6等电聚焦
《中国药典》2020版— 等电聚焦电泳法
0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。
等电聚焦电泳的两种方法
等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF ）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH 梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0 的区带，这时的pH 则是该分子的pI ，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI 迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI 处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M 磷酸（阳极液）、1M 氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R—150溶于300ml脱色液中，加热到60 - 70C,加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100 、9M 尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF 样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF 样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2, 制模具：洗干净两块IEF 专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml 胶母液（10％，19/1）6—8 ％尿素1ml Ampholine （pH3.5-10）60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
等电聚焦原理
pH
+
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同 分子的两性电解质的混合物所组成的， 分子的两性电解质的混合物所组成的 ， 设其中某一成分为A 它的pI=pH’ 设其中某一成分为 A， 它的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’ 它带负电荷， 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。 极移动。(图b)
四、等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 分析分离制备蛋白质、 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 csf中寡克隆区带的检测 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 测定pI可鉴定蛋白质 可鉴定蛋白质、 3.双相电泳中，IEFE作为第一相 双相电泳中，IEFE作为第一相
3.其它检测方法 3.其它检测方法
电泳转移 双相电泳 滴定曲线分析
蛋白质样品及分离容量
1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 电聚焦有高的分辨力， 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。 分的相对比例。 2、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀， 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应 预先除去。 预先除去。 蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。 占据了分离的有效部位。
pH
pH=pH’ A+ +
-
c
同样载体两性电解质中各种两性电解 质也会各自迁移到它们的等电点处， 质也会各自迁移到它们的等电点处 ， 由于 它们的数量足够多， 它们的数量足够多 ， 各自的等电点相差很 从而形成一个pH梯度 梯度。 小，从而形成一个pH梯度。（图d）
等电聚焦
等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）目前已广泛用于蛋白质分析和制备中，是20世纪60年代后才迅速发展起来的重要技术。
IEF的基本原理是，在电泳槽中放入两性电解质，如脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型、羧酸磺酸混合型），pH 范围有3～10、4～6、5～7、6～8、7～9和8～10等。
电泳时，两性电解质形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，正极为酸性，负极为碱性。
蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。
样品可置于正极或负极任何一端。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。
当置于负极端时，因pH＞pI，蛋白质带负电向正极移动。
随着pH的下降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。
当蛋白质移动到与其等电点相应pH 位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。
