免疫组织化学技术
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫组织化学技术
两种不同抗原具有相同或相似的抗原决定簇， 互称共同抗原。
*交叉反应：由共同抗原决定簇刺激机体产生 的抗体可以和两种共同抗原结合发生反应。
抗原的类型繁多，分类方法也很多， 故抗原的名称各种各样。
根据溶解性抗原有可溶和不溶性两类。
按性能分
抗原的种类
按亲缘关系分
概述
❖基本原理：
❖
抗原抗体反应
标记化学反应
呈色化学反应
❖ 与IHCT相关的免疫学基础： ❖ 抗原：能刺激机体引起抗体的产生，并与相应抗
体发生特异性结合的物质—抗体原。
❖ 抗体：针对某种抗原而产生的，并能识别相应抗
原，与其发生特异性结合
第一节 抗原
1. 概念 凡能刺激机体免疫系统产生
特异性免疫应答；并能与相应的在体内 或体外发生特异性结合的物质称为抗原 （ Antigen，Ag ）。
有关概念
❖ 免疫球蛋白:是浆细胞产生的球蛋白。 １、抗体（antibodies, Ab）：是机体免疫
细胞受抗原物质刺激后产生的，能与相应 抗原特异性结合，并具有多种免疫学、生 物学活性的球蛋白。
2 、 免 疫 球 蛋 白 （ immunoglobulins,Ig ） ： 指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的 球蛋白。
γ、 μ、 α、 δ、 ξ 决定的。 重链不同，Ig的类型就不同。
抗体的特性
①Ig都是大分子蛋白质，既具有免疫 原性，又具有能与相应抗原结合的抗体活 性。
② 免疫原性的类属特异性是由Ig分子 的重链和轻链恒定区特定的氨基酸序列所 决定。
抗体特异性结合抗原的活性位点存在于 Ig的可变区。
③Ig由B淋巴细胞衍生的浆细胞生成，主要 以可溶性蛋白的形式存在于体液中。
免疫组织化学技术(immunohistochemistry)
免疫组织化学技术（immunohistochemistry）由于免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高及能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起的显著特点，所以，这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景。
此方法经不断改进和发展已日趋成熟，应用范围逐渐扩大。
目前已有近十种技术方法及几百种标记抗体，技术方法逐步规范化，标记抗体逐步商品化，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，取得了令人瞩目的成就。
一、 免疫组织化学技术的原理和应用范围（一） 免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术第一篇：免疫组织化学技术基础免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理对细胞或组织进行化学定位的技术。
该技术可以用于鉴定细胞或组织中某种特定抗原的存在及分布情况，从而为病理诊断、学术研究和药物研发等提供有力的支持。
一、免疫组织化学技术的原理免疫组织化学技术的原理是利用抗体与其靶分子间的特异性结合反应，来实现对目标物的检测和定位。
抗体可以识别并结合到人体或动物体内的大部分蛋白质，包括生物芯片检测、ELISA检测、Western blotting等技术所用的基质和抗原。
在免疫组织化学技术中，针对某种抗原的特异性抗体先与组织样本中的特异性抗原发生特异性结合，然后通过检测抗体所标识的色素或荧光物等发射的信号，加以可视化。
例如，用特异性抗体和明胶酶-抗明胶酶复合物在组织样本上进行化学染色，从而定位并可视化样本中的抗原。
二、免疫组织化学技术的步骤1. 样本制备：第一步是样本的制备，包括切片、固定和脱水等处理。
固定组织样本是为了保持其形态和结构，因此往往使用福尔马林等固定剂进行固定。
在制片时，细胞或组织切割成相对较薄的切片，一般为5-10 μm。
切割后，通常漂洗去除固定剂，然后脱水，通常采用乙醇浓度逐渐递增的方法进行。
最后，将切片放置于有机媒介中，如去石蜡等。
2. 抗原修复：切片离体后，抗原结构可能会发生改变，因此需要进行抗原修复。
抗原修复可以通过热处理、酶解或酸解等方式进行。
热处理方法包括水浴、压力釜等；酶解包括蛋白酶和肝素酶等；而酸解则是利用酸将组织溶解并解离抗原。
3. 抗体标记：抗体标记是免疫组织化学技术的核心步骤。
选择具体的抗体，可以选择单克隆或多克隆抗体等。
接着，抗体常被标记为一种检测信号(如与酶或荧光物质结合)。
免疫荧光技术通常是通过荧光标记的二抗或荧光标记的可溶解复合物来可视化。
荧光地染色颜色有多种不同的方式，如荧光素-醌染料、荧光素-异硫氰酸染料等，可以根据不同的研究目的选择不同的荧光染色方法。
第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第十三章免疫组织化学技术
第十三章免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
第一节概述免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
一、标本的处理（一）标本的主要来源1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。
减少对组织标本的损伤与挤压。
2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。
（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。
标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。
2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。
组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。
3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。
首选冷冻切片。
其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
免疫组织化学技术
（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 （2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷） 干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂（ 1ml+50ml丙酮） 1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔 包好，室温或4℃保存备用。 （3）铬矾明胶液：铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml （4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml
