小鼠胚胎干细胞的培养
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
_C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定
至细胞大部分贴壁。 弃去细胞培养液， 用 PBS 洗 3 遍。加 4% 多聚甲醛固定 30 min， 加 PBS 冲洗 5 min × 3； 0． 2% Tritox100 室 温 破 膜 10 min， PBS 洗 涤 5 min × 3； 5% 的山羊血清室温封闭 30 min， PBS 洗涤 5 min × 3； 一 抗 nestin （ 1 ∶ 50 ） 4 ℃ 孵 育 过 夜、 二抗 DyLight 594 AffiniPure Goat AntiＲabbit IgG （ H + L ） （ 1 ∶ 100 ） 室 温 避 光 孵 育 l h， Hoechst33258 （ 1 μg / mL） 室温避光核复染 15 min， PBS 冲洗 2 遍， 封片， 显微镜观察。
2
2．1
结果
C57 胚胎小鼠 NSCs 的分离、 培养与纯化
分离 得 到 的 C57 胚 胎 小 鼠 的 NSCs 光 镜 下 可 见， 原代细胞接种后， 部分细胞逐渐沉降贴附于 6 孔 板表面， 胞体较小， 有光晕， 悬浮部分可以看到很亮 的圆形细胞组成的细胞团。第 2 天以后可看到细胞 大部分贴壁， 悬浮细胞较亮且较圆， 很多细胞团块成 。 辐射状贴壁生长 悬浮部分可以看到一些由十几个 细胞组成的桑葚状神经小球悬浮生长 ， 如图 1A。 接 种第 3 天之后， 神经小球直径逐渐增大， 贴壁的细胞 团块颜色逐渐变暗。原代培养中可见神经球周围无 明显刺突， 存在明显细胞聚集， 如图 1B 。
NSCs ） 具有分化为 神经干细胞 （ neuralstemcell， 神经元、 星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力 ， 能自 。 我更新， 并足以提供大量脑组织细胞的细胞群 ， ， NSCs 现已发现 多种类型的中枢神经系统损伤后 被激活并有利于组织的损伤修复和功能恢复 。 因
《Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞的生物特性研究》范文
《Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞的生物特性研究》篇一摘要：本研究关注于Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞（ESCs）的生物特性研究。
通过基因编辑技术，我们成功构建了Bdh2基因敲除的ESCs模型，并对其细胞增殖、分化潜能、基因表达谱等方面进行了深入分析。
本文旨在解析Bdh2基因在小鼠ESCs中的作用，并进一步揭示其在生物医学研究中的应用潜力。
一、引言Bdh2基因，作为细胞内脂肪酸β-氧化途径的重要一环，其在生物体内具有至关重要的功能。
然而，Bdh2基因在小鼠胚胎干细胞中的具体作用尚未完全明确。
本研究旨在探讨Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞生物特性的影响，为研究其生物学功能提供理论基础。
二、材料与方法1. 材料实验选用的小鼠胚胎干细胞来自实验室前期培养的野生型和Bdh2基因敲除型ESCs。
