这项将蛋白质按其等电点分离的技术称为等电聚焦IEF
等电点聚焦
等电聚焦（isoelectric focusing , IEF ）目前已广泛用于蛋白质分析和制备中， 是 20 世纪 60 年代后才迅速发展起来的重要技术。
IEF 的基本原理是，在电泳槽 中放入两性电解质,如脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型、羧酸磺酸混合型） , pH 范围有3〜10、4〜6 5〜7、6〜8 7〜9和8〜10等。
电泳时，两性电解质形成 一个由阳极到阴极逐步增加的 pH 梯度,正极为酸性,负极为碱性。
蛋白质分子 是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性 pH 梯度中进行电泳。
样 品可置于正极或负极任何一端。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的 pH 环 境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的 pH 环境中以阳离子形式向负 极移动。
当置于负极端时，因pH >pI ，蛋白质带负电向正极移动。
随着pH 的下 降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。
当蛋白质移动到与其等电点相应 pH 位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。
因此， IEF 中蛋白质的分离取决于电泳 pH 梯度的分布和蛋白质的pl ,而与蛋白质分子大小和形状无关。
IEF 的优缺点。
优点：①分辨率很高，可把 pI 相差0. 01的蛋白质分开；② 样品可混入胶中或加在任何位置， 在电场中随着电泳的进行区带越来越窄， 克服 了一般电泳的扩散作用。
③电泳结束后，可直接测定蛋白质 pl 。
④分离速度快， 蛋白质可保持原有生物活性。
缺点： ①电泳中应使用无盐样品溶液， 否则高压中 电流太大而发热。
但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀， 克服方法是在样 品中多加些两性电解质。
②许多蛋白质在 pI 附近易沉淀而影响分离效果，可加 些脲或非离子去垢剂解决。
一、基本原理（1） 人工 pH 梯度：在分离蛋白质时常用一个直立的性，以蔗糖密度梯度 防止对流。
当两个不同pH 的缓冲液互相扩散时，在其混合区间即形成pH 梯度， 称为“人工 pH 梯度”。
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
注意事项：
1. 一向聚焦与二向电泳之间需要平衡，时间视蛋白质的性质而定，一般为10min，最多不超过15min。
2. 过量的上样量会引起双向图形畸形，特别在一向聚焦时，当样品浓度超过5mg时，则蛋白质凝聚和沉淀，使二向时产生水平和垂直条纹。
3. 含尿素的试剂均应避免过高的温度处理，一般不要超过30℃，否则尿素分解产生异硫氰酸盐会引起羧基甲酰化而导致电荷不均一性。
4. 第一向中过量的去污剂会严重影响双向电泳图谱，因此聚焦完毕进行平衡前，用双蒸馏水冲洗胶条，以除去残留的去污剂。
5. 双向电泳中双向凝胶间的界面紧密接触非常重要，如果接触不好或者两者之间留有气泡，则导致转移时分子扩散。
6. 双向电泳中的条纹现象是常见的问题。
水平条纹可能与一向电泳时间不够，聚焦不好有关，或者在加样处产生沉淀和引起重新溶解所致；纵向条纹则表明样品没溶解，这可以通过调整样品量，增加电泳时间，改善样品的溶解状态，同时在加样前通过高速离心以除掉所有不溶物。
等电聚焦电泳
在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间 形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶 液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。 利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的 解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度 约50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且 不易稳定。
如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由 低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度， 则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI 值与所处位点的PH值的差别带上正电或负电。
IEF的分类