因此，IEF中蛋白质的分离取决于电泳pH梯度的分布和蛋白质的pI，而与蛋白质分子大小和形状无关。
IEF的优缺点。
优点：①分辨率很高，可把pI相差0. 01的蛋白质分开；②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。
③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。
④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。
缺点：①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。
但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，克服方法是在样品中多加些两性电解质。
②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。
实验等电聚焦法测定蛋白质等电点一、原理等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是20世纪60年代建立起来的一种蛋白质分离分析手段，多年来发展很快，已成为单相电泳中具有最高分辨率的技术。
IEF的特点是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（AmPholine）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
6第三节 等电聚焦(IEF)-生化分析
瑞典LKB公司的商品名为Immobiline； 瑞士Fluka公司的商品名为pI Select，结构式是：
固定化电解质Immobiline的一端是双键，可以 在聚合过程中通过共价结合到聚丙烯酰胺介质中。 所以在电场中也是固相的。另一端的R基团为弱酸 或弱碱，可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体 系，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可行 成近似线性的pH梯度。
2. 引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带
有最低等电点的分子（带最多的负电荷）将最快
的向阳极迁移，当它达到净电荷是零的位臵时才
停止。
其次是一些低pI的载体两性电解质分子 （带有其次多的负电荷）也将向阳极移动， 直到它的净电荷被减少到零即停止。
3. 电泳结束后的变化
所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的办
固相pH梯度等电聚焦 （Immobilized pH gradients isoelectric focusing，IPGIEF）
IPGIEF是80年代建立起来的一种新型等电 聚焦技术。它利用一系列具有弱酸或弱碱的丙烯 酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成pH梯 度并参与丙烯酰胺的共价聚合，从而形成固定 的、不随环境电场等条件变化的pH梯度。 IPGIEF比传统等电聚焦有更高的分辨率 （可达0.001pH），更大的上样量，是目前分辨 率最高的电泳方法之一。
5. 电极溶液的选择 通常强酸或强碱被作为宽pH范围的电极 液，弱酸或弱碱被作为窄pH范围的电极液。
6. 样品处理 将样品溶解在双蒸水中。样品溶液中的盐离子， 哪怕是很低浓度，也会破坏pH梯度，使蛋白条带畸 变，盐离子还会产生高电流导致烧胶，所以样品溶 液必须避免使用高盐浓度的缓冲液。在等电聚焦之 前，可以通过透析或凝胶过滤层析柱除盐。
等电聚焦原理
2.载体两性电解质的合成
分辨率较不连续PAGE更高，特 别适合于分离分子量相同而电荷不 同的生物大分子。
三、IEFE的基本原理
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P COOH P
NH3+ P COO-
NH2 COO-
pH＜pI
pH＝pI
pH＞ pI
在电泳介质中放入载体两性电 解质，当通入直流电时，两性电解 质形成一个由正极到负极逐渐增加 的pH梯度，正极附近是低pH区，负 极附近是高pH区。
2.扫描与定量
激光光源强度大、单色性好，所以 对IEFE谱带的扫描最合适。 注意：操作程序和条件必须严格相同
3.其它检测方法
电泳转移 双相电泳 滴定曲线分析
蛋白质样品及分离容量
1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。 2、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应 预先除去。 3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响： 1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量； 2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率 降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。 3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。
等电聚焦电泳用处
等电聚焦电泳用处1. 电聚焦电泳的原理1. 电聚焦电泳的原理：电聚焦电泳是一种用于分离和分析分子的电泳技术，它使用电场来对分子进行聚焦，从而使分子在电泳层中移动的速度不同。
电聚焦电泳的原理是，当电场施加到电泳层中时，分子会受到电场的作用，从而在电泳层中产生聚焦效应，使分子沿着电场线移动。