2. 方法（1）通过CRISPR-Cas9技术，成功构建Bdh2基因敲除的小鼠胚胎干细胞模型；（2）运用细胞增殖实验、细胞周期检测、克隆形成实验等手段，研究Bdh2基因敲除对细胞增殖的影响；（3）采用实时定量PCR、免疫荧光等实验技术，探讨Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞分化潜能及基因表达谱的影响；（4）运用生物学信息分析方法，分析数据并绘制相关图表。
三、实验结果1. Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞增殖的影响实验结果显示，Bdh2基因敲除后，小鼠胚胎干细胞的增殖能力显著降低。
通过细胞周期检测发现，Bdh2基因敲除导致细胞周期停滞在G1期，S期细胞数量减少。
此外，克隆形成实验也证实了Bdh2基因敲除对细胞增殖的抑制作用。
2. Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞分化潜能的影响实时定量PCR和免疫荧光实验表明，Bdh2基因敲除后，小鼠胚胎干细胞的分化潜能发生改变。
在特定诱导条件下，Bdh2基因敲除的ESCs在向特定细胞类型分化的过程中出现障碍。
这表明Bdh2基因在小鼠胚胎干细胞的分化过程中发挥重要作用。
3. Bdh2基因敲除对小鼠胚胎干细胞基因表达谱的影响通过对Bdh2基因敲除前后小鼠胚胎干细胞的基因表达谱进行分析，我们发现一系列与细胞增殖、分化及代谢相关的基因表达发生改变。
以间充质干细胞为饲养层分离培养昆明小鼠胚胎干细胞
ｂｉｌｇｃ ｌｃ ａ ａ ｔ ｒ Ｒｅ ｕｌｓ： ｏｏ ｉａ ｈ ｒ ｃｅ ． ｓ ｔ Ｔｈｅｅ ｂ ｙ ｎ ｃｓｅ ｃ ｌ ｏ ｏ ｅ ｏ ｃ ｈｕ ｅｗｉｈ ｍｅ ｅ ｈ ｍ ａ ｔｍ ｅ ｌ ｓｆ ｅ ｅ ｅｌ ｒ ｄ ｎｔ ｅ ． ｍ ｒ ｏ ｉ ｔ ｍ ｅ ｌｃ ｌｎｉｓｂｙｃ ｃ ｕ ｒ ｔ ｓ ｎｃ ｙ ｌｓｅ ｃ ｌｓａ ｅ ｄ ｒｃ ｉｓｗｅ ｅｉ ｅ ｉ ｄ ｉ ｆ
重庆医科大 学学报 ２ ０ ０ ９年第 ３ ４卷第 ４期 （ｏ ｒａ ｏ ｈ ｎ ｑｎ ｄｃ ｌ ｎｖ ｒｉ ０ ９ ＶＯ．４Ｎｏ４） Ｊ ｕｎ ｌ ｆ ｏ ｇ ｉ Ｍｅ ｉ ｉｅｓｔ ２ ０ ． １ ． Ｃ ｇ ａＵ ｙ ３
一
３３ 一 ９
基础研 究
文 编 ０ ３ ６ （ ０） — ９ ０ 章 号： ５ ３ ６ ０ ０ ０ ３ ４ ２— ２２ ９４ ３ —
Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｗｅ ｈ ｔ ． ｌ ｔ ｅ Ｅ ｅｌ ｈ ｄ ｉ ｐ ｃ ｌ ｒ ｈ ｌｇｃ ｌ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔ ｓｓ ｃ ｓ ｎ ｓｌ ｅ ｃ ｌｎ ｅ ，ｏ ｎ ｒｅｌ ｔ ， ｉ ｈ ｅ ｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ：１ ａ ｌ ｈ Ｓ ｃ ｌ ａ ｔ ｔ ｉａ ｐ ｏｏ ｉａ ａａ ｔｒｓ ｃ ｕ ｈ ａ ｅ ｔｋ ｏｏ ｉｓ ｒ ｕ ｄ ｏ ｌ ｐ ｉ ｗ ｔ ｓ ｓ ｓｙ ｍｏ ｃ ｉ ｉ ｉ ｃ ｈ ｃｅ ｒ ｄ ｅ ａ ｄ ｓ ｏ ｈ ｓ ｒａ ｅ，ｔ ｎ ｅｒ ｃｉ ｎ ，ｉ ｎｆ ａ ｔ ｗｅｌ ｇ ｇ ｏ ｈ， ｏ ａ ｔｅ ｓ ｆ ｅｌ ｇ ｒｇ ｔ ｎ ａ ｄ ｉ ｄｓｉ ｃｉｎ ｂ ｔ ｅ ｎ ｔ ｏ ｌａ ｇ ｎ ｍｏ ｔ ｕ ｆ ｃ ｓｒ ｇｒ ｆ ｔ ｅ ｏ ａ ｏ ｓｇ ｉ ｃ ｎ ｌ ｎ ｒｗｔ ｃ ｍｐ ｃ ｎ ｓ ｌ ａ ｇａ ａ ｉ ｎ ｉｔ ｔ ｅ ｗ ｅ ｉ ｓ ｉ ｏｃ ｏ ｎ ｎ ｏ ｗ ｅ ｇ ｓｏ ｅｇ ｂ ｕ ｅｌ ｗｉ ｉ ｏｏ ｙ ｒ ｌｔ ｅｙｂ ｇ ｅ ｕ ｌａ ｏ ａ ｅ ｔ ｉ ｌ ｃ ｔｐ ａ ｍ ，．．