载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient) 等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是 利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时， 在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合， 形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率 可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度 凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等 电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的 区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯 度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等 电点而形成pH梯度。
加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、 甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改 变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的 pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖， 可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在 电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多 胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可 以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方 法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
icief的检测原理
icief的检测原理ICIEF全称为等电点异电聚焦电泳，是基于蛋白质等电点的差异而进行的一种电泳分离技术，广泛应用于蛋白质药物研发、体外和体内性质研究等领域。
以下是ICIEF的检测原理及步骤。
1. 原理ICIEF的原理是利用全自动等电点聚焦电泳仪对样品中蛋白质等电点进行分离。
等电点是指蛋白质带电量为零时的pH值，而异电点则是指带电量正负相等的蛋白质在一定的pH值下呈现出不同的电荷状态。
ICIEF通过将样品中的蛋白质在pH梯度中进行电泳分离，进而获得蛋白质的等电点和异电点等信息，实现对样品的分离和分析。
2. 步骤（1）样品准备：将待检测的蛋白质样品进行预处理，如加入缓冲液、去除杂质等，以确保样品质量的精准和稳定。
（2）试剂制备：制备等电点聚焦电泳所需的缓冲液、样品浸泡液等，在实验室中准备好。
（3）电泳分离：将样品在电泳仪中进行分离，先将试管中的样品放入等电点聚集层，然后采用电场作用将样品分离到等电点的对应位置上。
经过异电点聚焦电泳、固定化定位等步骤，得到以等电点或异电点为参照标记的蛋白质荧光图谱。
（4）图像处理：将得到的蛋白质荧光图谱进行数据提取和峰和面积计算等处理，进而得到蛋白质的等电点和异电点等自身性质。
（5）数据分析：根据处理得到的荧光特征图谱数据，通过ITC或DSC等热化学实验或计算方法，对样品中的蛋白质等电点和异电点等性质进行更加深入的分析和研究。
总之，ICIEF是一种基于蛋白质等电点差异的一种高分辨率分离技术。
它在蛋白质药物研发与生产等方面都有广泛应用，可以快速高效地进行蛋白质荧光特征分析和等电点测定，准确地获取样品中的蛋白质等电点和异电点等自身性质，帮助研究人员更好地了解和研究蛋白质药物的性质和特征，从而推动药物研发和创新发展。
实验操作指导书：等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
等电聚焦电泳.
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的 支持介质分离等电点不同的蛋白 质的电泳技术。
各种蛋白质各自都有一个等电点,在 一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性, 在电场中不会迁移。
等电聚焦就是在电泳介质中放入载 体两性电解质，当通以直流电时，两性
pH
pH=pH’
A+
+
-
c
同样载体两性电解质中各种两性电解
质也会各自迁移到它们的等电点处，由于 它们的数量足够多，各自的等电点相差很 小，从而形成一个pH梯度。（图d）
假设在一个系统中含有极多的 有适当的等电点和它的等电点处有 一定的缓冲能力的两性电解质，因 此形成的pH梯度将是连续平滑的。
pH
《蛋白质电泳实验技术》 科学出版社 郭尧君 《蛋白质技术手册》 科学出版社 汪家政 范敏 主编 《电泳》 科学出版社 何忠效 张树政 主编
实验 血红蛋白的等点聚焦电泳
[原理]
Hb具有四条多肽链和球蛋白 （α、β、γ、δ）
HbA HbA2 HbF HbA3
α2β2 α2δ2 α2γ2
>95% 2-3% <2%
2.电泳区带相当狭窄。 3.重复性好。
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。
分辨率较不连续PAGE更高，特 别适合于分离分子量相同而电荷不 同的生物大分子。