由于分子的大小和形状不同，它们在电场中的移动速度也不同，因此可以根据移动速度来分离和分析分子。
2. 电聚焦电泳的应用电聚焦电泳是一种分子分离技术，它可以用来分离和分析复杂的生物分子，其应用涉及到分子生物学、细胞生物学、免疫学、蛋白质组学等多个领域。
1. 分子生物学：电聚焦电泳可以用来分析和鉴定基因组中的基因片段，从而探究基因的功能和表达调控机制。
2. 细胞生物学：电聚焦电泳可以用来分析细胞内外的蛋白质，从而了解细胞的结构和功能。
3. 免疫学：电聚焦电泳可以用来分析抗体分子，从而了解抗体的结构和功能。
4. 蛋白质组学：电聚焦电泳可以用来分析蛋白质的组成，从而了解蛋白质的结构和功能。
5. 生物医学：电聚焦电泳可以用来分析病毒、细菌和真菌的蛋白质，从而了解病原体的结构和功能，以及对疾病的免疫防护。
3. 电聚焦电泳的优点3. 电聚焦电泳的优点电聚焦电泳可以提供高分辨率的分离，并且可以有效地分离出高分子量的复杂混合物。
它可以提供更高的速度和更低的浓度，从而更快地获得更高的分离效果。
此外，由于使用的电场强度比其他电泳方法要低，它可以有效地保护溶质，从而减少溶质的损失。
它还可以提供更高的检测灵敏度，从而更容易检测到更小的溶质。
它还可以提供更高的质量，从而提高分离的精确度。
4. 电聚焦电泳的缺点4. 电聚焦电泳的缺点电聚焦电泳的缺点是它可能会出现结果不稳定的情况。
由于电聚焦电泳需要在电场中进行，因此它受到电场的影响，如果电场不稳定，那么它的结果也会不稳定。
此外，电聚焦电泳的分离效率也不是很高，它只能分离出几种类型的分子，而不能分离出所有类型的分子。
等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高,重复性好,样品容量大，操作简便迅速,在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用.蛋白质分子是典型的两性电解质分子.它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子,向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中,即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下,不管这些蛋白质分子的原始分布如何,各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦"。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦,从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体,实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB 公司生产的Ampholine 和Pharmalyte,价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
等电聚焦电泳 介绍
4. 置于室温中自然干燥，完全干燥后的胶板，手感如触及玻璃板。这时，可将胶板揭下，裁去边角多余的纸，即可得一张图谱清晰的干胶板。
注意事项
（1）支持介质
在IEF-PAGE中，丙烯酰胺純度极为重要，Acr及Bis中如有丙烯酸，则引起聚焦后pH剃度漂移，一般需用重结晶法进一步纯化Acr及Bis。 最近Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果较再結晶法更佳。
操作方法
一、准备工作
配制凝胶前，应把玻璃板准备好。即将两块干净的玻璃板叠放在一起，之间夹上所需凝胶厚度的胶条进行密封。然后用文具夹将玻璃板四周固定好。注意夹子作用力点在胶条正中，以防漏胶。
二、配制凝胶
取Acr-Bis储备液2.0ml；两性电解质0.5ml；去离子水5.5ml；TEMED 8μl置于小烧杯中混匀，再加入10% 过硫酸胺50μl，用磁力搅拌器充分混匀2min。然后用注射器吸净混合液，排除气泡，缓缓注入玻璃板的夹隙内。注意勿出现气泡。
实验证实，盐离子可干扰pH梯度形成，并使区带扭曲。为了防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用Sephadex G-25脱盐，也可将样品溶解在水，或是低盐缓冲液中，使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白质在等电点附近，或水溶液及低盐溶液中，溶解度较低，則可在样品中加入两性电解质，如加入1%甘氨酸或对1%甘氨酸透析，虽然甘氨酸是两性电解质，但不影响pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶极距作用增加蛋白質的溶解性。此外，还可在样品及凝胶溶液中加入无离子去污剂如Tween 80, Triton X-100, Nonide P-40等或加入相同浓度的尿素(4 M)，以免氰酸盐引起蛋白质的胺甲酰化，含有尿素的样品及凝胶板只能当天使用。
等电聚焦电泳
等电聚焦的基本原理
这就是等电聚焦电泳分离蛋白质的基 本原理。可见在该方法中，等电点是蛋 白质组分的特性量度，将等电点不同的 蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质 中，在电场内经过一定时间后，各组分 将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置 上，形成分离的蛋白质区带。
相等时,此时溶液的pH就是这种氨基酸的等电点(pI).
蛋白质是由氨基酸组成的,除了有末端-NH3+和末端COO-外,参与其组成的氨基酸残基侧链上还有酸、碱
性基团,因此蛋白质是两性物质,也有等电点.