ｈ ｇ ａｉ ｆ ｈ ｕ ｌａ － ｙｏ ｌｓ ； ｄ ｅ ｆ ｉｈ ｏ ｒｃ ｌ ｔ ｎ ａｃ ｌｎ ，ｅａｉ ｌ ｉｇ ｒ ｃ ｅ ｒｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗｉ ｌ ｔ ｙｏ ｌｓ ｉ ， ｉｈ ｒ ｔ ｏ ｅ ｎ ｃｅ ｒ ｃ ｔｐ ａ ｍ ｎ ｓ ｈ ｖ ｎ ｈ ｔｅ ｅ ｏ ｔ ２ ａｔｒｔｅ ＡＫＰ ｓａｎ ｎ ａｌ ｆ ｈ ｅｌ ｈ ｗｅ ｔｏ ｇ ＡＫＰ ａ ｔ ｉ ｓ ｓ ｍｅａ ｈ Ｓ ｃ ｌ ｆＦ ａ ｄ ｏ ｅｃ ｎ ｒ ｒ ｔ ｅｅ ｒ ｏ ｉ ． ｅ ｆ ｈ ｔｉ ｉｇ， ｌ ｏ ｅＥＳ ｃ ｌ ｓ ｏ ｄ ｓｒ ｎ ｔ ｓ ｃｉ ｔ ａ ａ ｓｔ ｅ Ｅ ｅｌ ｏ ０， ｎ ｎ ｔ ｏ ｔａｙ， ｍｂ ｎ ｃ ｖｙ ｓ ｈ ｈ ｙ
河南省洛阳市部分学校2022-2023学年高二下学期5月阶段性检测生物试卷(含解析)
2022~2023学年下学期高二阶段检测生物考生注意：1.本试卷分选择题和非选择题两部分，共100分。
考试时间90分钟。
2.请将各题答案填写在答题卡上。
3.本试卷主要考试内容：人教版必修1第1~3章，选择性必修3。
一、选择题：本题共25小题，每小题2分，共50分。
在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
1. 下列有关细胞学说的叙述，正确的是A.细胞学说提出病毒不具有细胞结构，不属于生物B.细胞学说提出新细胞是通过有丝分裂或减数分裂得到的C.细胞学说使人们对生命的认识由细胞水平进入分子水平D.细胞学说提出一切动植物都由细胞和细胞产物所构成2. Ca²⁺和Na⁺在人体生命活动中是必不可少的。
下列叙述错误的是A.血液中的Ca²⁺. 含量过高，容易导致肌肉抽搐B.细胞中均有以无机离子形式存在的Ca²⁺和Na⁺C.适当补充维生素D能促进肠道对钙的吸收D.人体缺乏Na⁺会导致肌肉的兴奋性降低3. 动物脂肪细胞中储存着大量的脂肪，这些脂肪以大小不一的脂滴形式存在。
下列说法正确的是A.脂肪是小麦细胞中的主要储能物质B.运动员长跑过程中体内脂肪大量转化为葡萄糖C.企鹅体内的脂肪具有缓冲、减压和保温的作用D.与等质量的糖类相比，脂肪分子中氧的含量更高4. 下图是细胞膜的结构模式图，其中甲~戊是组成细胞膜的物质，丁是胆固醇，具有稳定细胞膜结构的作用，能使生物膜在较大的温度范围内保持相对稳定的液晶状态。
下列相关叙述错误的是A.甲除含有C、H、O外,还含有P甚至NB.细胞不同的膜结构中，乙的种类与含量不同C.丙能与膜蛋白结合，与细胞间的信息传递有关D.在昼夜温差大的地区，细胞膜胆固醇含量较低5. 储藏好玉米种子是保持种子活力，保证优良幼苗和发芽率的关键。
玉米种子储藏的关键是控制好水分和室温。
下列相关叙述正确的是A.玉米种子萌发时，自由水/结合水的值变小B.玉米种子储存时，要给予低温和密封的储存环境C.玉米种子储存不当，种子堆会有温度升高的现象D.玉米种子储存不当，产生乳酸的阶段也会产生CO₂6. per蛋白能参与果蝇昼夜节律的调节，per蛋白是三十肽，只有一条肽链。