待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞 ，固定2－4小时。
在细胞上加一层甘油放-20℃保存。
荧光标记免疫组织化学
直接法
间接法
注意事项
一、抗体的保存
浓缩抗体：有效期内，只需放在 4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。
即用型抗体：理论上在4 ℃冰箱内 可保存半年左右。
PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。
2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶
的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗 粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成 分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于
切片的制作
组织的固定 组织石蜡包埋 切片
组织材料的固定
目的:
（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞 的固有形态。
（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质，以保持它原有的结构与自然状态时相仿。防止组织细 胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态
光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为 使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等. 。
第12章免疫组织化学技术
抗原的保存与修复
酶消化法
盐酸水解法 高压锅法
常用的抗原 暴露、修复
方法
微波法 煮沸法
抗体的处理与保存
抗体的选择： 应注意选择具有高度特异和稳定的抗体，根据需要决定采用 单克隆或多克隆抗体。 抗体的稀释： 抗原抗体反应要求有合适的比例，过量或不足均不能达到预 期结果。 抗体的保存 ： 在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体 蛋白质变性。
酶标记抗体免疫组织化学染色
直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内 相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最 后用酶底物显色。
间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异 性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再 用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合 ，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色 。
临床免疫学与免疫学检验
第十二章 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又 称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：
第四节 免疫标记电镜技术
原理
利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等 ）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密 度产物者如HRP标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应 中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的 技术。
相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位 ，免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确，可定 位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等 方面有其独特的优点。
免疫组织化学技术
复
染
根据所用的底物溶液而选择复染液
DAB 有色终末产物不溶于酒精和有机溶剂， 可用醇性染料复染、脱水，有机溶剂透明和封 固。复染过程：a、漂洗切片以除去未反应的 底物；b、Harris苏木素复染；c、流水洗涤； d、1%盐酸酒精分化；e、流水冲洗，温水蓝 化；f、梯度酒精脱水；g、二甲苯透明；h、 中性树胶封固。
显色物标记的抗体检测组织或细胞内的抗 原，用于疾病的诊断或研究。
新鲜组织的冻存 新鲜组织离体后应及时冻存，如需送至其他 实验室冻存可先置于4℃生理盐水中，但时 间不宜超2～6过小时。制备冻块的原则是 低温及速冻。速冻的目的是使抗原迅速固定 和防止冰晶形成，冰晶形成将破坏细胞结构。 低温速冻的方法有：丙酮–干冰法、液氮法。
10%中性缓冲福尔马林液
40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的 PBS90ml
影响固定的因素
固定时间 固定时间过短将影响抗原的固定 和细胞形态，过长能引起抗原遮盖或抗原 变性，因而要选择一合适的固定时间。
固定温度 一般固定剂的固定作用随温度升 高而加强，固定的温度以室温最为常用。
冰冻切片 石蜡切片
免疫组织化学染色
内源性酶和内源性生物素的阻断 内源性过氧化物酶主要见于红细胞的血红 蛋白，中性粒细胞内的髓过氧化物酶及单 核细胞，嗜酸性细胞和组织内的过氧化物 酶。 阻断剂：3% H2O2–甲醇液，10～15分 钟
内源性碱性磷酸酶
内源性碱性磷酸酶主要见于中性粒细胞和内
热诱导的抗原修复应注意的问题：
热处理后应注意自然冷却。 热处理液不要让其煮干。 不要任何抗原的检测都使用该方法。 一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。 形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破 坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡 染等现象。而经酶水解的切片，其细胞浆破坏要视消化 时间而异，但核的破坏较轻。
