分子生物学第四章

第一节 RNA转录的概述
2．真核生物的RNA聚合酶
真核生物的基因组比原核生物大， RNA 聚合酶也更为复杂。其相对分子质量 大都在5×105左右，有8~14个亚基，并含有 Zn2+。利用α-鹅膏蕈碱的抑制作用可将真核 生物RNA聚合酶为分三类。
第一节 RNA转录的概述
第一节 RNA转录的概述
真核生物RNA聚合酶I对α-鹅膏蕈碱不敏 感，负责转录45S rRNA前体，经转录后加工 产生5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA，它 们与多种蛋白质组成的核糖体（核蛋白体）是 蛋白质合成的场所。真核生物的rRNA基因是 一类中度重复的基因，拷贝数都在数十至数百 个，人类rRNA基因约为300个拷贝。
第一节 RNA转录的概述
RNA聚合酶II转录所有mRNA前体和大多数 的核内小RNA（snRNA）。转录是遗传信息表达 的重要环节，真核生物DNA在核内转录生成 hnRNA（编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转 录的。由于它的大小很不一致，故称核内不均一 RNA），然后加工成mRNA，并输送给细胞质的 蛋白质合成体系。hnRNA是各种RNA中寿命最短、 最不稳定的，需经常重新合成。在这个意义上说， RNA聚合酶II可认为是真核生物中最活跃的RNA 聚合酶。
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5．转录终止
当 RNA 链 延 伸 到 转 录 终 止 位 点 时 ， RNA 聚 合 酶 不 再 形 成 新 的 磷 酸 二 酯 键 ， RNA–DNA 杂 合 物 分 离 ， 转 录 泡 瓦 解 ， DNA 恢 复 成 双 链 状 态 ， 而 RNA 聚 合 酶 和 RNA 链都被从模板上释放出来，这就是转 录的终止。
第一节 RNA转录的概述 RNA聚合酶III转录tRNA、5S rRNA、 U6snRNA和不同的胞质小分子量RNA （scRNA）等小分子转录物。RNA聚合酶 III转录的产物都是相对小分子质量的RNA。 tRNA的大小都在100个核苷酸以下，5S rRNA的大小约为120个核苷酸。snRNA有 多种，由90-300个核苷酸组成，参与RNA 的剪接过程。
Hale Waihona Puke 第一节 RNA转录的概述 转录和翻译的速度基本相等，37℃时， 转录生成mRNA的速度大约是每分钟2500个 核苷酸，即每秒合成14个密码子，而蛋白质 合成的速度大约是每秒15个氨基酸。正常情 况下，从一个基因开始表达到细胞中出现其 mRNA的间隔约为2.5 min，再过0.5 min就能 在细胞内检测到相应的蛋白质。
分子生物学基础
第四章 遗传信息的转录—从DNA到RNA
第一节 RNA转录的概述 一、RNA转录的特点 在 DNA 指导下 RNA 的合成称为转录。 RNA 链的转录起始于 DNA 模板的一个特定 起点，并在特定的终点终止，此转录区域 称为转录单位。一个转录单位可以是一个 基因或多个基因。
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第一节 RNA转录的概述
真核细胞中模板的识别与原核细胞有 所不同。真核生物RNA聚合酶不能直接识 别基因的启动子区，所以，需要一些被称 为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序 结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相 结合并形成复杂的前起始复合物，以保证 有效地起始转录。
第一节 RNA转录的概述 RNA聚合酶II对低浓度α-鹅膏蕈碱敏 感，有10个明显的组分，最大的3个亚基分 别相当于细菌RNA聚合酶β’亚基、β亚基和 α亚基的同源物，其摩尔比为1：1：2，它 们担负着RNA聚合酶的基本功能。真核生 物RNA聚合酶中没有细菌σ因子的对应物， 因此必须借助各种转录因子才能选择和结 合到启动子上。
第二节 启动子与转录的起始 1．原核生物的启动子结构
原核生物启动子序列按功能的不同可 分为3个部位。 （1）起始部位：指DNA分子上开始转 录的作用位点，该位点有与转录生成 RNA 链的第一个核苷酸互补的碱基，该碱基的 序号为+1。
第二节 启动子与转录的起始 （2）结合部位：是DNA分子上与RNA聚 合酶的核心酶结合的部位，其长度为7bp，中 心部位在–10bp处，碱基序列具有高度保守性， 富含TATAAT序列，故称之为TATA盒 （TATA box），又称普里布诺序列（pribnow box）。 因该段序列中富含AT碱基，维持双链结 合的氢键相对较弱，导致该处双链DNA易发生 解链，有利于RNA聚合酶的结合。
第一节 RNA转录的概述
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第一节 RNA转录的概述 σ亚基的功能是引导RNA聚合酶稳定结 合到启动子上。RNA聚合酶的核心酶并不能 区分DNA启动子和一般序列，它与DNA的 结合常数约为109（mol/L）-1，停留的半衰 期约为60 min。当σ因子与核心酶结合后， 与DNA一般序列的结合常数下降为105，半 衰期小于1 s；而与DNA启动子的结合常数 达到1012，半衰期为数小时，二者的结合常 数相差约107。
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三、RNA聚合酶