三、IEFE的基本原理
3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。
等电点聚焦电泳
等电点聚焦电泳等电点聚焦电泳（Isoelectric Focusing，简称IEF）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
它基于蛋白质在特定条件下在电场中的移动速度与其等电点相关的原理，能够将混合蛋白质样品分离成不同的带状区域，从而实现对蛋白质的纯化和分析。
等电点是指蛋白质在电场中呈等电状态的pH值。
蛋白质在不同的pH值下带有正电荷或负电荷，当蛋白质的等电点与运行缓冲液的pH值相等时，蛋白质净电荷为零，停止运动。
这时，蛋白质会聚焦在等电点处，形成锐利的带状区域。
在进行等电点聚焦电泳实验时，先将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，凝胶中存在着一种称为聚丙烯酰胺的高分子物质，它能够提供电泳的通道。
然后，在两端施加电场，使蛋白质在凝胶中向两极运动。
同时，凝胶中的pH值梯度能够使蛋白质在移动过程中逐渐接近其等电点，最终停留在等电点处。
等电点聚焦电泳的优势在于能够分离各种不同等电点的蛋白质，从而实现高分辨率的蛋白质分析。
它可以用于研究蛋白质的异构体、修饰和突变等信息，对于蛋白质组学研究、生物药物的质量控制等具有重要意义。
在等电点聚焦电泳中，pH梯度的建立是关键步骤之一。
常用的方法包括使用缓冲液体系和添加胶体等。
缓冲液体系可以通过选择不同的酸碱成分和浓度来调节pH梯度的范围和形状；而添加胶体则能够改变凝胶中的离子浓度分布，从而调节蛋白质的电泳速度。
等电点聚焦电泳的结果可以通过染色或质谱等方法进行检测和分析。
染色方法可以使用酸性、碱性或中性染料，如银染色、Coomassie 蓝染色等，以可视化蛋白质的带状区域。
质谱分析则可以进一步确定蛋白质的分子量和序列等信息。
除了等电点聚焦电泳，还有其他一些蛋白质分离和分析技术，如SDS-PAGE、凝胶过滤层析、离子交换层析等。
这些方法在不同的情况下可以互补使用，以实现更全面的蛋白质分析。
等电点聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点的分离和分析技术。
它通过建立pH梯度，在电场中将蛋白质聚焦在等电点处，实现高分辨率的蛋白质分离。
等电聚焦电泳技术在蛋白质研究中的应用
等电聚焦电泳技术在蛋白质研究中的应用随着生物技术研究的发展，蛋白质研究成为了生物学领域中的一个热门研究方向。
而等电聚焦电泳技术（isoelectric focusing, IEF）则成为了一种非常重要的蛋白质分离技术之一。
本文将介绍等电聚焦电泳技术在蛋白质研究中的应用，并探讨其在该领域中的意义和挑战。
等电聚焦电泳技术是一种基于蛋白质等电点差异的分离方法。
所谓等电点，是指蛋白质在特定条件下具有等电荷的状态，即净电荷为零。
而等电聚焦电泳就是利用电场的作用将蛋白质在胶体中移动，直至达到等电点所在位置停止运动。
这种技术的主要优势在于其高分辨率和高效率，能够有效地分离蛋白质混合物中具有微小等电点差异的成分。
首先，等电聚焦电泳技术在蛋白质研究中的一大应用是在蛋白质组学研究中的蛋白质分离和定量分析。
蛋白质组学是一门旨在研究生物体内所有蛋白质的种类、结构和功能的科学，而等电聚焦电泳则是其中一种重要的蛋白质分离技术。
通过等电聚焦电泳技术，我们可以将复杂的蛋白质混合物进行高效分离，获得不同pH值下的蛋白质谱带图谱。
这为后续的质谱分析和蛋白质鉴定提供了基础。
其次，等电聚焦电泳技术在疾病诊断和治疗中也有着重要的应用价值。
疾病的发生与蛋白质异常表达密切相关，因此研究蛋白质组学能够帮助我们更好地理解疾病的发生机制。
等电聚焦电泳技术在诊断疾病时，能够帮助我们发现和鉴定蛋白质异常表达的情况，从而为疾病的早期诊断提供依据。
此外，等电聚焦电泳技术还可以用来筛选和鉴定疾病标志物，为疾病的治疗和预后评估提供指导。
此外，等电聚焦电泳技术还在蛋白质结构和功能研究中发挥着重要作用。
蛋白质的结构和功能密切相关，而等电聚焦电泳技术可以帮助我们分离不同等电点的蛋白质，进一步研究其结构和功能特性。
通过等电聚焦电泳技术，我们可以对蛋白质进行进一步的研究，包括电泳迁移率差异、翻译后修饰、蛋白质亚型和蛋白-蛋白相互作用等。
尽管等电聚焦电泳在蛋白质研究中具有广泛的应用前景，但也存在一些挑战。
蛋白质等电聚焦
★
一 等电聚焦原理
等电聚焦是依据蛋白质分子或其他两 性分子的静电荷或等电点不同而进行分离 的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有 载体两性电解质形成的一个连续而稳定的 线性 pH 梯度中电泳。载体两性电解质是 脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极 为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。
蛋白质分子在偏离其等电点的 pH条件 下带有电荷，因此可以在电场中移动；当 蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷 数为零，在电场中不再移动，就会产生聚 焦现象，形成蛋白质区带，由此可将不同 等电点的蛋白质分开。
