完整版实验五 DMEM培养液的配制.ppt

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培养基成分及配制课件

2
硼酸
3
硫酸锰
4
硫酸锌
5
钼酸钠
6
硫酸铜
7
氯化钾
KI H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCL2.6H2O
用量（mg/L)
0.83 6.2 22.3 8.6 0.25 0.025 0.025
培养基成分及配制课件
1.大量元素
2021/8/25 培养基成分及配制课件
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2021/8/25 培养基成分及配制课件
3. 肌醇（环己六醇）
促进糖类物质的相互转化和活性物质作用的发挥促进愈伤组织生长以及胚状体和芽的形成对组织细胞繁殖、分化的促进作用使用浓度100 mg/L
注：用量过多则促褐变
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2021/8/25 培养基成分及配制课件
4. 氨基酸
是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、
在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官。
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2021/8/25 培养基成分及配制课件
在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。在植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。
谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。
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2021/8/25 培养基成分及配制课件
5. 天然复合物
为了特殊的培养目的，在一部分培养基中还添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西红柿汁，香蕉粉，橘子汁，可可汁等天然复合物以及活性炭，渗透调节剂等。

培养基及其配制PPT课件

氯是光合作用水光解的活化剂微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢
的调节。
第11页，共50页。
缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。
桃树
第12页，共50页。
缺铜症状：
新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。
◆对生长，分化等有很好的促进作用 ◆主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素
◆常用维生素有VB1和VB6
第18页，共50页。
5、肌醇
◆环己六醇
◆细胞壁的构建材料 ◆参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动 ◆促进活性物质发挥作用
第19页，共50页。
6、氨基酸 ◆蛋白质的组成成分 ◆有机氮源
◆可直接被细胞吸收利用 ◆培养基中常用的是甘氨酸
❖ 所谓母液是欲配制液的浓缩液。
❖ 意义: ①保证各物质成分的准确性 ②配制时的快速移取 ③便于低温保藏。
第33页，共50页。
母液的配制方法：单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓
度的母液。一般用mg/ml 。
混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍
数称量，分别溶解后再混合成母液。
第42页，共50页。
化合物名称
NH4NO3 KNO3 (NH4)2SO4 NaNO3 KCl CaCl2•2 H2O
Ca(NO3)2•4H2O MgSO4•7H2O Na2SO4 KH2PO4 K2HPO4 FeSO4•7 H2O Na2-EDTA Na-Fe-EDTA FeCl3•6H2O Fe(SO4) 3 MnSO4•4 H2O ZnSO4•7 H2O Zn (螯合体) NiCl2•6H2O CoCl2•6 H2O CuSO4•5H2O AlCl3 MoO3

培养细胞所需的几种主要液体的配制方法

培养细胞所需的几种主要液体的配制方法：1．DMEM维持培养基DMEM基础培养基95ml 95ml胎牛血清5ml谷氨酰胺液2ml含有DMEM基础培养基95ml，胎牛血清5ml，谷氨酰胺液2ml。

