8吸光光度法

配制一组标准浓度系列
目视比色法
[Fe(SCN)n]3-n
Cx c1 c2 c3 c4 c5
三. 仪器和方法 分光光度法 : 仪器—分光光度计
基本组成：
光源 单色器 样品室 检测器
显示器
三. 仪器和方法
＊ 光源 (钨灯、氢灯、氘灯）
基本要求 :
能发射紫外光区或可见光谱区的连续光谱； 足够的辐射强度、稳定性较好、使用寿命较长
一. 概述 吸光光度法:
基于物质对光的选择性吸收而建立的 分析方法。
分类：根据物质所吸收光的波长范围不同， 分为紫外、可见及红外分光光度法。 基本方法： 有色物质浓度 ~ 颜色深浅 ~ 吸收光程度 通过比较颜色深浅（吸收光程度），测 定物质的浓度。
一. 概述
方法分类和比较
比色分析法
测定下限
10-5 ~ 10-6 mol·L-1 5% ~ 10%
(1)光电管
(2)光电二极管阵列
三. 仪器和方法
(1)光电管
涂光敏材料
光照 光敏材料 光强度大
产生电子
电压
产生电流 电流大
三. 仪器和方法
(2)光电二极管阵列
光照射
电容器 充电 电容器 放电
再次充电 测量周期
电容器充电的电量每个二极管检测到的光子 数目成正比光子数与光强度成正比。通过测量整 个波长范围内光强的变化就可得到吸收光谱。
三. 仪器和方法
＊显示器
由检流计、数字显示、微机组 成的自动控制和结果处理系统
四、显色反应和显色条件的选择
1.显色剂作用 2. 显色反应的选择 3. 影响显色反应的因素
4. 显色剂的分类
四、显色反应和显色条件的选择
1.作用
无色或浅色 +显色剂 有色物 试样 配合反应 比色
显色反应
氧化还原反应 缩合反应 重氮化—偶氮化反应
= abc
A ∝ cb 当一束平行单色光通过溶液时，溶液的 吸光度A与溶液的c和b成正比。 当 b 一定时， A ∝ c， 可以定量
二 . 吸光光度法的基本原理
注意 :
A = lg
I0 I
= abc
（1） 物质不吸光， I=Io ， A=0 物质吸收部分光， I＜Io， A＞0 吸收光 ， A ， 物质浓度 。
吸光光度法
王 燕
光分析方法
可见分光光度法 紫外可见分光光度法 原子吸收法
分子光谱
原子光谱
红外光谱法
光谱分析法
原子发射法 荧光光谱法 核磁共振法
概述
吸 光 光 度 法
原理
物质对光的选择性吸收
光的吸收定律
仪器和方法 显色反应和显色条件的选择
入射光 测定条件的选择 参比液 读数范围 单组分测定 具体应用 多组分测定 示差法测定
四、显色反应和显色条件的选择
2.显色反应的选择
(1)灵敏度高 (2) 选择性好 (3) 有色物组成恒定，化学性质稳定 (4) 显色剂在测定波长处无明显吸收 κ=104－105
对比度=λmax有色物 -λmax显色剂＞60nm
四、显色反应和显色条件的选择
3.影响显色反应的因素
M + R MR (1) 显色剂用量 根据吸光度A与显色剂浓度cR的关系来确定
分光光度法
10-5 ~ 10-8 mol·L-1
相对误差
2% ~ 5%
适用于分析半微量和微量的物质
一. 概述
方法的评价 快速、简便 显色 比色
灵敏度高：浓度下限达10-5~10-6 mol· -1 L
准确度高：相对误差通常为2~5％，
分析有色、无色、浅色物
适用面广
溶液状态、均质固态样品
用于化学平衡等的研究
cR选择——引起A变化最小处的cR（即曲线平坦处）
四、显色反应和显色条件的选择
例：
(2) 显色溶液的pH值
pH=1.8~2.5 pH=4~8 pH=8~11.5 Fe(ssal)+ 紫红色 Fe(ssal)-2 橙红色 Fe(ssal) 3 3- 黄色
测定不同pH值下，显色溶液的吸光度A， 以A为纵坐标，pH为横坐标，制图。 选择曲线平坦处pH 显色时间和温度 由实验得出 溶剂 一般选择水作溶剂
二 . 吸光光度法的基本原理 1.可见光与颜色
阳光 复合光
连续光谱
棱镜 由两种或两种以上波长的光所组成
物质
不连续光谱
可见光区的划分 : λ/nm
400 450 500 550 600 650 760
二 . 吸光光度法的基本原理
互补光的对应关系
光的互补：蓝黄
二 . 吸光光度法的基本原理
2. 物质对光的选择性吸收
二 . 吸光光度法的基本原理