【检验医学】免疫组织化学技术
各种抗原的固定
抗原 蛋白质 微生物 病毒外壳 多糖 黏液物质 类脂质
固定剂或处理方法 乙醇、甲醇 丙酮、三氯化碳 胰蛋白酶 10%甲醛或微火加热 透明质酸酶 乙醚、丙酮
二、抗 原 的 保 存 与 修 复
➢ 抗原修复:使在制片过程中被遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的过程。
四、结 果 判 断
➢ 对照实验： 阳性对照：选择含已有抗原的标本(证明整个显色程序正确，尤其待检标本呈 阴性结果时更为重要） 阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）
➢ 确证实验： 空白实验：PBS（排除内源性酶） 替代试验：与待测抗原的同种动物非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗 原引起的非特异性反应） 吸收或阻断试验：用过量已知抗原（可溶性）与特异性抗体反应，已知阳性的 标本应呈阴性或弱阳性（证明免疫组化的阳性结果是与天然抗原相同的抗原 抗体反应。）
第十二章 免疫组织化学技术
概念
免 疫 组 织 化 学 技 术 （ immunohistochemistry technique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特 异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化 学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测 定的一项免疫检测方法。
第一节 免疫组织化学技术概述
根据标记物的不同分类： 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫电镜组织化学技术
第一节 免疫组织化学技术概述
免疫组织化学的基本过程包括：
1.抗原的提取与纯化； 2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及
抗体的纯化； 3.将标记物与抗体结合形成标记抗体； 4.标本的处理与制备； 5.抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应； 6.观察结果。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术
免疫组织化学(immunohistochemistry)，也称免疫细胞化学(immunocytochemistry)，是由免疫学和传统的组织化学方法相结合发展形成的研究方法，能定位、定性或定量检测组织切片上的特殊蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体、病原体等。
利用抗原与抗体能特异性结合的原理，用标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的特定抗原(或抗体)结合，形成带有标记物的抗原抗体复合物。
通过普通显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察标记物，从而证明这些抗体或抗原物质在组织细胞内的分布。
根据标记物的不同，免疫组织化学染色可分为免疫荧光组织化学技术、免疫酶组织化学技术、亲和免疫组织化学技术、免疫金银及铁蛋白标记技术等。
免疫组织化学方法将形态学改变与功能和代谢结合起来，既保持了传统形态学对组织和细胞的客观、细致形态观察的优点，又克服了生物化学、免疫学反应只能定性和定量不能定位的缺点，已成为生物医学各学科领域的重要研究手段。
在生物学、医学等领域的研究和诊断中日以显出巨大的实用价值，尤其在肿瘤病理学中已成为常规的诊断方法。
标记在抗体上的荧光素
荧光素标记的羊抗兔IgG (间接荧光抗体)
兔抗人角蛋白的IgG(特异性抗体)
人组织细胞中的抗原(如角蛋白)
直接法间接法
免疫荧光组织化学方法示意图
组织切片的免疫酶组织化学染色培养细胞的亲和免疫组织化学染色
免疫荧光染色免疫荧光染色
(兰色为细胞核，红色为角蛋白) (兰色为细胞核，绿色为上皮膜抗原)。
免疫组织化学(免疫组化)技术
免疫组织化学（免疫组化）技术利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术，它是免疫学和传统的组织化学相结合而形成的，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistry IHC）或免疫细胞化学（immunocytochemistry）。
其特点是将形态学改变与功能，代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚焦显微术等技术，可对被检物质进行定量分析。
第一节免疫组化的发展史及应用自1941年Coons及其同事首创免疫组织化学技术以来，拌随免疫学和组织化学理论与技术的发展，免疫组织化学已发生了日新月异的变化。
如下表由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高等显著特点，且能将形态与功能研究有机的结合在一起，所以，这门技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，推动了学科的发展，取得了令人瞩目的成就。
免疫组织化学染色技术的应用随着大量商品化的单克隆和多可隆抗体出现，配套试剂盒的使用及方法的不断完善，使免疫组化染色已经成为医学基础研究和病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。
免疫组化可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定，淋巴细胞的免疫表型分析，细胞增殖和凋亡的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。
在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更重要。
以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。
近年来，拌随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。
越来越多的癌基因与抗癌基因的发现不仅有助于对肿瘤发生机制的探讨，而且使肿瘤的预防，早期诊断，甚至治疗都向前迈进了一大步，为人类征服癌症代来了希望的曙光。
第十二章 免疫组织化学技术
第五节
免疫标记电镜技术
一、 免疫标记电镜技术的原理 二、 免疫标记电镜技术的标本制备要求
三、 常用的免疫标记电镜技术
第六节 免疫组织化学技术的应用 一、 免疫组织化学技术的临床应用
二、 免疫组织化学技术的拓展
思考题
小结