混合均匀，密封后与4摄氏度保存。

2．D-hank’sD-hank’s干粉g(1袋)NaHCO3超纯水1000ml取D-hank’s干粉加入超纯水500ml搅拌均匀，加入的NaHCO3搅拌至完全溶解，倒入1000ml容量瓶中，用1mol/l的HCL或者NaOH 溶液调整溶液的PH值为7.2,最后经过∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装后4摄氏度保存.3. DMEM完全培养基85ml,DMEM基础培养液85ml,, l-谷氨酰胺溶液, 2ml1000u/ml双抗液1ml胎牛血清15ml取DMEM基础培养基85ml, 胎牛血清15ml,l -谷氨酰胺溶液2ml,混合均匀,密封于4摄氏度保存.4. DMEM细胞基础培养基DMEM干粉(1袋)Na2HCO3超纯水1000 ml取DMEM干粉1袋()倒入烧杯中,取800ml 超纯水溶解培养基干粉,搅拌均匀,然后向溶液中加入的Na2HCO3,搅拌至完全溶解后倾入1000 ml容量瓶中,再用1mol/l 的HCL 或者1mol/l的NaOH溶液调整溶液的PH值为7.2,混合均匀后,定容,∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装4摄氏度保存.5. l-谷氨酰胺溶液l-谷氨酰胺DMEM基础培养基100ml称取l-谷氨酰胺干粉g于烧杯中,加80 ml超纯水于烧杯中搅拌溶解,用100ml容量瓶定容,∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装于小瓶中于-20摄氏度保存.使用添加量是1ml/50ml,使用浓度是2mmol/l.青霉素(注射用) 80万单位(1瓶)链霉素(注射用) 0.8 g％生理盐水80ml取注射用青霉素100万单位及注射用链霉素于80ml DMEM培养基中,搅拌混合均匀,用∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装于小瓶中-20℃％的胰酶溶液胰蛋白酶干粉 0.25 gDMEM基础培养基100ml称取胰蛋白酶干粉0.25 g于烧杯中,加入80ml DMEM基础培养基溶液,进行搅拌溶解,100 ml容量瓶定容,∮0.22微升的滤膜过滤除菌,分装于小瓶中于-20℃条件下保存.8.mg/ml的内皮细胞生长添加物溶液(ECGS)ECGS干粉 15 g(1支)无菌超净水 6 ml取内皮细胞生长添加物15 g(1支),加入6 ml无菌超纯水完全溶解后,分装于-20℃条件下保存.在培养基中添加剂量为1ml/50ml,即培养基浓度为50微克/ ml.9.PBS 液KCLNaclNa2HPO4.12H2OKH2PO4分别取KCL, Nacl, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4于烧杯中,加入适量的超纯水搅拌至所有药物完全溶解,然后倾入1000ml容量瓶中,最后定容并调节PH为7.20,分装于4℃保存,。

DMEM高糖配方培养基

DME高糖配方/F12培养基说明书产品代号： MD207-050 一．【组成成分】成分 mg/L 成分 mg/L 成分 mg/L 无水氯化钙 116.6 L- 亮氨酸 59.05 亚油酸 0.042 五水硫酸铜 0.0013 L- 赖氨酸盐酸盐91.25 硫辛酸 0.105 九水硝酸铁 0.05 L- 蛋氨酸 17.24 酚红 8.1 七水硫酸亚铁0.417 L- 苯丙氨酸 35.48 1,4- 丁二胺二盐酸盐 0.081 氯化钾 311.8 L- 丝氨酸26.25 丙酮酸钠 55氯化镁 28.64 L- 苏氨酸 53.45 维生素 H 0.0035 无水硫酸镁 48.84 L- 丙氨酸4.45 D- 泛酸钙 2.24 氯化钠 6999.5 L- 天门冬酰胺 7.5 氯化胆碱 8.98 无水磷酸二氢钠 54.35 L- 天门冬氨酸 6.65 叶酸 2.65 磷酸氢二钠 71.02 L- 半胱氨酸盐酸盐 17.56 i- 肌醇 12.6 七水硫酸锌 0.432 L- 谷氨酸 7.35 烟酰胺 2.02L-精氨酸盐酸盐147.5 L-脯氨酸17.25盐酸吡哆醛2L-胱氨酸盐酸盐31.29 L-色氨酸9.02 盐酸吡哆醇0.031L-谷氨酰胺365 L-酪氨酸38.4核黄素0.219甘氨酸 18.75 L- 缬氨酸 52.85 盐酸硫胺 2.17L-组氨酸盐酸盐31.48 D-葡萄糖3151胸苷0.365L-异亮氨酸54.47次黄嘌呤2维生素B12 0.68产品指标】外观粉红色固体粉末溶解性完全溶解，溶液澄明。

pH值①加 NaHCO3 6.60- 7.20②不力卩 NaHCO3 5.50-6.10水分（% 屿.0渗透压（ mOsm/kgH2O①加 NaHCO3 27*302②不加 NaHCO3 23*263细菌内毒素（EU/ml）<10微生物检查（CFU/g <000细胞生长试验细胞形态与标准细胞形态相似细胞数量加10%小牛血清培养4天，细胞密度从104细胞/ml增加到105细胞 /ml 。