等电聚焦的基本原理
不同的蛋白质或其他两性电解质具有不同 的等电点。如果某种蛋白质处于大于其等电点 的pH环境中，则带负电，在电场中必向正极泳 动；反之，当某种蛋白质处于小于其等电点的 pH环境中，则带正电，在电场中向负极泳动。
不同品牌的载体两性电解质性质上有细 微的差别，使用不同来源的载体两性电解 质凝胶时候蛋白质分离样式略有差异，若 要获得最好的重复性一般不要更换载体两 性电解质的品牌。
电泳仪-AE6541
电泳仪-伯乐bio-rad
电泳仪--实验室
电泳槽--DYCP32型
等电聚焦电泳分离蛋白质
一、仪器与试剂
1．仪 器： JY5000电泳仪、DYCP32型电泳槽 2．试 剂：蛋白质样品、载体两性电解质、
载体两性电解质
两性电解质，是脂肪族多胺和多羧类 的同系物，他们具有相近但不同的pKa 和pI值。在外电场作用下，自然形成pH 梯度，是一种特殊的缓冲液。
《中国药典》2020版—等电聚焦电泳法国家药品标准公示稿
0541电泳法第六法等电聚焦电泳法等电聚焦电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法适用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂(1)水(电阻率不低于18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶液 4ml，加水至 20ml。
加 0.1%甲基红溶液20μl。
(5)pI 标准商品化试剂，所选用的pI 标准的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。
(6)固定液称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g, 加水溶解并稀释至300ml。
(7)脱色液(平衡液) 取 95%乙醇 500ml、冰醋酸 160ml，加水稀释至2000ml。
(8)染色液称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g，加脱色液300ml，在60〜70℃水浴中加热，使溶解。
(9)保存液取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
(10)正极液(0.01mol/L 磷酸溶液) 取磷酸1ml，加水至1800ml。
(11)负极液(0.01mol/L 氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并稀释至1000ml。
3.测定法(1)制胶装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃纸之间加入 60% 甘油 1ml。
取水 12ml、甘油 2ml、A 液 4.0ml、两性电解质(pH3〜10)溶液( 或其他两性电解质 )1.0ml, 混匀，脱气，再加 B 液 72 μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺3μl，混匀后注入槽内聚合，插入样品梳，注意避免气泡出现。
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
整理课件
1
一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的 支持介质分离等点电不同的蛋白 质的电泳技术。
整理课件
2
各种蛋白质各自都有一个等电点,在一 特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性, 在电场中不会迁移。
3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。
整理课件
44
四、等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEFE作为第一相
整理课件
7
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
COOH
NH3+ P
COO-
NH2 P
COO-
pH＜pI
pH＝pI
整理课件
pH＞ pI
8
在电泳介质中放入载体两性电解 质，当通入直流电时，两性电解质 形成一个由正极到负极逐渐增加的 pH梯度，正极附近是低pH区，负 极附近是高pH区。
整理课件
整理课件
28
pH
ApH=pH’
+
b
整理课件
-
29
当环境pI<pH’时，它带正电荷，朝 负极移动，直至移动到它的等点电处， 在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI 处具有一定的缓冲能力，因此在它附近 形成一个pH稳定区域。（图c）
整理课件
30
pH
pH=pH’ A+
+
等电聚焦实验报告
1. 了解等电聚焦电泳（IEF）的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用等电聚焦电泳技术测定蛋白质的等电点（pI）。