昆明种小鼠胚胎干细胞的分离、培养与鉴定
ｒｕｄｃｌ ，ｔｅｎ ｃ ｕ ｅ ｒｅａｄｔ ｔ ａｋ ｄ Ｋ ｏｉｖ ｔｉｉｇ ｏ ｎ ａ ｄｉ ｏ ｎ ｅ ｓ ｈ ｕｌ ｓｗ ｒ ｌ ｇ ｇ ｌ ｐｃｅ ．Ａ Ｐｐ ｓｉ ｓ ｎｎ ｌ ｙｗ ｓｒ ｄｓ ｅ ｅａ ｎ ｉ ｙ ｈ ｔｅ ａ ｃｏ ｅ ｈ—ｂｏ ｎｏ ｌｅ ｉｒｂａｔ ｅ ｓ ｒ ｉｅｅｔ ｔ ｒｗ ｒ ｕ ，ｆ ｏ ｌ Ｈ ｆ ｒ ｉ ｅ ｂ ｂ ｓｃ ｏ ｄ ｎ ａｄ
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Ａ ｒ２ ０ ｐ ． ０１
昆 明 种 小 鼠胚 胎 干 细 胞 的 分 离 、 养 与 鉴 定 培
陈 明玉（ 大连铁 路 卫生 学校 辽 宁 大连 １６ ０ ） １０ １
ｃＨ ｅ ｉ ｔ ｅ ｏ ｒ ｏｏｅｓ ｎｉ ｖｒ ｓｅｓ ｎｃｌ ｒ， Ｓｃｌ ｉｓ ａ ｒ ｉｐｅｅ ｒｏ ｏｉｓ（ Ｂ ） ａｄＥ ｓ ｈｗ ｄｏｔａｄ ｅ ｓｗ ｒ ｌ Ｈｗｏ ｌｒ ｓ。Ｉ ｉｏｓ ｐｎｉ ｕｔ ｅ Ｅ ｏｏ ｅ ｎｆ ｍ ｓ ｌ ｍｂｙｉ ｂｄｅ Ｅ ｓ ， Ｂ ｏ ｅ ｕｗ ｅ ｇ ｙ ｈ ｃ ｌ ｎ ｔ ｕ ｏ ｕ ｎ ｃ ｏ ｍ ｄ ｎ ｓ ｒ
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小鼠胚胎干细胞的鉴定
小鼠胚胎干细胞的鉴定小鼠ES细胞的鉴定主要围绕ES细胞的形态、核型、分化潜能和特异性染色等方面进行。
一、形态学观察小鼠ES细胞的形态特点为圆形或扁圆形，表面平滑，体积较小，核质比大，有一个或多个凸起的核仁结构。
经培养后紧密聚集，细胞之间界限不清，形成岛状，巢状群体生长状态，集落边缘整齐，与滋养层细胞界限分明且色泽深亮，克隆的边缘可以看到比较清晰的单个细胞。
多次传代消化或改变培养基的成分，如降低血清浓度、去除LIF或碱性FGF等某些生长因子时，悬浮培养形成的细胞团开始出现松散，球形的边缘可以清楚地看到圆而大的细胞，细胞团开始自分化。
二、核型分析正常的二倍体核型特征是ES细胞全能性的基础，因此需要对所建立的ES细胞系的核型进行鉴定分析。
【实验材料】1.材料载玻片、镊子、离心管、移液管、吸管、35mm 培养皿（Corning，430165）。
2.试剂Demecolcine（Sigma，D6165）、Giemsa（Sigma，G4507）、NaH2 PO4（Sigma，S6566）、Na2HPO4（Sigma，S5136）、甲醇、冰醋酸。
配制类试剂：①磷酸缓冲液：0.2mol/L NaH2PO4+0.2mol/L Na2 HPO4；②Giemsa染液：8ml磷酸缓冲液+2ml Giemsa贮存液，吹吸混匀；③固定液：甲醇∶冰醋酸=3∶1（现用现配）。
【实验步骤】1.将需要做核型分析的ES传代，通常用一个35mm皿的细胞做核型，在传代后25～40小时向培养皿中加入0.2µg/ml democolcin，继续培养1～2小时。
2.取出培养皿，用标准传代的消化方法将其消化成单细胞悬液，1200r/min离心10分钟，弃上清，注意：上清要吸得彻底些。
3.加入事先预热至37℃的0.56%KCl低渗液4ml，用滴管吹打成单细胞悬液（较剧烈），37℃低渗处理15～20分钟。
4.配10ml固定液，4℃冰箱预冷。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化 ...