2.1.2操作方法 1．决定电极的极性 如pH梯度范围在6以下 时，则聚焦柱底的电极为正极。如pH梯度 的范围在6以上时，则柱底为负极。 2．装柱 按电极的极性与电极液的要求装柱 3．注入载体溶液 4．加重、轻混合液 5．连接冷凝水管 6．电泳
7．样品的收集 8．测每管的pH值和蛋白含量，将相近pH的同 一蛋白质的管合并 9．将分离的每一样品成分过SepHadexG25 （或G50），将蛋白质与载体分离开来
• 灌胶步骤： 1). 组装灌胶器； 2). 将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液 混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更 快（带手套，丙稀酰胺有毒）； 3). 加入过硫酸胺和 TEMED，轻轻混匀（开始 聚合，操作要迅速）； 4). 将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气 泡产生）；
5). 插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气 泡）； 6). 聚合约1小时； 7). 聚合完成，小心拔去梳子； 8). 将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白 样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确 定是否有渗漏。 注意： 1). 上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺， 否则电泳过程中会发生聚合；
2.2.2载体两性电解质的选择 载体两性电解质是一些具有相近等电点 的分子量为 600 － 900Da 的多氨基多羟基两 性化合物的混合物，它的选择要具备以下 条件： 1. 可溶性要好。 2. 紫外吸收低，不发荧光。 3. 在等电点处必需有足够的缓冲能力。
等电聚焦
等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）目前已广泛用于蛋白质分析和制备中，是20世纪60年代后才迅速发展起来的重要技术。
IEF的基本原理是，在电泳槽中放入两性电解质，如脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型、羧酸磺酸混合型），pH 范围有3～10、4～6、5～7、6～8、7～9和8～10等。
电泳时，两性电解质形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，正极为酸性，负极为碱性。
蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。
样品可置于正极或负极任何一端。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。
当置于负极端时，因pH＞pI，蛋白质带负电向正极移动。
随着pH的下降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。
当蛋白质移动到与其等电点相应pH 位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。
因此，IEF中蛋白质的分离取决于电泳pH梯度的分布和蛋白质的pI，而与蛋白质分子大小和形状无关。
IEF的优缺点。
优点：①分辨率很高，可把pI相差0. 01的蛋白质分开；②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。
③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。
④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。
缺点：①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。
但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，克服方法是在样品中多加些两性电解质。
②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。
实验等电聚焦法测定蛋白质等电点一、原理等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是20世纪60年代建立起来的一种蛋白质分离分析手段，多年来发展很快，已成为单相电泳中具有最高分辨率的技术。
IEF的特点是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（AmPholine）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
等电聚焦实验报告
1. 了解等电聚焦电泳（IEF）的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用等电聚焦电泳技术测定蛋白质的等电点（pI）。
3. 掌握实验操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理等电聚焦电泳（IEF）是一种利用pH梯度介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
