苏大分子生物学第七章

•第一节 核酸分子杂交的基本原理 •第二节 核酸探针 •第三节 核酸分子杂交技术
第一节
核酸分子杂交的基本原理
DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间， 只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂 交。常用已知的DNA或RNA的片段作为探针，包括 特异的DNA序列，或转录的RNA序列或cDNA序列， 或人工合成的寡核苷酸片段。
3.用新的酶促方法标记可以得到高比活度标记探针。
二、标记物 标记物与探针的结合不影响杂交的特异性和稳定性。 ㈠ 放射性同位素 放射性同位素探针标记物，有高度特异性，缺点是易 造成放射性污染，半衰期较短，不能长期存放。常用 的有32P、3H、35S，有时也用14C、125I或131I。 ㈡ 非放射性标记物 (1) 半抗原 (2) 配体 (3) 荧光素 (4) 化学发光技术
㈢ RNA探针
RNA探针有下述优点：
①杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格，特异性更 高。
②RNA单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性， 杂交效率较高。 ③RNA无高度重复序列，非特异杂交少。
④杂交后用RNase消化未杂交的RNA探针，可降低杂 交本底。
㈣ 寡核苷酸探针
寡核苷酸探针是由实验者设计、经核苷酸合成仪人工 合成的。 1.探针制备方便，可以根据需要设计合成各种寡核苷 酸片段，从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选特定 的克隆。 2.非常适用于检测已知序列基因中的点突变或定点诱 变技术产生的点突变。
三、探针放射性同位素标记法
㈠ 放射性同位素的选择
32P、 35S或 3H均可用于标记DNA或RNA。 32P最常用
于核酸的标记。35S适用于原位杂交和DNA序列测定。
3H放射比活度低，故常用于原位杂交。
㈡ 核酸探针的标记方法
⒈缺口平移法(图7-1) 大肠杆菌DNA聚合酶I具有5′3′DNA聚合酶活性， 以相对应的链为模板，从切口处3′-OH端逐个加入新 的核苷酸，此酶还具有5′3′外切核酸酶活性，可从 切口的5′端逐个切去核苷酸，造成切口平移。若反应 体系中存在一种或多种标记的核苷酸，如[-32P] dNTP，则随着反应的进行，这些标记的核苷酸将置 换原有的核苷酸，制备出核素标记的DNA探针。缺口
⒊电转法如图7-11所示。
㈣ 印迹类型
Southern印迹杂交法(Southern blot hybridization)(图 7-12)。
2. Northern印迹杂交(Northern blot hybridization)： Northern杂交是将RNA样品变性和通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相 载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜 上的RNA进行杂交。其基本原理与Southern杂交相 同，只不过变性方法不能采用碱变性法，因为碱导 致RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲 醛、甲基氢氧化汞等变性方法。
(4)
与核酸分子的结合稳定牢固，
非特异性吸附少。
(5)
具有良好的机械性能。
下面介绍几种常用的固相支持物：
(1) 硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质(如抗体和酶等) 的非放射性标记探针的杂交体系。 (2) 尼龙膜(nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链 DNA和RNA的能力较硝酸纤维素膜更强，耐碱处理适 合于一步法的菌落原位印迹法。 尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针，即使用各种 蛋白(如BSA、牛奶等)进行预杂交，产生的杂交信号 本底较高，与非特异吸附有关。 PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容 易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅 的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。
第二节 核酸探针
核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他 活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段。 一、核酸探针的类型 ㈠ 基因组DNA探针
用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编 码序列(外显子)。 ㈡ cDNA探针