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
长期培养小鼠胚胎干细胞拟胚体(EB)的观察
ｃ ｒ ｆ ｌ ｏ ｔ ｌ ｄ ｈ ｕ ｔ ｒ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｆ ｒ Ｅ ｆ ｒ ａｉｎ ｎ ｈ ｒ ｅ ｏ ｔ ａ ｆｉｉｎ ｒ ｔ ｃ ｌ ｂ ｉ ｈ ｕ ｉ ｒ ｙ ａ ｅ ｌ ｃ ｎ ｒ ｌ ｔｅ ｃ ｌ ｅ ｏ ｄ ｔ ｎ Ｂ ｏ ｕ ｙ ｏｅ ｕ ｉ ｏ ｍ ｔ ．ａ ｄ ｅ ｅ ｗｅ ｒ ｐ ｒ ｎ ｅ ｆ ｅ ｔ ｐ ｏ ｏ ｏ ｙ Ｗｈ ｃ ｎｆ ｍｌ ｏ ｃ ｏ
利用 Ｅ Ｂ做进一 步的药物 筛选及 分化研 究， 格规 范了形成 Ｅ 严 Ｂ的条件 ，得到 了分化 状 态均 一性很 高的 Ｅ 利用这一 条 Ｂ。 件，观 察到在 分化 条件 下长期培 养（ 达 ６ ） Ｅ 长 ０ｄ的 Ｂ中仍 有表达各 项多能性指 标的细胞 集落 有 关这一 现 象的进一 步分
摘 要 ：胚 胎 干 细 胞 在 体 外 培 养 条 件 下 能 够 维 持 自我 更 新 ，并 具 有 向 多 种 细胞 类 型 分 化 的 能 力 ，因 此 被 广 泛 用 于研 究
细胞 分化 的分子机 理以及 药物 师 选 。形成拟胚体（ ｍｂｙ 试ｂ ｄ ， Ｂ） ｘ ｚ － Ｅ ｒｏ ｏ ｙ Ｅ 是胚 胎干细胞分化 常用的技 术手段 。为 了便于今后
小鼠胚胎干细胞(mES)、小鼠iPS细胞培养Protocol
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养ProtocolMEF细胞铺制：1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置15min以上。
2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。
一般地，一个T25培养瓶中加入5ml MEF完全培养液。
3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-rP3 MEF，复苏MEF细胞若干支。
将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1 × 106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后至于37℃细胞培养箱。
24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。
复苏：1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中是之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞，小鼠iPS细胞完全培养液的15ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液2 ml，吹打悬浮。
4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免起泡。
5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。
借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。
• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养• 掌握无菌操作技术• 了解小鼠解剖操作技术• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤•了解培养细胞的消化分散• 了解倒置显微镜的使用二、实验材料• 实验动物：孕鼠或新生小鼠• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液70%乙醇•器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。
f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。
继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
（2）胰酶消化法操作步骤——切割a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。
b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法
小鼠胚胎干细胞培养实验具体步骤及方法胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