DMEM培养基制备SOP

DMEM培养基的配置1 实验目的➢配制DMEM培养基2 实验原理2.1 DMEM培养基的用途➢➢DMEM and Click’s media have an osmolarity that is more compatible with mouse serum than RPMI; in fact, RPMI was specifically designed for the culture of human cells.2.2 本实验室在培养小鼠来源细胞时选用DMEM培养基的理由➢2.3 培养基中各种组分的作用及添加依据2.3.1 Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸）：25mM /L (/L)，不加碳酸氢钠时pH为，加碳酸氢钠时pH为。

单独配制时，配制为100X即/ml。

➢配制 /L (/mL) Hepes：12g的Hepes定容到20ml PBS中，过滤除菌，分装为1ml/管，－20°C保存。

Cell Biology建议为4°C保存。

➢HEPES 是一种非离子缓冲液,在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力,但是非常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒.HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠(/L)共用,以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加(不懂，何为抵消？邹强).在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中. 来自网络。

2.3.2 缓冲系统: 来自网络。

➢大多数细胞所需pH 在7.2 - 7.4.但是,细胞培养最适pH值随培养的细胞种类不同而不同.成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 - 7.4).➢由于多数培养液靠碳酸氢钠(NaHCO3)与CO2体系进行缓冲,因此,气相中的CO2浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡.如果气相或培养箱空气中CO2浓度设定在5%,培养液中NaHCO3的加入量为/L;如果CO2浓度维持在10%,培养液中NaHCO3的加入量为/L.➢细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换.➢大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色.➢碳酸氢钠：CO2浓度为5%时，培养液中碳酸氢钠浓度为/L；CO2浓度为10%时，培养液中碳酸氢钠浓度为/L（科学出版社.细胞实验指南P6）。

1640和DMEM的配制方法

1640和DMEM的配制方法RPMI 1640细胞培养液的配制1)配制培养基最好使用新制备的三蒸水。

一般在试验前当天或前一天制备为好。

调节p H值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。

2) 制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。

3)溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。

振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。

4) 补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。

5) 加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。

市售青霉素为80万U／瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加0.5ml即可。

市售链霉素为100万U ／瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加0.5ml即可。

无链霉素的情况下，用庆大霉素代替，终浓度调为50～200U/ml。

6) 调pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情况下），然后用5％NaHCO3调节pH到7.2。

7) 过滤除菌：宜采用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。

注意滤膜正面（光面）朝上。

过滤后分装于小瓶中（100或200ml）。

8) 加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（－20℃）。

临用前将加入小牛血清(10%~20%)。

【注意事项】每次配液时，需要的其他辅助性液体（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同时配制，分别过滤。