其基本原理是在一个具有pH梯度的介质中，蛋白质分子根据其等电点在电场作用下向相应pH位置移动，直至聚焦于该位置。
蛋白质分子是两性电解质，其等电点（pI）是指蛋白质分子在溶液中呈电中性时的pH值。
在pH低于蛋白质的pI时，蛋白质分子带正电荷；在pH高于蛋白质的pI 时，蛋白质分子带负电荷。
在等电聚焦电泳过程中，当蛋白质分子移动到与其pI相等的pH位置时，其净电荷为零，停止移动，从而实现蛋白质的分离和聚焦。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：毛细管电泳仪、恒温水浴、pH计、移液器、超纯水系统等。
2. 试剂：蛋白质样品、两性电解质载体、尿素、磷酸、氢氧化钠、乙酸等。
四、实验步骤1. 准备样品：取适量蛋白质样品，加入适量两性电解质载体，制成蛋白质溶液。
2. 制备pH梯度：根据蛋白质的pI值，配制相应的pH梯度介质，置于毛细管中。
3. 样品上样：将制备好的蛋白质溶液加入毛细管中，注意避免气泡产生。
4. 设置参数：根据仪器要求，设置电泳电压、温度、时间等参数。
5. 运行实验：开启毛细管电泳仪，开始电泳实验。
6. 数据采集：实验结束后，采集数据，分析蛋白质的等电点。
五、结果与分析1. 根据实验数据，绘制蛋白质的迁移曲线，分析其等电点。
2. 与理论值进行比较，评估实验结果的准确性。
1. 等电聚焦电泳是一种有效的蛋白质分离和鉴定技术，具有分辨率高、操作简便等优点。
2. 通过本次实验，掌握了等电聚焦电泳的操作步骤，提高了实验动手能力。
3. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 精确配制pH梯度介质，确保pH梯度均匀。
b. 避免气泡产生，影响实验结果。
c. 严格控制实验参数，确保实验结果的准确性。
第五章 等电聚焦
Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University
Native PAGE和IEF原理的区别 PAGE和IEF原理的区别
Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University
蛋白质分子在偏离其等电点的pH 蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下 pH条件下 带有电荷，因此可以在电场中移动； 带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白 质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零， 质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零， 在电场中不再移动，就会产生聚焦现象， 在电场中不再移动，就会产生聚焦现象，形 成蛋白质区带， 成蛋白质区带，由此可将不同等电点的蛋白 质分开。 质分开。
Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University
Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University
PH梯度的形成过程 3.4 PH梯度的形成过程
pH梯度形成的时间, pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和 梯度形成的时间 凝胶的厚度而定.一般一块长12cm的玻璃, 凝胶的厚度而定.一般一块长12cm的玻璃,电极间 12cm的玻璃 的有效距离为10cm，凝胶的厚度为1mm， 的有效距离为10cm，凝胶的厚度为1mm，使用 10cm 1mm Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度 Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度 为载体两性电解质 pH 基本形成， 小时后无多大变化, 基本形成，2小时后无多大变化,如图
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等电聚焦ief电泳技术
等电聚焦[IEF]电泳技术等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。
⒈IEF的基本原理在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH 值逐渐增大。
如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。
同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。
可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
⒉pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用。
另一种是天然pH梯度。
天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。