（3）是物质的吸光能力的度量。同一吸收物 质在不同波长下的值不同。在λmax处的 max表 明了吸收物质最大限度的吸光能力，反映了测 定可能达到的最大灵敏度。 （4） max越大表明该物质的吸光能力越强， 用光度法测定该物质的灵敏度越高。 >105：超高灵敏； = (6~10）×104 ：高灵敏； = 104~103 ：中等灵敏； < 103 ：不灵敏。
-6
-6
= 8 . 9 × 10
-6
mol • L
-1
A = κbc
∴κ = A cb = = 1 . 1 × 10 L • mol ×2
4 -1
• cm
-1
二 . 吸光光度法的基本原理 4. 吸光度测定方法
(1) 配制一组浓度系 列的标准溶液（ci）
步骤
仪器测量
一组相应的吸 光度值（Ai） 工作曲线
例1=2 A2 A1 1 2 但 A1 》 A2 0
在max
处
单色光不纯
但 κ2=0
测量误差较小
二 . 吸光光度法的基本原理
2）溶液本身引起的偏差
（1）若溶液浓度＞0.01mol· -1时，粒子 L 间的相互作用 （2）溶液以胶体、乳浊、悬浮状态存在 时，有反射、散射作用
二 . 吸光光度法的基本原理
若入射光包含λ1和λ2二种波长光, 当照射试样后
Io
Io1 试 样 Io2 I2 I1 I
按光吸收定律:
A 1 = κ λ1 cb = lg I o1 I1
A总 A 1 A 2
A 2 = κ λ2 cb = lg I o2 I2
-κ λ2 cb
I 1 = I o1 × 10
二 . 吸光光度法的基本原理 A、T% 和c 的关系
A = abc
- lg T % = A = abc
A、T% 、c 。
二 . 吸光光度法的基本原理
（6） 吸光系数的二种表示形式
A=abc A= bc
吸光系数a
摩尔吸光系数
浓度为1g/L的溶液，在某 浓度为1mol/L的溶液， 波长时，用1cm的比色皿， 在某波长时，用1cm的比 意义 所测得的吸光度 色皿，所测得的吸光度 L/g· cm L/ mol · cm
仪器测量
A
制图（ci 为横坐标， Ai 为纵坐标） · · (2) 配制样品
Ax ·
Ax
相同条件
· ·
查图得出cx
cx
c
二 . 吸光光度法的基本原理
5. 偏离Beer-Lanbert定律的原因
出现的现象： A与c偏离线性 在高浓度端， 工作曲线呈弯曲状。 产生原因：
c A
1） 单色光不纯
现有仪器无法获得纯单色光，只能获得小 范围的复合光。
（透镜或凹面镜）
三. 仪器和方法 光栅分光原理
利用不同波长入射光产生干涉条纹的衍射 角不同而将复合光分成单色光。
三. 仪器和方法
＊ 样品室
用于放置各种类型的吸收池(比色皿)和相 应的池架附件
比色皿: 石英池和玻璃池 比色皿厚度: 0.5, 1, 2, 3, …cm
三. 仪器和方法
＊ 检测器（光电管或光电倍增管） 作用:通过光电效应，使透过吸收池的光 信号变成可测的电信号的装置。 要求：对测定波长范围内的光有快速、 灵敏的响应，产生的光电流应与照射于 检测器上的光强度成正比。
二 . 吸光光度法的基本原理 （3）溶液内部的化学变化
包括离解、缔合、生成新物质、形成异构体
使原物质浓度改变
吸光度值变化 产生偏离
2 CrO
24
例:
Cr 2 O 7 + H 2 O
2-
+ 2H
+
(橙色)
κ Cr
2O 7 2-
(黄色)
>> κ CrO
24
λmax=450nm
pH
， 平衡
移,
A总
三. 仪器和方法
- κ λ1 cb
+ I o2 × 10
- κ λ2 cb
讨论 :
当为纯单色光时， λ1=λ2
κλ1= κλ2
A总= κλ1bc
当单色光不纯时， λ =λ 1 2 A总∝ c
κλ1= κλ2
线性破坏
结论： 单色光纯度越差，线性越差
二 . 吸光光度法的基本原理
减少单色光不纯引起偏差方法 ——— 在max处测量
I dI I
k 1 db k 1 db
0 b
吸光度 I
k 2c
A g
I0 I
k 1b
二 . 吸光光度法的基本原理
Beer - Lanbert定律——光吸收定律
I0
A = lg
A——吸光度 a——吸光系数 b——光程距离
I Io ——入射光强度 I——透射光强度 c——浓度
单位
二 . 吸光光度法的基本原理
摩尔吸收系数κ的讨论
（1）在数值上等于c=1 mol · -1、b=1cm时该溶 L 液在某一波长下的吸光度。是吸收物质在一定波 长和溶剂下的特征常数。 （2）不随c和b的改变而改变。在温度和波长等 条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关，