免 疫 组 织 化 学 技 术 （ Immunohistochemistry Technique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特 异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化 学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测
性一抗尚未饱和的Fc段结合。对抗原有明显放大作用， 对于组织细胞微量抗原的检测更有实用价值。
APAAP法：有些组织细胞富含内源性过氧化物酶，染色
时就不宜使用HRP体系。用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性
磷酸酶(AP)-抗碱性磷酶(AAP)法，简称APAAP法
兔源一抗/Ab1
+
Ag 二抗/Ab2 Ag
原理：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形 成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的 生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间 接法）相遇时，ABC中末饱和的亲和素结合部位即 可与抗体上的生物素结合，使抗原－抗体反应体系 与ABC标记体系连成一体进行检测。
待测抗原
非特异性抗原 A-亲合素 B-生物素 E-酶 ABC 直接法原理示意图
酶的选择:
HRP染色结果比AP染色结果保存时间长
含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记,对比清晰
第三节 免疫荧光组织化学技术
定义:采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为
探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或 抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，
免疫组织化学技术
免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。
这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。
如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。
第七章免疫组织化学技术【实用资料】
（immunofluorescence cytochemistry）
免疫组化
原位杂交技术
膀胱癌和癌旁组织上用ADAM12 T3 反义探针检测到阳性杂交信号(C,D)， 而正义探针在癌旁的正常组织中只见 到很弱或阴性信号(E,F)。D和F分别是 C和D的黑视野图像。
定量免疫 组化技术
免疫组织化学技术基本流程
（protein A immunocytochemistry） （7）生物素-亲合素系统介导的免疫组织化学方法
（biotin-avidin system cytochemistry）
3．按应用方式不同分类
（1）免疫电镜组化技术 （immunoelectromicroscopy cytochemistry）
固定剂选择
• 血涂片：丙酮，福尔马林（胞质蛋白，BCR） • 细胞涂片：95%乙醇、carbowax. • 冰冻切片：乙醇、丙酮、多聚甲醛 • 石蜡切片：福尔马林（需抗原修复）、氯化汞（胞浆蛋白）
PLP/PLDP（糖类、脂类）、乙醇、丙酮
固定方法
• 浸泡法 • 蒸汽法 • 注射、灌注法 • 微波固定
• 注意事项： • 自然冷却、避免蒸干、条件统一，结构改
变，适当加入螯合剂
免疫组织化学技术基本流程
一、样品的制备 二、抗原抗体反应 三、化学呈色反应 四、免疫组织化学结果及其分析
染色策略
ABC PROCEDURE UTILIZING CATALYZED SIGNAL AMPLIFICATION (CSA)
组织细胞的固定
（Fixation）
➢ 要求：
➢ 完整性、天然性、抗原性、便于后期操作
➢ 策略：
➢ 快速脱水、阻断酶活、保持抗原性
组织化学技术5-免疫组化
前言
免疫组织化学（Immunohistochemistry） 又称免疫细胞化学。它 是组织化学的分支， 它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织 内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原 位检测技术。
1．发展简史
——1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检 测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 —— 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁
例 阳对 阴对 替对 实组 号 性照 性照 代照 验 1 2 3 4 5 6 7 － + + － + + + － + + － － － － － + － － + － － － + ± + + － －
结 论 操错 作误 非异反 特性应 阴 对 含 位Ag 性照定 阴对不定 性 照 含 位Ag 受组非异染 检织特性色 受组不定 检 织 含 位Ag 受 组 含 位Ag 检织定
一、免疫组织化学技术
（一）染色方法
1．直接法 荧光素直接标记特异性抗体（—抗） 上，标记抗体与抗原结合（在切片上）
荧光显微镜下观察→检测抗原。
△ 酶标抗体要显强。 缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。 应用：基本不用了！！
2．间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动 物的 IgG抗体）。※显色后镜检 特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原。
※ 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白
素与链霉（而非生物素）结合，而后再结 合PO 。 它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异， 背景低，成本低。
现在还有plus盒。优点是：更简便，放大 倍数↑，等电点中性更适合组织。分子量小， 穿透力↑，原理保密。
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高压抗原修复法：
①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅 中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分 钟。 ⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选 好的免疫组织化学染色方法进行染色。