与mRNA互补的DNA链称cDNA，特异性高，是 一种较理想的核酸探针。
(2) T4DNA聚合酶标记法。加入dNTP后抑制外切 活性可将标记的dNTP进行填充标记。
(3) T4多核苷酸激酶标记法。用该酶可将-32P从[32P] ATP转移至核酸的5′-OH端 (4) 末端脱氧核苷酸转移酶标记法。将多种标记的 dNTP逐个转移到核酸缺口中的3′-OH端，形成长尾 标记。
同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂
交。
4.反向斑点杂交(reverse dot hybridization)：直接将不 同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与 之杂交，这样一次杂交反应就可以判断待测DNA是否 含有这些探针的同源序列。
5.菌落或噬菌斑杂交(图7-13)。
二、核酸原位杂交
㈢ 放射自显影检测杂交信号
利用放射线在X线片的成影作用来检测杂交信号，称 为放射自显影。这种方法的操作步骤如下： (1) 将滤膜用保鲜膜包好，置于暗盒中。 (2) 在暗室中，将磷钨酸钙增感屏前屏置滤膜上，光 面向上，压1~2张X线片，而后再压上增感屏后屏， 光面向X线片，盖上暗盒，置于70℃，曝光适当的时 间。
㈠ 滤膜杂交的基本过程如图7-8所示。
(1) (2) 核酸的制备 电泳
(3)
(4) (5) (6) (7)
印迹
预杂交 杂交 洗膜 检测
㈡ 固相支持物的选择
一种良好的固相支持物应具备以下几个特点： (1) 具有较强的结合核酸分子的能力，一
(2) 与核酸分子结合后应不影响其与探针分子的 杂交反应。
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(3)
二、杂交动力学
杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局 部双链，如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新 解离，继续碰撞，一旦找到正确的互补区，两侧的序 列迅速配对形成完整的双链分子，后一步反应是一个 自发过程。
影响因素主要有：
(1) 探针浓度、长度和复杂性
探针浓度越高，复性速度越快。
探针越长，扩散速度越慢，复杂性越高，配对难度越 大。
第七章
核酸分子杂交
核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸 单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异 质双链的过程, 即来源不同的两条单链核酸分子通过 碱基互补可形成异源双螺旋，称为核酸分子杂交 (hybridization)。具有灵敏度高、特异性强等优点， 主要用于特异DNA或RNA的定性、定量检测。
㈢ 印迹方法 ⒈虹吸印迹法(图7-9)
利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分 子转移至滤膜上。
⒉真空转移法(图7-10) 其原理是利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中 通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核酸分子转 移到凝胶下面的滤膜上。该法的最大优点是快速， 转膜的同时进行DNA的变性和中和，整个过程只需 1h左右。
固相杂交包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两类。 固相杂交是印迹技术及杂交信号检测技术等相结合， 从而获得清晰的杂交图谱，有利于定性或定量分析待 测核酸样品中的特定片段(靶序列)，在核酸的结构和 功能研究以及基因工程研究中，其应用比液相杂交更 为广泛，其技术发展也更为迅速。 一、膜上印迹杂交 膜上印迹杂交是指将待测核酸序列结合到一定的 支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交 的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。
(3) 根据放射线的强度曝光一定的时间后，在暗室里 取出X线片，显影定影。如曝光不足，可再压片重新 曝光。
㈠ 生物素标记
生物素能以共价结合方式连接到UTP或dUTP的嘧啶 环C5位置上，形成生物素化的核苷酸(图7-4)。
1. 掺入标记法：生物素标记的dNTP可代替相应的 单核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，通过随机引物 法或缺口平移法，将生物素化核苷酸掺入到DNA分 子中，获得生物素标记的DNA探针。
3.斑点杂交(dot hybridization)：直接将变性DNA样
品点于硝酸纤维素膜上，固定好后先预杂交，再与
标记探针杂交，然后通过高严谨性冲洗(低盐高温)，
降低本底和提高特异性。预杂交和杂交可在密封袋
中进行，密封袋比较方便，反应体积小，可以使用
高浓度探针，封口前去除气泡，使杂交液与膜充分
接触，反应体积以膜不贴壁、能浮动为宜。探针与