3. 掌握实验操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理等电聚焦电泳（IEF）是一种利用pH梯度介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
其基本原理是在一个具有pH梯度的介质中，蛋白质分子根据其等电点在电场作用下向相应pH位置移动，直至聚焦于该位置。
蛋白质分子是两性电解质，其等电点（pI）是指蛋白质分子在溶液中呈电中性时的pH值。
在pH低于蛋白质的pI时，蛋白质分子带正电荷；在pH高于蛋白质的pI 时，蛋白质分子带负电荷。
在等电聚焦电泳过程中，当蛋白质分子移动到与其pI相等的pH位置时，其净电荷为零，停止移动，从而实现蛋白质的分离和聚焦。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：毛细管电泳仪、恒温水浴、pH计、移液器、超纯水系统等。
2. 试剂：蛋白质样品、两性电解质载体、尿素、磷酸、氢氧化钠、乙酸等。
四、实验步骤1. 准备样品：取适量蛋白质样品，加入适量两性电解质载体，制成蛋白质溶液。
2. 制备pH梯度：根据蛋白质的pI值，配制相应的pH梯度介质，置于毛细管中。
3. 样品上样：将制备好的蛋白质溶液加入毛细管中，注意避免气泡产生。
4. 设置参数：根据仪器要求，设置电泳电压、温度、时间等参数。
5. 运行实验：开启毛细管电泳仪，开始电泳实验。
6. 数据采集：实验结束后，采集数据，分析蛋白质的等电点。
五、结果与分析1. 根据实验数据，绘制蛋白质的迁移曲线，分析其等电点。
2. 与理论值进行比较，评估实验结果的准确性。
1. 等电聚焦电泳是一种有效的蛋白质分离和鉴定技术，具有分辨率高、操作简便等优点。
2. 通过本次实验，掌握了等电聚焦电泳的操作步骤，提高了实验动手能力。
3. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 精确配制pH梯度介质，确保pH梯度均匀。
b. 避免气泡产生，影响实验结果。
c. 严格控制实验参数，确保实验结果的准确性。
等电聚焦电泳的名词解释
等电聚焦电泳（Isoelectric Focusing Electrophoresis，简称IEF）是一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质分子的电泳技术。
它是生物化学和分子生物学领域中常用的一种重要的蛋白质分离方法，广泛应用于蛋白质组学、生物制药、临床诊断等领域。
等电聚焦电泳的原理是根据蛋白质分子的等电点（pI）不同，在具有连续pH梯度的介质中进行电泳分离。
蛋白质分子的等电点是指其电荷为零时所处的pH值。
由于蛋白质分子中含有可解离的氨基酸残基，如酸性氨基酸（Asp、Glu）和碱性氨基酸（Lys、Arg），因此蛋白质分子在一定条件下可以带正电荷或负电荷。
当溶液的pH值等于蛋白质分子的等电点时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，净电荷为零，此时蛋白质分子在电场中不发生移动。
在等电聚焦电泳过程中，首先将待分离的蛋白质样品加入到具有连续pH 梯度的凝胶介质中，然后施加直流电压使样品中的蛋白质分子根据其等电点在凝胶中迁移。
由于凝胶介质具有连续的pH梯度，蛋白质分子会迁移到与其等电点相对应的pH区域并停止移动。
经过一段时间的电泳，各种蛋白质分子根据其等电点分布在不同的pH区域，从而实现了蛋白质的分离。
等电聚焦电泳具有分辨率高、重复性好、样品用量少等优点，尤其适用于复杂蛋白质样品的分离。
然而，该方法的缺点是操作过程较为繁琐，需要较长的时间进行电泳分离，且对设备和试剂的要求较高。
尽管如此，等电聚焦电泳仍然是生物化学和分子生物学研究中不可或缺的重要技术手段。
在等电聚焦电泳过程中，凝胶介质的选择至关重要。
常用的凝胶介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和纤维素凝胶等。
其中，聚丙烯酰胺凝胶是目前最常用的凝胶介质，具有较高的分辨率和较好的稳定性。
琼脂糖凝胶则具有良好的透明度和生物相容性，适用于生物制药领域。
纤维素凝胶则具有较好的机械强度和较低的成本，适用于大规模生产。
此外，为了提高等电聚焦电泳的分离效果，还可以采用多种策略对凝胶介质进行处理。
3.2电泳技术文建雷
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3.4.7 双向电泳法
二维PAGE技术结合 了等电聚焦技术及 SDS-PAGE技术。 先将样品在直径为 1～3mm的玻璃管 中进行等电聚焦电 泳。
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IEF电泳结束后，将凝胶 条从玻璃管中取出，并 在含SDS、巯基乙醇的 样品处理液中振荡30 min，使SDS与蛋白质充 分结合。 之后将凝胶条放在SDSPAGE浓缩胶上，加入 丙烯酰胺溶液或熔化的 琼脂糖使其浓缩胶连接， 即可进行第二向电泳。