电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。
电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。
由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。
pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2＞pI1，因此定位于第一种两性电解质之后，这样，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的线性pH梯度，如图16-3所示。
等电聚焦电泳的名词解释
等电聚焦电泳（Isoelectric Focusing Electrophoresis，简称IEF）是一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质分子的电泳技术。
它是生物化学和分子生物学领域中常用的一种重要的蛋白质分离方法，广泛应用于蛋白质组学、生物制药、临床诊断等领域。
等电聚焦电泳的原理是根据蛋白质分子的等电点（pI）不同，在具有连续pH梯度的介质中进行电泳分离。
蛋白质分子的等电点是指其电荷为零时所处的pH值。
由于蛋白质分子中含有可解离的氨基酸残基，如酸性氨基酸（Asp、Glu）和碱性氨基酸（Lys、Arg），因此蛋白质分子在一定条件下可以带正电荷或负电荷。
当溶液的pH值等于蛋白质分子的等电点时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，净电荷为零，此时蛋白质分子在电场中不发生移动。
在等电聚焦电泳过程中，首先将待分离的蛋白质样品加入到具有连续pH 梯度的凝胶介质中，然后施加直流电压使样品中的蛋白质分子根据其等电点在凝胶中迁移。
由于凝胶介质具有连续的pH梯度，蛋白质分子会迁移到与其等电点相对应的pH区域并停止移动。
经过一段时间的电泳，各种蛋白质分子根据其等电点分布在不同的pH区域，从而实现了蛋白质的分离。
等电聚焦电泳具有分辨率高、重复性好、样品用量少等优点，尤其适用于复杂蛋白质样品的分离。
然而，该方法的缺点是操作过程较为繁琐，需要较长的时间进行电泳分离，且对设备和试剂的要求较高。
尽管如此，等电聚焦电泳仍然是生物化学和分子生物学研究中不可或缺的重要技术手段。
在等电聚焦电泳过程中，凝胶介质的选择至关重要。
常用的凝胶介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和纤维素凝胶等。
其中，聚丙烯酰胺凝胶是目前最常用的凝胶介质，具有较高的分辨率和较好的稳定性。
琼脂糖凝胶则具有良好的透明度和生物相容性，适用于生物制药领域。
纤维素凝胶则具有较好的机械强度和较低的成本，适用于大规模生产。
此外，为了提高等电聚焦电泳的分离效果，还可以采用多种策略对凝胶介质进行处理。
等点聚焦电泳
等点聚焦电泳等点聚焦电泳（Isoelectric Focusing，简称IEF）是一种基于蛋白质等电点差异的分离技术。
它能够将样品中的蛋白质按照等电点的大小进行分离，从而实现蛋白质的高分辨率分离。
本文将介绍等点聚焦电泳的原理、操作步骤及其在生物学研究中的应用。
一、原理等点聚焦电泳是基于蛋白质在带电条件下在电场中的迁移速率与其等电点相关的原理。
蛋白质在特定pH值下，带有正、负电荷，而其等电点则是蛋白质在该pH值下带电量为零的点。
在等点聚焦电泳中，样品被置于pH梯度胶体中，然后通过电场作用，蛋白质会向其等电点迁移，直到在等电点处停止迁移。
二、操作步骤1. 准备样品：将待分离的蛋白质样品进行预处理，如去除杂质、浓缩等。
2. 准备等电聚焦胶：在胶板上形成pH梯度，通常使用聚丙烯酰胺胶。
可以通过添加缓冲剂或聚电解质来形成pH梯度。
3. 样品加载：将预处理的样品加载到胶上特定位置。
4. 等电聚焦：通过施加电场，使蛋白质在pH梯度中迁移，直到达到其等电点处停止迁移。
5. 胶固定：固化胶，使蛋白质分布固定在胶中。
6. 显色与成像：使用染色剂对蛋白质进行染色，然后使用成像设备进行成像分析。
三、应用领域等点聚焦电泳在生物学研究中具有广泛的应用。
以下是一些主要的应用领域：1. 蛋白质分析：等点聚焦电泳能够实现对复杂蛋白质混合物的高分辨率分离，为后续的质谱分析、蛋白质鉴定等提供了重要的前处理步骤。
2. 蛋白质组学研究：通过等点聚焦电泳可以对不同细胞、组织或生理状态下的蛋白质进行分离，从而揭示蛋白质组的差异，进一步研究蛋白质功能和调控机制。
3. 生物医学研究：等点聚焦电泳可以用于检测蛋白质的变异或突变，从而为疾病的诊断和治疗提供重要依据。
4. 药物研发：等点聚焦电泳可以用于筛选药物靶点、评估药物对蛋白质的作用，为药物研发提供重要的分析手段。
5. 环境监测：等点聚焦电泳可以用于分析环境中的污染物对生物体内蛋白质的影响，从而评估环境污染的程度和影响。
等电聚焦电泳(IEF)分离蛋白及测定蛋白质等电点
一、原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。
蛋白质在等电定时的特征
蛋白质在等电定时的特征等电定时（Isoelectric Focusing，IEF）是一种基于蛋白质在特定电场下被输运的分离方法。
它利用蛋白质在等电点（Isoelectric Point，pI）时，呈均匀分布的特性，将样品中的蛋白质分离出来。