电炉加热抗原修复法：
1、脱片的可能原因与对策
整批切片脱片 可能是载玻片未处理，玻片上有油污未清洗 或未涂抹防脱片胶，或烤片时间不足致粘 片不牢固。 单张切片及整块组织脱片 除了上述原因外，需考虑抗体热修复时液体 温度过高和时间过长，或冲洗时用力过猛 等因素。
2、无特异性表达的原因
解决方法 • 确认染色过程次序是否正 • 重新实验，设立阳性对照， 以验证实验结果；仔细确 确；是否忽略了某一过程； 定一抗与二抗种属； 是否孵育了足够的时间； 是否使用了正确的抗体， • 更换显色剂（DAB或 以及二抗是否和一抗一致 AEC）;不得使用过期试剂 匹配。 盒，不同批号试剂盒不能 混用； • 底物显色系统是否失效。
9、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl， 室温静置1h，或37℃1h 10、PBS冲洗2-3次，每次5min 11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室 温或37℃孵育30min-1h 12、PBS冲洗2-3次，每次5min 13、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌 握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细 胞） • （显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A， 摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴 显色剂C，摇匀） • （A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）
免疫组化的应用范围
在常规病理诊断中应用免疫组化主要有8个方面： 1、对肿瘤的组织起源进行鉴别诊断； 2、对肿瘤的良恶性进行综合判断； 3、发现微小转移灶； 4、激素受体的检测以指导临床治疗； 5、激素类细胞的定性和定位，以明确内分泌 细胞 的类型和功能状态。 6、指导肿瘤预后，如PgP、CerbB-2、P53等。 7、指导肿瘤分期； 8、免疫性疾病的辅助诊断，如肾小球肾炎、某些皮 肤疾病等组织内免疫复合物的检测。
2、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇） 孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性 3、PBS冲洗2-3次，每次5min 4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然 冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快 冷却至室温 5、PBS冲洗2-3次，每次5min 6、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵 育20min，甩去多余液体 7、滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h， 或者4℃过夜（需在37℃复温45min） 8、PBS冲洗2-3次，每次5min
胰蛋白酶消化法：
①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④PBS洗3次，1分钟/次。 ⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20 分钟左右。 ⑥PBS洗3次，2分钟/次。 ⑦后按选好的免疫组化染色方法进行染色。
所用试剂
1.PBS：0.01M磷酸盐缓冲液 (pH7.4) 配制 -- 取NaCl 8g，KCl 0.2g， Na2HPO4•12H2O 3.63g或Na2HPO4 1.44g， KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐 酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备 用 2.包埋剂：石蜡
3.防脱剂：多聚赖氨酸（PLL5g+蒸馏水1000ml）、 APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）
4.固定液：4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.4) 配制 – a.0.1M磷酸盐缓冲液：取A液400ml与B液 80ml混合后，调pH于7.4，再定容至500ml A液：0.1mol/L Na2HPO4（Na2HPO4•12H2O 35.8g加水定容至1000ml） B液：0.1mol/L NaH2PO4（NaH2PO4•2H2O 15.6g加水定容至1000ml） b.4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液：取20g多聚甲醛溶 于500ml 0.1M磷酸盐缓冲液中，加热并搅拌约23h后溶解 5.细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100（曲拉通X-100 又称清洁剂） 混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS， 再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿， 冷却至临用前加0.4 ml 30％H2O2。
6.抗原修复液：0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）， 或0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0） • 配制 -- 取A液8ml与B液42ml混合后加水至 400ml，调pH于6.0，再定容至500ml • A液：0.1mol/L 柠檬酸（C6H8O7•H2O 21.01g加 水定容至1000ml） • B液：0.1mol/L 柠檬酸钠（Na3C6H5O7•2H2O 29.41g加水定容至1000ml） 7. 5％羊血清或封闭血清，用PBS稀释。 • 含0.03％H2O2的0.05％DAB二氨基联苯胺 （避 光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。 8.一抗（特异结合底物1:100） 、二抗均用PBS稀释。 9.二甲苯、梯度酒精（100％×2、95％、80％、70 ％、50％）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。 10.显色剂：DAB试剂盒、苏木素染液