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电泳方式采用等电聚焦多采用水平平板电泳或 管式电泳。两性电解质价格贵，使用两条薄 胶带做为玻璃板间隔形成厚度0.15 mm的薄 层凝胶。用低浓度的PAGE（4％）或琼脂糖 防止分子筛作用。
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玻璃板需要硅烷化和反硅烷化处理 硅烷化试剂：甲基丙烯基氧丙基三甲氧基硅烷 ( 3-methacry-loxypropylt rimethoxysilane， MAPS) MAPS 也可以用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷( KH550 化学纯，辽宁盖县化工厂) 来替代 反硅烷化试剂：二氯二甲基硅烷
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考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue，CBB) 考马斯亮蓝染色用于聚丙烯酰胺凝胶染色，步 骤简便、灵敏度较高，可进行定量扫描。 为R和G型两类 R型为三苯基甲烷(triphenylmethane)，分子中 含有2个SO3H基团，偏酸性，磺酸基与蛋白 质的碱性基团结合形成染料-蛋白质复合物。
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电泳后蛋白质染色时应注意，由于两性电解质 也会被染色，经过5～10％的三氯乙酸浸泡 以除去两性电解质后才能染色。 等电聚焦也可用于测定未知蛋白质的pI，将一 系列已知pI的标准蛋白及待测蛋白同时进行 等电聚焦。测定各标准蛋白电泳区带到凝胶 某一侧边缘的距离对各自的pI值作图得到标 准曲线。测定待测蛋白的距离，通过标准曲 线即可求出其pI。
6第三节 等电聚焦(IEF)-生化分析汇总
浓度高的微量样品可直接用微量进样器直接加在胶面上，较稀 样品用几层擦镜纸浸透样品溶液加在胶面上，聚焦一段时间后，去
掉加样滤纸，可减少拖尾现象。
根据等电聚焦的原理，样品在聚焦过程 中电流会越来越小，当到达等电点位置时， 电流为 0 ，此时认为等电聚焦完成。在实际 电泳中，当凝胶的电流已达到最小值，不再 降低，即可认为聚焦完成。
5. 电极溶液的选择 通常强酸或强碱被作为宽pH范围的电极 液，弱酸或弱碱被作为窄pH范围的电极液。
6. 样品处理 将样品溶解在双蒸水中。样品溶液中的盐离子， 哪怕是很低浓度，也会破坏pH梯度，使蛋白条带畸 变，盐离子还会产生高电流导致烧胶，所以样品溶 液必须避免使用高盐浓度的缓冲液。在等电聚焦之 前，可以通过透析或凝胶过滤层析柱除盐。
提高疏水蛋白在水中的溶解性
1. 尿素
改善疏水蛋白接近pI时的可溶性，也可增加
多肽的溶解度。 2. 非离子去污剂和两性离子去污剂 能在不破坏蛋白质结构保持生物活性的情况 下改善蛋白的溶解度。
尿素和去污剂结合使用是提高疏水蛋白可溶性 的最好方法。
7.加样方法
根据等电聚焦的原理，样品可加在凝胶上任何合适的位置都可 得到相同的结果。
等电聚焦技术
根据建立pH梯度原理的不同，梯度又 分为载体两性电解质pH梯度和固相pH梯度。 前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH 梯度，后者是将缓冲基团成为凝胶的一部 分。
三、载体两性电解质 1. 载体两性电解质的合成 1961年Svensson H提出的载体两性电解质 的理论基础，1964年Vesterberg O利用多乙烯 多胺和不饱和酸合成了载体两性电解质，它 是由脂肪族多氨基多羧基的异构物和同系物 组成，它们有连续改变的氨基与羧基比。
等电聚焦电泳 介绍
等电聚焦电泳介绍点击次数：315 作者：佚名发表于：2008-08-07 00:00 转载请注明来自丁香园来源：互联网主要仪器试剂仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。
储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；灌胶以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。
其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。
水：5.4ml；储存液1）：2.0 ml；载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl；载体两性电解质溶液pH4-6 240μl；超纯尿素 6.0 g ；10%过硫酸胺25μl； TEMED：20μl灌胶步骤：1.组装灌胶器；2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6.聚合约1小时；7.聚合完成，小心拔去梳子；8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。