20世纪60年代初期，分别从微生物和动 物细胞中分离得到了DNA指导的RNA聚合酶， 该酶需要以4种核糖核苷三磷酸（NTP）作为 底物，DNA为模板，沿5’→3’的方向合成RNA 链，Mg2+能促进聚合反应。第一个核苷酸带 有3个磷酸基，其后每加入一个核苷酸脱去一 个焦磷酸，形成磷酸二酯键，反应可逆，但焦 磷酸的分解使反应趋向聚合。
基因的转录是一种有选择性的过程， 随着细胞的不同生长发育阶段和细胞内外 条件的改变将转录不同的基因。转录起始 主要由 DNA 分子上的启动子控制，而控制 终止的部位称为终止子。
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分子杂交实验表明，合成的 RNA 只 与模板 DNA 形成杂交体，而与其他 DNA 不能形成杂交体。说明反应产物 RNA 是 在作为模板的 DNA 上由碱基配对机制合 成的。
转录的起始是基因表达的关键，这一 阶段的重要问题是 RNA 聚合酶与启动子的 相互作用。启动子的结构影响了它与 RNA 聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达水 平。
第二节 启动子与转录的起始 转录起点是指与新生 RNA 链第一个核 苷酸相对应 DNA 链上的碱基，研究证实通 常为一个嘌呤。常把起点前面，即5′末端的 序列称为上游，而把其后面即3′末端的序列 称为下游。在描述碱基位置时，一般用数 字表示，起点为 +1 ，下游方向依次为 +2 、 +3……上游方向依次为-1、-2、-3……
在原核生物中，-35区与-10区之间的距离 大约是16-19bp，小于15bp或大于20bp都会降 低启动子的活性。保持启动子这两段序列以 及它们之间的距离是十分重要的，否则就会 改变它所控制基因的表达水平。
第二节 启动子与转录的起始 在细菌中常见两种启动子突变：一种叫 下降突变，如果把Pribnow区从TATAAT变成 AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水 平；另一种突变叫上升突变，即增加Pribnow 区共同序列的同一性。例如，在乳糖操纵子 的启动子中，将其Pribnow区从TATGTT变成 TATATT，就会提高启动子的效率，提高乳 糖操纵子基因的转录水平。
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核心酶只能使已开始合成的RNA链延 长，但不具有起始合成RNA的能力。核心 酶只有和σ亚基结合才能识别起始位点并启 动转录。但σ因子识别转录起始位点并启动 转录必须与核心酶结合成全酶，再与模板 DNA启动子结合才能发挥作用。
第一节 RNA转录的概述 α亚基可能与核心酶的组装及启动子识 别有关，并参与RNA聚合酶和部分调节因 子的相互作用。 β亚基有两个结构域，分别负责转录的 起始和延伸，是RNA聚合酶的催化中心。 β’亚基是一个碱性蛋白，与DNA之间 借静电引力相结合，负责酶与模板DNA的 结合。
聚合酶在体外作用时丢失了σ亚基引起的。 另外，在RNA聚合酶反应中，天然的双链 DNA作为模板比变性后的单链DNA更为有效。
第一节 RNA转录的概述 1．原核生物的RNA聚合酶 大多数原核生物RNA聚合酶的组成是 相同的，大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、 一个β亚基、一个β′亚基和一个ω亚基组成， 称为核心酶。加上一个σ亚基后则成为聚合 全酶，相对分子质量为4.65×105。
第一节 RNA转录的概述
图4-1 典型的转录单位结构
第一节 RNA转录的概述 在体外，RNA聚合酶能使DNA的两条链 发生转录，但在体内DNA的两条链中仅有一 条链可用于转录，或是某些区域以这条链转 录，另一些区域以另一条链转录。用于转录 的链称为模板链，或负链（ —链），又称为 反义链；对应的链为编码链，即正链（+ 链），又称为有义链。编码链与转录出的 RNA链碱基序列一致（极性一致），只是以 U取代了T，它无转录功能。
第一节 RNA转录的概述
4．转录延伸
RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并 使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。 随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋持续 解开，暴露出新的单链DNA模板，新生RNA链 的3'末端不断延伸，在解链区形成RNA–DNA杂 合物。而在解链区的后面，DNA模板链与其原 先配对的非模板链重新结合成为双螺旋。
第二节 启动子与转录的起始 一、启动子的基本结构
启动子是一段位于结构基因 5′端上游区 的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模 板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异 性。
基因的特异性转录取决于酶与启动子能 否有效地形成二元复合物，因此，在转录之 前RNA聚合酶必须找到启动子并与之相结。
第二节 启动子与转录的起始
第一节 RNA转录的概述
在 RNA 聚 合 酶 催 化 的 反 应 中 ， 天 然 （ 双 链 ） DNA作为模板比变性（单链）DNA更为有效。说明 RNA聚合酶对模板的利用与DNA聚合酶不同。 在 DNA 复制时，首先需要将两条链解开才能将 它们作为模板合成各自的互补链；转录时无需将 DNA 双链完全解开，而是局部解链，以其中一条链 为有效模板合成。 DNA 经转录后仍以全保留方式保 持双螺旋结构，而已合成的RNA链则脱离DNA链。