蛋白质在等电定时中的电荷特性是其在该方法中得以实现的重要因素之一。
以下将从不同分类角度，详细讨论蛋白质在等电定时中的特征。
1.酸性蛋白质与碱性蛋白质根据蛋白质在景观pH下带有的正负电荷，可以将其分为酸性蛋白质和碱性蛋白质两类。
酸性蛋白质在等电定时中向阳极跑，碱性蛋白质则向阴极跑，这与其pI值有关。
pI值越低，表明蛋白质越向酸性方向，向阳极跑动的速度越快；pI值越高，表明蛋白质越向碱性方向，向阴极跑动的速度越快。
因此，酸性和碱性蛋白质的运动方向和速度是可以通过其pI值预测的。
2.单质和复合物单质和复合物是在等电定时中的另一种分类方式。
单质指的是一个蛋白质分子，而复合物则是由多个蛋白质分子组成的。
由于蛋白质复合物在运动过程中比单质分子的运动速度要慢得多，因此在等电定时过程中，它们往往被观察到形成了更大的聚集物。
相反，单质在移动时相对较快，未形成明显的聚集物。
因此，单质和复合物可以通过等电定时的形态来进行区分。
3.重组蛋白质重组蛋白质是将基因中编码的蛋白质表达到外在环境中后得到的蛋白质。
它们通常通过大量的重组DNA技术合成，并通过等电定时进行纯化和表征。
等电定时可以准确地确定其pI值、形态和单质/复合物的状态，并确定所需的浓度和复杂度，这有助于重组蛋白质的纯化和表征。
4.膜蛋白膜蛋白是生物体内的重要分子，其中许多膜蛋白在等电定时中可以快速聚集，并形成尖峰状。
这是由于膜蛋白具有一些可变的、静电性质的区域，这些区域能够在等电定时中对蛋白质的运动产生影响。
与普通蛋白质不同，膜蛋白的聚集可能导致其与其他膜蛋白和非膜蛋白之间形成不同的聚集体系，这有助于识别特定膜蛋白并对其进行分离和定量。
6第三节 等电聚焦(IEF)-生化分析汇总
等电聚焦技术
根据建立pH梯度原理的不同，梯度又 分为载体两性电解质pH梯度和固相pH梯度。 前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH 梯度，后者是将缓冲基团成为凝胶的一部 分。
三、载体两性电解质 1. 载体两性电解质的合成 1961年Svensson H提出的载体两性电解质 的理论基础，1964年Vesterberg O利用多乙烯 多胺和不饱和酸合成了载体两性电解质，它 是由脂肪族多氨基多羧基的异构物和同系物 组成，它们有连续改变的氨基与羧基比。
Байду номын сангаас
提高疏水蛋白在水中的溶解性
1. 尿素
改善疏水蛋白接近pI时的可溶性，也可增加
多肽的溶解度。 2. 非离子去污剂和两性离子去污剂 能在不破坏蛋白质结构保持生物活性的情况 下改善蛋白的溶解度。
尿素和去污剂结合使用是提高疏水蛋白可溶性 的最好方法。
7.加样方法
根据等电聚焦的原理，样品可加在凝胶上任何合适的位置都可 得到相同的结果。
2. 引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带
有最低等电点的分子（带最多的负电荷）将最快
的向阳极迁移，当它达到净电荷是零的位置时才
停止。
其次是一些低pI的载体两性电解质分子 （带有其次多的负电荷）也将向阳极移动， 直到它的净电荷被减少到零即停止。
3. 电泳结束后的变化
所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的办
第三节 等电聚焦
(isoelectric focusing，IEF)
一、概述 等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)是60 年代建立的一种高分辨率的蛋白质分离和分析 技术。它是利用具有pH梯度的支持介质分离 等电点不同的蛋白质的电泳技术。
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二.第一向等电聚焦原理及操作
等电聚焦程序
11cm胶条
水化 12小时（20℃） 主动水化（50V）或被动水化 S1 S2 S3 S4 S5 250V 线性 30分钟 30分钟 4小时 40,000伏小时 任意时间 除盐 除盐 升压 聚焦 保持 1000V 快速 8000V 线性 8000V 快速 500V 快速
双向电泳培训
主要内容
双向电泳培训实验内容
1.样品制备及试剂准备
2.第一向等电聚焦原理及操作 3.第二向SDS-PAGE实验前准备—试剂配制及制胶 4.第一向等电聚焦后胶条的处理---平衡及转移 5.第二向SDS-PAGE原理及操作
6.染色及成像
双向电泳培训前期准备工作内容
C. 取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室温中放 置10分钟。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。
D．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+） 对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产 生气泡。
双向电泳上样
水化上样操作
二.第一向等电聚焦原理及操作
双向电泳培训实验内容
二.第一向等电聚焦原理及操作
1. 原理
在第一向分离中蛋白质先按其等电点 （isoelectric point pI值）分开。pI值就是使蛋 白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特 定pH值。这项将蛋白质按其等电点分离的技 术称为等电聚焦（IEF）。