注意：1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.样品制备和上样一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。
等电点聚焦等效分子质量测定原理及应用
等电点聚焦等效分子质量测定原理及应用分子质量是化学中一个非常关键的参数，无论是在材料科学、医学或者化学反应中，都需要精确地确定分子质量。
实际上，目前最精确的测量方法之一是等电点聚焦等效分子质量测定法（IEF-MALDI）。
本文将介绍IEF-MALDI的原理，同时探讨该方法在分子质量测定中的应用。
IEF-MALDI原理IEF-MALDI是一种在聚丙烯酰胺凝胶上进行的二维电泳技术。
在该过程中，样品首先在一个pH梯度内浸泡，pH值梯度从酸性到碱性渐变。
这种梯度使得用于电泳的聚砜酯凝胶形成了一个等电点梯度。
接着，样品化合物不同等电点的分子在凝胶上定位。
每一个分子会凝聚在其中一个点上，等效分子质量可以通过研究分子在凝胶上的移动速度来确定。
每一个等效分子质量点可以通过从凝胶中取出它来进行MALDI的结果确定。
MALDI是一种激光脱落离子技术，它使用激光来从固态样品表面蒸发物质，并将这些蒸发物质切割成离子。
离子从样品表面加速进行时间飞行质谱分析。
通过将这些分子与已知的标准物质分子进行比较，就可以很容易地确定分子的准确质量。
IEF-MALDI的应用IEF-MALDI在许多领域都有着广泛的应用。
在蛋白质研究领域中，IEF-MALDI技术已经成为研究复杂蛋白质混合物的首要方法之一。
因此，IEF-MALDI已经被广泛用于新药研发、生物医学研究以及基因测序等领域。
在医学领域内，IEF-MALDI技术可以被用来对药物代谢、生物标志物和毒性标志物等进行定量分析。
IEF-MALDI也可以被用作医学诊断工具，帮助医生做出更准确的诊断。
例如，在肝病、肿瘤和炎症等疾病的早期识别中，IEF-MALDI可以检测出与其相关的蛋白质和分子组，帮助医生及早筛查和诊断疾病。
此外，IEF-MALDI也可以应用于环境领域内的研究和分析。
它可以用于对土壤、空气、水质等生态系统进行评估。
IEF-MALDI 技术可以监测，分析土壤或水中的有机污染物以及人类活动所带来的影响。
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Ø 以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，在其中加入两性电解质载体 (carrier ampholines)，在电场作用下，两性电解质载体可以形成从阳 极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。如果在其中加入蛋白质， 在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动， 而被浓缩成狭窄的区带。 Ø 按等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集的行为即是聚焦。聚焦 部位的蛋白质净电荷为零，聚焦部位的pH即为该蛋白质的等电点
一端管口，未封口朝上垂直将玻管立于制胶管架上，加入40％蔗糖 2滴，轻轻震动至管底，然后加按照下表配制的凝胶液约2ml于玻 管中，直至离玻管顶端 0.5-1cm处为止，上面再以2～3滴蒸馏水 封胶，37ºC凝胶聚合0.5-1h。（凝胶长度大约8cm）
30% Acr/Bis
1.5 ml
Ampholine（pH3.5-10） 0.3 ml
3.胶条处理
每组两个胶条，均测量长度并记录（胶条1为L1，胶条2为L2）， 随后分别进行如下处理：
1）胶条1：目的是判定聚焦后蛋白带的相对位置！ 放入培养皿中， 加入12%三氯乙酸溶液固定，直至白色蛋白条带出现；凝胶条 置于玻璃板上，量出蛋白带中心距正极端的距离（L’）和凝胶 条的长度（L1’ ）。计算出未固定时蛋白带距离正极的长度L。 假设固定后蛋白带的相对位置不变！
等电聚焦 （Isoelectrofocusing, IEF）
（1）掌握等电聚焦的实验原理 （2）了解等电聚焦的用途
实验内容
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) • 两性电• 解制质胶和（p1H小梯时度）的形成 • pH梯•度聚的焦测（定3小时） • 样品等• 电pH点梯的度计的算测定（第二天）
• 样品等电点的计算（课后完成）
两性电解质（carrier ampholyte, CA)
两性电解质：由多种氨基与羧基比例不同的脂肪族多氨基多羧 酸同系物和异构物混合构成。当电场中通直流电时，它们依各 自氨基与羧基比例的不同而按其等电点的次序排列，从而在两 极间形成一个稳定的由阳极到阴极逐渐增加pH的平滑梯度。 商品名为Ampholine。