市售小牛血清使用前都应该灭活（56℃，30min），以消除补体活性。

动物血清个体差异大，故而每一批血清都进行严格检测，同时进行无菌试验。

优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。

生化检测总蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2 g／100ml。

完整版实验五 DMEM培养液的配制.ppt

实验五dmem培养液的配制500ml大烧杯玻璃棒250ml500ml盐水瓶酸度计50ml小烧杯3个孔径022m微孔滤膜一次性滤器一次性滤纸去离子水灭活的小牛血清dmem干粉青霉素链霉素nahco3超净工作台磁力搅拌器电子天平药匙实验材料dmem干粉1瓶1000ml量nahco337gl谷氨酰胺02g超纯水1000ml配方?取清洗干净的500ml大烧杯一个加入新鲜制备的三蒸水约300ml加热至1530
课件
【配制方法】
根据配方要求，加入准确称取的NaHCO3 1.85g，L-谷氨酰胺0.1g，充分摇匀至完全溶解；加入已经制备好的双抗溶液，使青霉素和链霉素的最终使用浓度达到100μg/mL；加入培养基总体积约10％的已灭活的小牛血清；
课件
【配制方法】
用浓度为7.4％的NaHCO3溶液调整溶液的pH值为7.2~7.4，加超纯水定容，并将培养液转入盐水瓶；用一次性滤器过滤上述培养液到灭菌的盐水瓶，封口，4℃保存备用。
【NaOH的配制过程】
NaOH 10g 超纯水 250mL 边加边搅拌，溶解过程会产热。
课件
【课程安排】
1、每组确定本组的D-Hank’s液是否有？是否已过滤除菌； 2、每组的EDTA需要高压灭菌； 3、需要配制新鲜的1M HCl和1M NaOH 溶液，以及7.4％的NaHCO3溶液； 4、需要重新灭菌5mL枪头； 5、每组准备一铝饭盒，内放小剪刀一把，小镊子一把，手术钳一把，大剪刀一把，高压灭菌；
课件
课件
课件
课件
实验五 1M HCl的配制 1M NaOH的配制
【实验材料】
250mL烧杯玻璃棒 250mL盐水瓶一次性滤纸去离子水电子天平药匙 5mL 移液器 5mL吸头 NaOH 浓HCl

培养液的组成和制备PPT课件

但血清成分个体差异大，常影响实验结果，来源又受到限
制，易受污染。优质血清呈透明，淡黄色、不溶血或少
溶血。
第10页/共33页
（二）水解乳蛋白
为淡黄色粉末，易潮解结块。但不影响使用
蛋白酶、肽酶水解
乳白蛋白
水解乳蛋白。
含有丰富的氨基酸。是常用的天然培养基。
使用方法：
用Hanks液配制成0.5%溶液（酸性），一般与合成培养基按1：1比例混合使用。
或40C保存。
第24页/共33页
（三）胶原蛋白酶液
1、机理：
使细胞间质的脯氨多肽水解，从而使细胞分散。
2、来源：
从芽孢杆菌中提取（溶组织梭状芽孢杆菌） 3、缺点：胶原酶中含羧菌肽酶（0.57~0.59u / mg），
具有较强的毒性，能破坏细胞膜上的蛋白质和多肽，从而导致细胞膜通透性改变。因此，用它消化组织时，应采取多步收集法（20~30分/ 次），这样，才可获得完整细胞膜和最大活细胞收率。 4、特点：在Ca++，Mg++存在下，仍有活性，血清也
不同的激素对细胞存活与生长显示有不同效果。
如：胰岛素--------------促进葡萄糖、氨基酸的吸收。
生长激素---------------促进有丝分裂。
氢化可的松---------有利于细胞粘着、细胞增殖。
• 9、生长因子类：主要由组织或血清提供。
如：成纤维细胞生长因子（FGF），
表皮生长因子（EGF）。第5页/共33页
• 4、粘度：血清的存在，直接影响培养液粘度。粘度对细胞生长影响较少，但在细胞培养或用胰蛋白酶处理时，为尽量减少细胞损伤，可通过提高培养液粘度来克服。加羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮来增加粘度，这对低或无血

培养液

1把干粉加入三蒸水中，缓慢搅拌，并将袋中微量粉末冲下。

2加NaHCO3 2.0g/L 1640培养液（或3.7g/L DMEM培养液）。

3稀释至1L，搅拌4小时以上，至粉末完全溶解。

4用1N HCl或1N NaOH将pH调低于正常pH0.2-0.3。

(在正常情况下，培养液pH介于7.2-7.4间，呈桃红色。

）5每升培养液加青霉素0.0583g，链霉素0.1000g，搅拌令之溶解。

6抽滤灭菌。

7分装时，加入10%小牛血清，4o C保存。

* MEM培养液临抽滤时加入L—谷氨酰胺0.2g/L。

* DMEM培养液分装时加入1%的非必需氨基酸。

消化液(0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA)1称取胰蛋白酶粉末0.25g，先用少许灭菌过的pH 7.2的PBS液调成糊状，然后再补足100ml。