具体步骤一、ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养。
二、EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1. 分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）。
2. 纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50 ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15 ml管中离心3分钟。
3. 用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4. 一个15 cm的细菌培养皿接种4～5x106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5. 2天后更换培养基，将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6. 用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
7. 形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
三、ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1. 胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基。
2. 并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3. 保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
4. 观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
基因编辑小鼠模型构建方法
基因编辑小鼠模型构建方法基因编辑小鼠模型是一种通过基因编辑技术改变小鼠基因组的方法，以研究基因在生物体发育、生理和疾病过程中的功能和机制。
下面是关于基因编辑小鼠模型构建方法的十条详细描述：1. 胚胎干细胞（ES细胞）导入方法：将经过基因编辑的ES细胞注射到小鼠早期胚胎中，使其发育成含有编辑基因的小鼠体。
2. 胚胎干细胞（ES细胞）体外培养方法：将小鼠胚胎中的干细胞分离出来，进行基因编辑后体外培养并转移到小鼠胚胎中，培育出基因编辑小鼠。
3. 基因敲除方法：使用CRISPR/Cas9等基因编辑工具，设计合适的寡核苷酸序列并导入小鼠胚胎，通过切割和删除目标基因，实现基因敲除。
4. 基因突变方法：通过CRISPR/Cas9等基因编辑工具，直接在小鼠基因中引入点突变或插入突变，使其产生突变株。
5. 转基因方法：将外源基因导入小鼠胚胎细胞，并使其嵌入细胞基因组，从而使小鼠表达外源基因。
6. 基因表达调控方法：通过CRISPR/Cas9等基因编辑工具，设计合适的寡核苷酸序列并导入小鼠胚胎细胞，以实现对基因的过表达或下调。
7. 基因标记方法：使用CRISPR/Cas9等基因编辑工具，在小鼠基因中插入标记基因，如荧光蛋白，以便对基因表达进行可视化和追踪。
8. 基因互补方法：通过CRISPR/Cas9等基因编辑工具，将外源基因导入小鼠胚胎细胞，使其与已有基因相互补充或修复，从而恢复基因功能。
9. 基因组工程方法：通过CRISPR/Cas9等基因编辑工具，在小鼠基因组中引入大片段DNA，如全基因组范围的基因敲除、替换或插入。
10. 利用转基因碰撞方法：将两个具有特定基因敲除或表达的小鼠品系交配，使它们的后代同时具有两个基因的敲除或表达，从而模拟一种基因缺失或改变的状态。
这些方法都是对基因编辑小鼠模型构建过程中常用的技术手段，能够有效地改变小鼠基因组，从而研究基因功能和机制。
但是在实际应用过程中需要注意合理选择方法，并根据具体的研究目的进行优化和改进。
小鼠esc培养方案
小鼠esc培养方案一、细胞来源与获取小鼠胚胎干细胞（ESC）可来源于受精后3.5\~5.5天的胚胎，这些胚胎可通过显微操作技术从囊胚中剥离。
剥离的胚胎干细胞需要在含有血清和饲养层细胞的培养基中进行培养。
二、培养基选择与配制培养基是小鼠胚胎干细胞（ESC）生长的必要条件，常用的培养基包括Glasgow MEM、Ham F12、ES Cell Medium等。
在配制培养基时，需要添加适量的血清（一般为胎牛血清）和抗生素等成分，以维持细胞的生长和繁殖。
三、饲养层细胞准备饲养层细胞可以为胚胎干细胞提供必要的生长因子和细胞因子，常用的饲养层细胞包括STO、STO-derived fibroblasts等。