5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机 切成5-7μ m，的石蜡带
6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然 后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载 玻片上 （洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、 95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶：防脱剂多聚 赖氨酸）
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h
二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧 化物酶连结）三步法染色步骤
实验设备
恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包 埋机、切片机、摊片机、烤片机、 冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以 及离心机和免疫组化试剂等
脱水机、石蜡包埋机
免疫组化技术分类
1、免疫荧光方法 2、免疫酶标方法 3、免疫胶体金技术 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
酶联免疫组织化学
• ABC法
• S - P法
免疫组织化学技术
免疫组织化学 （Immunohistochemistry）又称免 疫细胞化学。它是组织化学的分支， 它是用标记的特异性抗体（或抗原） 对组织内抗原（或抗体）的分布进 行组织和细胞原位检测的技术。
基本原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异 性结合的原理，通过化学反应使标 记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金 属离子、同位素) 显色来确定组织 细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其 进行定位、定性及定量的研究。
微波辐射抗原修复法：
①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内 微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分 钟左右。 ⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好 的免疫组织化学的染色方法进行染色。
14、自来水冲洗10分钟终止反应 15、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化 16、自来水冲洗10-15min 17、常规脱水 50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片 盖上）、镜检
问 题
3、表达较弱
•
• •
问 题 标本固定方式不当或固定 时温度过高，使部分组织 抗原被破坏； 抗原修复方式不当； 抗体浓度过低，或者孵育 的温度、时间不够； 冲洗后切片残留多余缓冲 液。如果阴性对照没有反 应，阳性对照反应良好， 而标本弱阳性，应考虑查 标本本身原因。
免疫组化操作步骤
一.石蜡切片制作
1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲 液内固定12h 2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲 洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜， 95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h 3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ） 各30min 4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡 （58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h， 用石蜡（Ⅲ）包埋组织
①切片脱蜡至水。 ②0.3%H于电炉上加热，不时 用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源， 当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续 至10分钟左右。 ⑤待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按 选定的免疫组化染色方法进行染色。
免疫组化的特点
特异性强 敏感性高
定位准确、形态与功能相结合
免疫组化的作用
凡是组织细胞内具有抗原性的物 质，如肽类、激素、神经递质、细 胞因子、受体、表面抗原等等均可 用免疫组织化学方法显示 。
实验所用标本
组织标本
石蜡切片 冰冻切片 病理切片 组织芯片
组织印片 细胞爬片 细胞涂片 细胞标本
石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能 作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究 。
三.二步法免疫组化染色步骤
• 二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯 • PBS冲洗3次，每次3分钟 • 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复 • 0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧
化物酶的活性 • PBS冲洗、浸泡5分钟，3次 • 正常山羊血清室温封闭10分钟
• 甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或
免疫组化结果的判断原则
1、每批染色都要有特异性阳性对照和阴性对照为基 础，才能对染色结果做判断； 2、阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能 视 为阳性； 3、阴性结果不能视为抗原不表达，即阴性结果无判 断意义；阳性结果有强弱、多少之分，哪怕一个细 胞阳性，只要是在抗原所表达部位，也有诊断意义。 4、当免疫组化结果与HE切片诊断有矛盾时，以HE切 片诊断为准。 5、应用“反正法”确保免疫组化在诊断中的准确性。 6、避免假阴性和假阳性的发生。