热过程。
结论：细菌单染色法是一种基本的细菌学实验，成功地将大肠杆菌进行了分离和染色处理。
它是对细菌结构形态、分布情况的观察研究，为后续细菌学研究打下基础。
实验二细菌的革兰氏染色
实验二细菌的革兰氏染色一.实验目的1.了解革兰氏染色原理并掌握其操作。
2.巩固无菌操作技术及显微镜使用方法。
二.实验原理革兰氏染色法能将细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
在用乙醇进行脱色时，两种菌的细胞壁结构不同，阳性菌细胞壁为网状结构，比较厚，结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，而阴性菌细胞壁比较薄，颜色更容易洗脱出来，所以最终革兰氏阴性菌为红色，阳性菌为紫色。
三.仪器、试剂与材料1.菌种：枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌属25922。
2.染色液和试剂：结晶紫、碘液、番红、95%的乙醇、沙黄、香柏油、二甲苯、蒸馏水。
3.器材：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、滴管、吸水纸四.实验步骤1.染色步骤：（1）制片：接种环蘸取细菌液置于载玻片，酒精灯外焰加热玻片进行细菌固定。
（2）初染：添加结晶紫染色，1min后倾去染色液，蒸馏水冲洗至无色。
（3）媒染：吸干残留蒸馏水后，加入一滴碘液，作用1min，水洗。
（4）脱色：吸干残液后，加入95%酒精进行脱色，30s后水洗。
（5）复染：吸干残液后，用番红液复染，1min后，水洗。
（6）镜检：吸干残液后，低倍镜寻找目标物体，再用高倍镜放大目标物，目标视野添加香柏油进行观察。
2.平板划线（1）左手中指、无名指和小拇指托住无菌平皿。
（2）盖子用食指和拇指掰开，右手持接种环进行第一区划线。
（3）酒精灯灼烧接种环至通红，晾凉后进行第二区划线（4）重复（3）进行第三、四区划线（5）将平皿置于适宜温度的培养箱培养过夜。
五.结果与讨论1.革兰氏染色结果图1为显微镜下的染色结果，从结果可以看出，这是革兰氏阳性菌，也就是我们所用的实验材料之一枯草芽孢杆菌，不过红色比较零星，这可能是因为我们在清洗载玻片的时候不小心清洗过度，将一部分细菌冲洗掉了，所以效果并不是很好。
图1 枯草芽孢杆菌而我们所用的另外一个实验材料大肠埃希氏菌属25922理论上说应该是革兰氏阴性菌，这也就意味着最终显微镜下看到的颜色应该是紫色，但是试验最后我们只观察到一片白色，回过头来思考原因，这可能是因为我们在吸干载玻片的过程中用力过猛用纸巾把细菌给擦去了，所以最后细菌都没了，也就没有染上相应的颜色。
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革兰氏染色结果及细菌分类
细菌细胞结构
革兰氏染 色阴性
Left: 单菌染色结果 (G+或 G-)
Right: 混合菌染色结果 (G+和 G-)
五、实验结果
文字记录所观察到的革兰氏染色 结果的差别，判断是G－/ G＋。 绘图描述各菌形态（可在一个视 野中）。
六、问题与讨论
1革兰氏染色涂片为何不宜太浓厚？ 实验关键步骤？ 2对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样才能确证你的结论正确？
实验二 细菌简单染色法 革兰氏染色法
一、目的要求
1．巩固油镜的使用方法； 2．学习微生物涂片、染色基本技术，掌握细 菌的简单染色法； 3．学习、掌握细菌的革兰氏染色法； 4．建立“无菌操作”的概念，学习其技术。
二、实验原理
简单染色法：是利用单一染料对细菌进行 染色的方法，常用碱性染料。只能观察微 生物的大小、形状、和细胞排列状况，但 不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。 复染色法：用两种或两种以上染色液进行 染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称 鉴别染色法。常用的有： 革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、 鞭毛染色法等。
三、实验材料
变形杆菌、表皮葡萄球菌
载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲 苯、擦镜纸、吸水纸等。 革兰氏染色液一套
四、实验步骤
1．简单染色 载玻片——中心加半滴水——无菌操作取菌——涂布于 水中使均匀并成薄膜状——干燥——火焰固定——染色 （1~2min）——水洗——干燥——镜检 2.革兰氏（Gram）染色 涂片——干燥——固定——结晶紫初染（1~2min） ——水洗——碘液媒染1min——水洗——95%酒精脱色 （约20－30秒）——立即水洗——番红复染约2分钟— —水洗——干燥——镜检 （混合涂片染色）
革兰氏染色
丹麦C.Gram创立，用于细菌分类学研究 细菌细胞壁的结构
பைடு நூலகம்
G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质， 故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质， 增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和 碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。 G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽 聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍 保留初染时的紫色。