蛋白质分离、纯化实验技术原理26页PPT
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第十节
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
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Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质的分离纯化.ppt
logMr
三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 法测定相对分子质量
聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称 圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯 酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而 成）为支持物 。
蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率
决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电 荷效应、分子筛效应)。
v =沉降速度（dx/dt）
s
=
—ω—v2x——
ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的
距离（cm）
沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）
蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系
M = —D—（—1R－—TsV—ρ）—
R—气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T—绝对温度 D—扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机 转速很快，则忽略不计） V—蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ—溶剂密度（20℃，g·ml-1） s—沉降系数
二、凝胶过滤法测定相对分子质量
凝胶过滤原理
分子筛色谱 （凝胶过滤）
利用Andrews的实验经验式：
logMr = a/b—Ve/bVo
Ve（elution volume）为某一溶质组分的洗脱 体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰 （峰顶）出现时所流出的体积。
V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床 中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被 凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000 的洗脱体积可以决定V0。
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质 胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白 质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不 可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性 质的变化，所以又称为变性沉淀。
蛋白质的分离纯化PPT
1、选材： 2、破碎：常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等机械破碎法。 3、提取：
（二）Protein的分离纯化
1、盐析法：中性盐分级沉淀法，常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由 于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以 将不同的蛋白质加以分离。
2、等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集 形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。
3、有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质
。 的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀
5
4、凝胶过滤（303页）（凝胶层析）(gel filtration chromatography):又 叫分子筛层析，常用的凝胶有交联葡聚糖(sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-gel P)和琼脂糖凝胶(Bio-gel A)等。常用于大分子物质的分离纯化， 以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。 5、离子交换层析： 6、密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度。
2、通透性：不易透过半透膜，可用透析的方法将蛋白质分子与其它 小分子物质分离，纯化蛋白质。
3、沉降系数（S）：蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心沉降，单 位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数，它表示沉
降分子的大小特性 。
三、Protein的变性与复性
1、定义：蛋白质在一定的理化因素的影响下，三维构象破坏，理化 性质发生改变和生物学活性丧失，叫变性作用（denaturation)。其本质是 高级结构破坏、一级结构不变。
10
SDS（十二烷基磺酸钠） 是一种阴离子型表面活 性剂，它能够与蛋白质 多肽链中的氨基酸残基 按大约1 2比例结合。
这样，每一个蛋白质分
子都因为结合了许多的
（二）Protein的分离纯化
1、盐析法：中性盐分级沉淀法，常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由 于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以 将不同的蛋白质加以分离。
2、等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集 形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。
3、有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质
。 的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀
5
4、凝胶过滤（303页）（凝胶层析）(gel filtration chromatography):又 叫分子筛层析，常用的凝胶有交联葡聚糖(sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-gel P)和琼脂糖凝胶(Bio-gel A)等。常用于大分子物质的分离纯化， 以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。 5、离子交换层析： 6、密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度。
2、通透性：不易透过半透膜，可用透析的方法将蛋白质分子与其它 小分子物质分离，纯化蛋白质。
3、沉降系数（S）：蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心沉降，单 位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数，它表示沉
降分子的大小特性 。
三、Protein的变性与复性
1、定义：蛋白质在一定的理化因素的影响下，三维构象破坏，理化 性质发生改变和生物学活性丧失，叫变性作用（denaturation)。其本质是 高级结构破坏、一级结构不变。
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SDS（十二烷基磺酸钠） 是一种阴离子型表面活 性剂，它能够与蛋白质 多肽链中的氨基酸残基 按大约1 2比例结合。
这样，每一个蛋白质分
子都因为结合了许多的
《蛋白质的分离纯化》PPT课件
蛋白质的理化性质及分离纯化
精选课件ppt
1
第一节 蛋白质的理化性质 第二节 蛋白质的分离纯化 第三节 蛋白质的分子量测定 第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定
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2
第一节 蛋白质的理化性质
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的紫外吸收性质 三、蛋白质的胶体性质和沉淀 四、蛋白质的变性和复性 五、蛋白质的呈色反应
精选课件ppt
40
等电聚焦电泳装置
实际上是利用缓冲液在 电场作用下在凝胶内沿电场 方向制造一个pH梯度。所 用的缓冲液是低分子量的有 机酸和碱的混合物，该混合 物称之两性电解质。
当蛋白质样品在这样的
凝胶上电泳时，每种蛋白质
都将迁移至与它的pI 相一
致的pH处，具有不同pI的
各种蛋白质最后都迁移至凝
当 pH < pI， 蛋白质带正电荷与
生物碱试剂
反应
某些酸根负离子
不溶性沉淀
精选课件ppt
11
5. 加热变性沉淀法
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。 当蛋白质处于等电点时,加热凝固最完全和最迅速。
加热变性引起蛋白质凝固的原因：
可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外 露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破 坏了带电状态。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等
电点相同而分子量不同的蛋白质分精选开课件。ppt
43
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
特种多缓冲液 混和蛋白质样品