2置室温搅拌4小时或冰箱内过夜，过滤灭菌。

3称0.02g EDTA，溶于100ml PBS 中，搅拌至溶，高压灭菌。

4将EDTA 和胰蛋白酶按1：1的比例混合，4o C保存。

PBS液1 准确称取以下各成分：KCl 0.2 gKH2PO4 0.2 gNaCl 8.0 gNa2HPO4·12H2O 2.08 g2 依次溶解在三蒸水中，待前一种完全溶解后，再溶解下一种成分，最后补足 1000ml水。

3 分装瓶中，高压灭菌，4o C保存。

D-Hank,s液1 准确称取以下各成分：KCl 0.4gKH2PO4 0.06gNaCl 8.0gNaHCO3 0.35gNa2HPO4·12H2O 0.08g酚红 0.01g2 以上成分依次溶解于三蒸水中，并不时搅动(注意应待前一种试剂完全溶解后再溶解下一种成分)。

3 将配好的溶液移入容量瓶中，补足水充分混匀。

4 分装瓶中，高压蒸气灭菌，4o C保存。

1 准确称取以下各成分：CaCl2 (无水) 0.14gKCl 0.4gKH2PO4 0.06gMgCl2·6HO 0.10gMgSO4·7HO 0.10gNaCl 8.0gNaHCO3 0.35gNa2HPO4·12HO 0.12gD葡萄糖 1.0g酚红 0.01g2 将CaCl2 先溶解在100ml三蒸水中。

DMEM

DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，DMEM细胞培养基是在MEM培养基的基础上研制的。

与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。

高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。

这种培养基的特点：（1）氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；（2）维生素含量为依格尔培养基的4倍；（3）含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸；（4）含有微量的铁离子。

该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养;如A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等细胞系的培养。

DMEM细胞培养基（二）配制方法及注意事项配制方法（1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期培养基总体积少5％的双蒸水。

（2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，不要加热。

（3）水洗包装袋的内部，转移全部的痕量干粉到容器内。

（4）加NaHCO3到培养基中。

（5）用双蒸水稀释到想要的体积，搅拌溶解。

注意不要过分搅拌。

（6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值，由于pH值在过滤时会上升0.1到0.3，因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0.2到0.3。

培养基在过滤前要保持密封。

配制培养基要注意以下问题：●认真阅读说明书。

说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。

这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。

●配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。

●配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。

●所用器皿应严格消毒。

●配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。

●液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基，它是一种灭菌后保证无菌的溶液，必要时可制成无内毒素等的溶液，可节省科研人员的工作量。

母液的配制ppt课件

目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，比较稳定，且不易发生沉淀。
母液的配制
3、MS铁盐母液的配制
药品名称
规定用量扩大称取量mg 母液定容
mg /L 倍数
体积 ml
FeSO4.7H2O
27.8 100 1390
Na2-EDTA
37.3
100 1865
按照扩大倍数称量
母液分装
溶解按顺序混合
定容
保存于冰箱
母液的配制
五、实验方法及步骤 1.大量元素母液的配制
即含N、P、K、Ca、Mg、S六种元素的混合溶液，一般配成浓度为10倍或20倍的母液。
药品名称
KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4
规定用量扩大 mg /L 倍数
1900 10
理论知识：
培养基：是植物组织培养的物质基础，也是组织培养能否成功的重要因素之一。
培养基的主要成分是植物生长发育所必需的各种营养元素。
（主要成分）无机盐类：大量元素、、铁盐有机营养成分：维生素、肌醇、氨基酸等植物生长调节剂：细胞分裂素类、生长素类： IAA（吲哚乙酸）、萘乙酸（NAA）
母液的配制
母液的配制
2、微量元素母液的配制
药品名称
规定用量扩大
ml/L
倍数
称取量mg 母液定容体积 ml
MnSO4·4H2O 22.3
1000 22300
ZnSO4·7H2O 8.6
H3BO3
6.2
1000 8600 1000 6200
1000
KI
0.83
Na2MoO4·2H2O 0.25