在准备饲养层细胞时，需要将细胞接种在消毒后的培养皿或培养瓶中，待细胞生长至适宜密度后，再进行后续操作。
四、细胞接种与培养将剥离的胚胎干细胞接种在饲养层细胞上，通常情况下，接种密度为1\~5万个/cm²。
在培养过程中，需要保持适宜的温度和湿度，并定期更换培养基，以维持细胞的生长状态。
一般情况下，小鼠胚胎干细胞（ESC）会在接种后2\~3天开始贴壁生长。
五、细胞传代与扩增当小鼠胚胎干细胞（ESC）生长至适宜密度时，需要进行传代和扩增。
通常情况下，传代时的细胞密度为1\~2万个/cm²。
在传代过程中，需要将细胞从培养皿或培养瓶中吹散，并接种到新的培养皿或培养瓶中。
扩增过程需要定期更换培养基，并保持适宜的温度和湿度。
六、细胞冻存与复苏为了长期保存小鼠胚胎干细胞（ESC），需要进行细胞冻存。
将处于对数生长期的细胞进行离心和清洗后，加入适量的冷冻保护剂（一般为二甲基亚砜），然后放入液氮中进行保存。
在需要使用时，将冻存的细胞取出，进行复苏。
小鼠实验胚胎技术
整理版ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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LIM1基因敲除无脑小鼠
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震颤小鼠与多发性硬化
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震颤小鼠与多发性硬化
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转基因动物、基因敲除动物制作方法和原理
克隆目的基因 构建载体
精子 载体法
雄原核 注射法
胚胎 感染法
• 缺点：相对复杂
存在生物安全性问题 形成嵌合体 后期工作量大
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曲细精管注射法：
将外源基因注射入雄性动物的曲细精 管内，在精原细胞分裂过程中外源基因随 机整合入受体基因组，再通过精卵受精产 生带有外源基因的个体。
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曲细精管注射法流程图
目的基因克隆、纯化
逆转录病毒载体的构建
雄性个体曲细精管注射
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嵌合体动物制作方法：
一、聚合法 1. 胚胎-胚胎：两个8细胞期~桑椹期的胚
胎去透明带后，在植物血凝素的作用下， 互相粘附融合在一起重新形成一个胚胎， 移植后发育成一个个体。
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2. 胚胎-胚胎干细胞：一个8细胞期~桑椹 期的胚胎和多个胚胎干细胞在植物血凝 素的作用下，形成一个融合胚胎，移植 后发育成一个个体。
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胚胎干细胞法特点：
• 优点：可以进行基因定点的敲除和导入
• 缺点：环节多、过程复杂
需要昂贵仪器
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利用小鼠胚胎干细胞进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧
利用小鼠胚胎干细胞进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧在生物学研究中，利用小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，简称mESCs）进行活体动物模型的构建是一项重要的技术手段。
通过这种方法，科研人员可以研究不同疾病的发生机制、治疗方法以及新药的筛选等。
接下来，我们将介绍利用mESCs进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧。
首先，需要获取小鼠胚胎干细胞。
通常，科研人员会选择小鼠的早期胚胎作为胚胎干细胞的来源。
在实验室条件下，将小鼠受精卵取出放入培养皿中，培养合适的时长，使其发育到内细胞团阶段。
随后，将内细胞团取出，并经过适当的处理，分离出胚胎干细胞。
接下来，将获得的胚胎干细胞进行扩增。
通过在适当的培养条件下给予合适的培养基和生长因子，可以促进胚胎干细胞的增殖。
这个阶段需要控制好培养基的组分和培养条件，以确保胚胎干细胞的健康生长。
一旦胚胎干细胞经过扩增达到足够数量，就可以开始进行活体动物模型的构建了。
首先，需要选择合适的小鼠品系作为宿主动物。
常用的小鼠品系有裸鼠和免疫缺陷小鼠等。
这些小鼠具有较弱的免疫力，能够更好地接受外源细胞的移植。