Isoelectric Focusing
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
双向电泳培训实验内容
二.第一向等电聚焦原理及操作
2. 操作-----双向电泳上样
A. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽 两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不 要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
B. 胶条长度加样体积样品蛋白量7 cm:125 ul(169 ug), 11 cm:185 ul(250 ug), 17 cm:300 ul(405 ug)-----考马氏亮蓝R-250染色
1.培训使用主要仪器
双向电泳培训前期准备工作内容
2.培训使用主要耗材
双向电泳培训实验内容
一.样品制备及试剂准备
1. 从冰箱中取出4℃保存的双向电泳启动试剂 盒。
2. 在上样缓冲液干粉瓶中加入6.1ml去离子水， 使之溶解。 3. 吸取2ml溶解后缓冲液，加入到E.coli蛋白样 品瓶中，制成浓度为1.35mg/ml的蛋白质样品。
原理
等电点（isoelectric point）:在某一pH时，蛋白质的净电荷为零。 蛋白质的等电点取于它的氨基酸组成和构象
The 1st D: Isoelectric Focusing
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
二.第一向等电聚焦原理及操作
等电聚焦程序
7cm胶条
水化 12小时（18℃） 主动水化（50V）或被动水化 S1 S2 S3 S4 S5 250V 500V 线性 快速 30分钟 30分钟 3小时 20,000伏小时 任意时间 除盐 除盐 升压 聚焦 保持
4000V 线性 4000V 快速 500V 快速
二.第一向等电聚焦原理及操作
等电聚焦程序
17cm胶条
水化 12小时（20℃） 主动水化（50V）或被动水化 S1 S2 S3 S4 S5 250V 线性 30分钟 1小时 5小时 60,000伏小时 任意时间 除盐 除盐 升压 聚焦 保持 1000V 快速 10000V 线性 10000V 快速 500V 快速
2. 操作-----双向电泳上样
E. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶 条长度,本实验1.5ml)，防止胶条水化过程中液 体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条， 使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
F. 对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放 入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。
B. 仪器组装
C. 制胶
配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。配12ml凝胶 溶液，每块凝胶6ml，将溶液分别注入玻璃板 夹层中，上部留约1cm的空间，用MilliQ水或 水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合45 分钟。(7cm胶条) 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水 或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。
Carboxylic Groups
Acidic pH R-COO- + H+ => R-COOH Basic pH R-COOH + OH- => R-COO- + H2O
Amino Groups
Acidic pH R-NH2 + H+ => R-NH3+ Basic pH R-NH3+ + OH- => R-NH2 + H2O
C. 制胶
7.5% 30% Acrylamide/Bis 25 ml 12% 40 ml 3.3(X%) = (A)* ml X%
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 25 ml 1.0 ml 25 ml 1.0 ml 25 ml 1.0 ml
10% SDS
双向电泳培训实验内容
3.第二向SDS-PAGE实验前准备—试剂配制及制胶 A. 试剂准备 161-0157 30% Acrylamide/Bis Solution, 29:1, 2×500ml预混合制胶液 161-0700 Ammonium Persulfate, 10 g 161-0801 TEMED, 50 ml 161-0700 Ammonium Persulfate, 10 g 161-0798 Resolving gel buffer, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 1L 161-0416 SDS Solution, 10 % (w/v ), 250 ml