等电聚焦（isoelectric focusing），缩写 为IEF或EF，也称等电分离、等电点划分， 等电点分析、聚焦电泳等，是单相电泳中具 有最高分辨率的技术。
IEF可以用来鉴定和测定蛋白质等电点， 分离具有不同等电点的复合蛋白质
实验原理
Ø 蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）
IEF的缺点：
①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无 盐时部分蛋白质溶解度差，易发生沉淀。可通过在样品中多加些两性 电解质加以克服；
②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子 去垢剂解决
实验步骤
1. 制胶 每组（两人）两支φ0.5cm×10cm的玻管，用parafilm膜封住
5）上槽接正极，下槽接负极，恒压160V开始泳动，直至电流为零，约3hr。 6）聚焦结束后取出凝胶管，先用蒸馏水将两端电泳液充分洗去，再用灌满水
的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针 前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶 条即可流出。标明胶条正负端，并编号。
H2O
3.735 ml
2mg/ml BSA （待测蛋白） 0.4 ml
10%APS TEMED
6 ml 0.06 ml 0. 005 ml
6ml/2人 可以做3管！
2. 聚焦电泳
1）用滤纸吸去凝胶管顶端的水，剥去管底parafilm，使蔗糖液流出，并用少 量蒸馏水洗涤。
2）将凝胶管塞入圆盘电泳装置的孔中，空孔用无孔胶塞封住。（上槽中加水 检测一下是否漏水！）
（3）电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH 相等，用pH0表示。
（4）电泳开始后，混合物中pI最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等 电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突 然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此 区域内。
（5）由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介 质的pH保持在它的等电点范围。
（6）pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于 pI2＞pI1，因此定位于第一种两性电解质之后。
（7）以此类推，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各 自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的 线性pH梯度。
IEF的优点：
①分辨率很高，可把pI相差0. 01的蛋白质分开 ②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带 越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用 ③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI ④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。
3）下槽倒入20g/L NaOH溶液，用针管吸取少量NaOH溶液加入凝胶管的底部， 以排出其中的气泡。将固定好凝胶管的上槽装在下槽上。检测下槽中的 NaOH是否没过凝胶底部。
4）在上槽加入适量5%磷酸溶液，检查是否漏液；如不漏液，继续加入磷酸 溶液，液面需没过胶面。用针管吸取少量磷酸溶液加入凝胶管的上部，排 除凝胶管上部的气泡。
成不同于蛋白质。
两性电解质在电流的作用下现场平滑的pH梯度
（1）正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物（即 合后，在凝胶中即形成了两性电解质的混合物）；
（2）在正极端引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液， 如氢氧化钠、氨水等。
理想载体两性电解质的条件：
1、分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 2、可溶性好，便于等电聚焦过程中pH梯度的形成和蛋白质样品的迁移。 3、缓冲能力强，避免聚焦的蛋白质在等电点引起pH梯度的局部改变和溶
解性能的下降。 4、导电性均匀，排除电场的不均匀而导致凝胶局部过热。 5、紫外吸收低，不发荧光。 6、化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组