将胚胎干细胞进行基因编辑后，将其注射或移植到选择的宿主小鼠体内。
注射的部位可以根据具体实验需要来确定，常见的有皮下注射和体腔注射等。
如果是构建特定器官的模型，可以将胚胎干细胞移植到对应的器官内。
注射或移植完成后，需要对小鼠进行适当的后续处理。
这包括观察小鼠的行为、收集样本进行分析和实验等。
需要注意的是，由于注射或移植过程对小鼠可能产生一定的创伤，因此需要进行必要的护理和监测，确保宿主小鼠的健康状况。
除了基本的操作步骤外，在利用mESCs进行活体动物模型构建的过程中，还有一些技巧和注意事项。
例如，在选择胚胎干细胞时，可以根据实验的需要选择具有特定基因突变的胚胎干细胞，以模拟特定疾病的发生机制。
此外，需要控制合适的细胞数量和注射或移植的时间点，以确保实验的准确性和稳定性。
小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立
Ｌ ｏｇ，Ｇ ０ Ｘ ｎ ，Ｃ Ｅ ｉａｇ．１Ｑａｆｓｍ ｏｐｔ ｈｎ ｏｇＰｏｉ ｅ Ｊ ｎ ２ ０１ ，Ｃ ｂ ２ Ｃｎｅ ｆｒ Ｕ Ｈ ｎ ￣ Ａ ｕ Ｈ Ｎ Ｚ ｉ ２ ｉ ｏｈ Ｈ ｓｉｌｏ ａ ｄｎ ｒｖ ｃ ， ｉ 吼 ５ ０ ４ ｈ７ ｅｔ ｏ ｊｎ ｎ ａ ｆＳ ｎ ｒ
用 畸 胎 瘤试 验 检 测 其 多 向分 化 能 力 。 果 结
该 细 胞 株 为孤 雌 来 源 ， 现 为 正 常二 倍 体 核 型 ， 达 Ａ Ｋ， 面标 载 体 Ａ ３ ８ ２ １ ７和
４ ＳＥ — 、 Ｓ Ａ ｌ阳性 ，Ｓ Ａ ４阴性 。体 内注 射 后 ， 局 部 形 成 含 三个 胚 层 组 织 的 畸 胎瘤 。结论 ＳＥ － 在
Ｒ ｐｏｕ ｔｅＭｅｗｉ ， ｈ ｎｏ ｇＰｏｉｃ ｌ ｏ ｉｌ ｆ ｌｔｄｔ Ｓ ａｄ ｎ ｎｖ￣ｉ； ｎｎ２０ ２ ， ｈｎ． ｏｒ ｐ ｎ ｉｇ ｅｒｄｃｉ ｄ ｎ Ｓ ａｄ ｎ ｖｎｉ ｓ ｔ ｉ ｉ ｅ ｈｎ ｏｇＵ ｉｅ ｔ ａ ５ ０ １ Ｃ ｉａ Ｃ ｒ ｓｏｄｎ ｖ ｅ ｒ ａ Ｈ ｐ ａＡ ａ Ｏ ？ ｅ
ｏ ｃ ｔ ｓｗｅｅ ｔｅ ｔ ｄ ｗｉ ３ ｎ － ｏ ｙ ｅ ｒ ａ ｅ ｔ Ａ２ ７ ａ ｄ ６ ＤＭＡＰ ａ ｄ ｔ ｅ ｕ ｔｒ ｄ ｔ ｂａ ｔｌ ｍｂ ｙ ｓｆｒ ｄ Ｔ ｅ ｈ ｎ ｅ ｅｌｍａ ｓ ｒ ｈ １ ８ ． ｎ ｈ ｎ ｃ ｌ ｅ ｍ ｌｓｕ ａ ｅ ｒｏ ｍｅ ． ｈ ｎ ｔ ｅ ｉ ｎ ｒｃ ｌ ｕ ｏ ｓ
６ Ｄ Ｐ化 学激 活 小 鼠卵母 细胞 ， 以得 到 具 有胚 胎 干 细 胞 特性 的细 胞 株 。 － ＭＡ 可
【 键 词 】 孤 雌激 活 胚 胎 干 细胞 钙 离 子 载 体 Ａ ３ ８ ６ 二 甲基 氨 基 嘌 呤 关 ２ １７ － 【 中图 分 类 号 】 Ｑ １．＋ 【 献标 识 码 】 Ａ 【 章 编 号 】 １７ — ３４ ２ １ ）３ ０ ３ — ４ ８ ３１ ｌ 文 文 ６ ３ ０ ６ （０ ００ — １２ ０
体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为T淋巴细胞样细胞的开题报告
体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为T淋巴细胞样细胞的开题报告一、研究背景胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）是由早期胚胎发展而来的多能干细胞，能够发育成各类体细胞。
因此，ESCs有着广泛的应用前景，包括再生医学、药物筛选等。
然而，ESCs在应用中存在一些限制，如存在免疫排异反应等问题。
为了解决这些问题，通过将ESCs体外诱导分化成特定细胞类型，可以克服免疫排异等问题。
而T淋巴细胞是起源于骨髓的免疫细胞，它们在免疫监视、免疫调节以及抵御感染方面扮演着重要角色。
因此，将ESC诱导分化为T淋巴细胞样细胞，将有助于解决ESCs应用中的免疫问题，并为疾病治疗提供新的思路。
二、研究目的本文旨在探究体外诱导小鼠ESCs分化为T淋巴细胞样细胞的机理，并寻找适合的细胞培养条件。
并通过实验验证分化后的细胞是否表达免疫相关蛋白。
三、研究方法1、小鼠胚胎干细胞的培养采用小鼠胚胎干细胞线F1的细胞株，通过胶贴法培养。
2、体外诱导分化采用多步诱导法，包括培养基的变换、化学因子或蛋白质的加入等。
3、细胞表型的鉴定通过流式细胞术、免疫荧光染色等方法鉴定细胞的表型，包括表面标记物和细胞类型特异性蛋白。
4、免疫细胞的功能分析通过细胞分离、体外刺激实验等方法鉴定免疫细胞的功能特性。
四、研究意义本研究为解决ESCs应用中的免疫问题、开发新的疾病治疗方法提供了新思路。
同时，通过本研究探究T淋巴细胞分化的机理，也有助于了解免疫系统发育中的分化调控机制。
未来，将进一步开展该研究，从分子机制、动物实验等方面深入探究T淋巴细胞样细胞的免疫特性，为开发体外诱导的免疫细胞治疗方案提供有力的支持。