非放射性同位素标记的探针，除酶直接标记探针外， 其它非放射性标记物并不能被直接检测，需先将非放 射性标记物与检测系统偶联，再显色。 ⒈偶联反应：大多数非放射性标记物是半抗原(如地高 辛)，因此可以通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联： Dig-DNA探针+抗Dig抗体-碱性磷酸酶(或辣根过氧化 物酶)+底物(BCIP和NBT)；生物素可与抗生物素蛋白 (卵白素，avidin)或链亲合素(streptavidin)结合，再与 显色体系相偶联。
(5)
杂交条件的严谨性
所谓严谨性(stringency)，是指杂交反应体系，
避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复
合物的严格程度。反应温度升高，离子强度降低，
会增加反应的严谨性，适用于匹配好的或序列完全 同源的核酸的杂交反应，或用于检测点突变；反之， 则适用于匹配差或序列不完全同源的核酸杂交反应。
根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。 固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。 膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外 与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。
一、杂交的稳定性（表7-1） Tm是核酸双链解链成单链过程中，其克原子消光 系数 (P)值的增加达到最高值一半时的温度。不同 杂交双链其Tm值不同，影响因素有： (1) 杂交链GC含量愈高的杂交双链其Tm值愈高。 (2) 杂交链愈长其Tm值愈高。 (3) 杂交双链的碱基错配程度。 (4) 溶液的离子强度越大，Tm值愈高。 变性剂可影响碱基堆积力和氢键的形成，可降低 Tm值，常用甲酰胺、脲及二甲基亚砜等。用50%的 甲酰胺大约可使杂交双链的Tm值降低30℃。
(2) 离子强度 高离子强度溶液中，其正离子可中和DNA链磷酸 基团的负电荷，消除其间的静电斥力，有利于杂交分 子的形成。 (3) 温度 通常杂交温度在低于Tm 20~25℃温度下进行。不 含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在68℃进行。当 含50%甲酰胺时，在42℃进行。 寡核苷酸探针一般在低于Tm值5℃~10℃下进行。 (4) 杂交促进剂 用硫酸葡聚糖，其微粒的表面可以吸附DNA探针 分子，使接触面积增大，有利于杂交反应。
㈠ 核酸酶Sl保护分析法(nuclease Sl protection assay)
用标记的基因组DNA作为探针，在适宜条件下与 待测RNA进行液相杂交，DNA外显子区可与mRNA 形成DNA:RNA杂交体，而DNA的其余部分(内含子等) 仍为单链，核酸酶S1可专一地降解未形成杂交体的 DNA单链，而与RNA杂交的DNA区则受到保护不被 降解。通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析消化产 物，即可确定不被降解的DNA片段大小，用目的基因 不同区段的DNA进行杂交，可确定mRNA的3′、5′端 以及内含子的精确定位等，通过杂交条带的光密度扫 描还可进行定量分析(图7-14,15)。
⒉显色反应：通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质 (如酶、荧光素等)进行杂交信号的检测。碱性磷酸酶可使其底 物BCIP脱磷并聚合，在此过程中释放出的氢可使NBT (四氮唑 蓝)还原而形成紫色的化合物(图7-7)。
第三节 核酸分子杂交技术
在液体中进行杂交反应称为液相杂交；在固相支持 物上进行杂交则称为固相杂交。
平移法适用于标记大于1 kb的双链DNA。
⒉随机引物法(图7-2)
随机引物法的基本原理是DNA聚合酶可利用随机引 物，沿单链模板进行DNA的合成。
⒊末端标记
只将DNA 3′端或5′端标记的方法称末端标记，常用的 方法如下：
(1) DNA聚合酶I Klenow片段末端标记法(图7-3)。用 该酶将含有核素标记的dNTP补平切口或粘性末端。
2. 光敏生物素标记法：先通过连接臂将一个光敏基 团连接于生物素，成为光敏生物素(photobiotin)， 如图7-5。 ㈡ 半抗原地高辛配基标记方法
将Dig与dUTP(或dCTP，dCTP)相连生成Dig-dUTP 复合物，再通过切口平移法和随机引物法将其掺入 到DNA上(图7-6)。
㈢ 非放射性核酸探针的检测
用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞或组 织切片中核酸进行杂交检测的方法称为核酸原位杂 交(nucleic acid hybridization in situ) 一般的原位杂交有两种类型：与胞内DNA的杂交和 与RNA的杂交。 三、液相杂交技术 液相杂交是指待测的核酸和标记的探针同时溶于 杂交液中进行反应，然后分离杂交双链和未参加反 应的标记探针，再进行检测。