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
PH 降低
换特 剂种
多 缓 冲 交
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1
第一节 蛋白质的理化性质 第二节 蛋白质的分离纯化 第三节 蛋白质的分子量测定 第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定
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第一节 蛋白质的理化性质
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的紫外吸收性质 三、蛋白质的胶体性质和沉淀 四、蛋白质的变性和复性 五、蛋白质的呈色反应
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40
等电聚焦电泳装置
实际上是利用缓冲液在 电场作用下在凝胶内沿电场 方向制造一个pH梯度。所 用的缓冲液是低分子量的有 机酸和碱的混合物，该混合 物称之两性电解质。
当蛋白质样品在这样的
凝胶上电泳时，每种蛋白质
都将迁移至与它的pI 相一
致的pH处，具有不同pI的
各种蛋白质最后都迁移至凝
当 pH < pI， 蛋白质带正电荷与
生物碱试剂
反应
某些酸根负离子
不溶性沉淀
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5. 加热变性沉淀法
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。 当蛋白质处于等电点时,加热凝固最完全和最迅速。
加热变性引起蛋白质凝固的原因：
可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外 露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破 坏了带电状态。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等
电点相同而分子量不同的蛋白质分精选开课件。ppt
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5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
特种多缓冲液 混和蛋白质样品
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
PH 降低
换特 剂种
多 缓 冲 交
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
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13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
蛋白质的分离纯化ppt课件
质 ►每一个蛋白质分子都因为结合了许多
的 纯 化 方 法
的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白 质分子原有的电荷则可以忽略。该法 主要利用了蛋白质分子量大小不同而 分离蛋白质。
►用已知分子量的蛋白质作为标准，则
可以估算出不同蛋白质的分子量。
等电聚焦
►将两性电解质(eg:pH3-9，pH5-7)
同蛋白质样品一起加入到已经灌好
►亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳方法测定。
也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。 ► 具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。 ► 常用分子筛：
葡聚糖凝胶（Sephadex）
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐
琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）
塑料离心 管
大分
子
4%
量
由
8%
小
12 蔗糖浓度
%16 %
—————
%20
% 蔗糖密度梯度
（介质还可用：氯化铯、甘油等）
电泳法
► 类型：பைடு நூலகம்、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、
细丝电泳、凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅
胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电
2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白 质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分 子量的大小成正比变化。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
► 由于不同蛋白质的SDS复合物具有相同的荷质 比，并具有相似的构象，因而有如下公式：
lgM=K1—K2μR
（K1、K2为常数，μR为相对迁移率）
蛋白质分离纯化技术ppt课件
.
10
紫外分光光度法测定蛋白质含量的 实验原理
1.蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基含有共轭双键， 使蛋白质具有吸收近紫外光的性质。吸收高峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
2.蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。 利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓 度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
.
24
考马斯亮兰G-250
实验原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白 质结合，使染料的最大吸收峰的位置(max),由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸和赖
氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
.
6
测定分两步：
① 用沸浓硫酸消化，并以硫酸铜为催化剂，使碳、氢分 别以二氧化碳及水蒸汽形态逸去，而氮转为铵盐。此 过程需时较长，可达数小时。
② 加碱，并将氨自碱液中蒸至标准酸液中，测定中和氨 所消耗的酸量，计算出样品中含氮量，再乘以6．25 （经验平均值），则得蛋白质含量。
.
7
反应：以甘氨酸为例
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶 剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度 值A280。蛋白质浓度可控制在0.1～ 1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准 石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此 可立即计算出蛋白质的大致浓度。
（二）Folin－酚试剂法（Lowry法）
实验原理:蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2+反 应，生产紫红色蛋白质-Cu2+复合物，这一复合物 中的氨基酸残基（主要是酪氨酸、色氨酸、半胱 氨酸）还原Folin—酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸 盐，产生钼兰和钨兰复合物的深兰色（745750nm），颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
蛋白的分离纯化详解课件PPT
的分离。 2021/3/10
23
电泳（electrophoresis）
• 带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电 极移动的现象称为电泳。蛋白质在电场中 泳动时，受到电场力和摩擦力两种方向相 反的力的作用
• 蛋白质因带电、大小和形状不同而在直流 电场中泳动速度不同。
2021/3/10
24
常用蛋白质电泳技 术
2021/3/10
20
3. 亲和层析
• 以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子 的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗 原与抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。
• 将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之 固定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。
2021/3/10
21
各种用于抗体识别的标记
15
蛋白质的纯化
• 粗分离只是使蛋白质得到浓缩和初步分离 纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大 小、分子形状、分子表面特征或分子带电 状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。
• 常用的实验技术：层析（离子交换等）和 电泳
2021/3/10
16
1. 离子交换层析
固相支持物：纤维素、琼脂糖、葡聚糖等高分子聚 合物
• 方法：尿素变性复性从包涵体中纯 化原核表达蛋白
2021/3/10
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二、蛋白质的分离纯化
2021/3/10
10
分离纯化流程
原材料的获取
预处理 （沉淀）
纯化
细胞破碎
研磨 超声 渗透压 酶 ……
2021/3/10
蛋白溶解
酸、碱 醇 去垢剂 尿素 ……
粗提
沉淀 相分离 分子筛 ……
精提
各种色谱 电泳分离 差速离心 ……
蛋白质纯化技术PPT幻灯片课件
• 粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离 纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大 小、分子形状、分子表面特征或分子带电 状况进一步纯化。
• 常用的实验技术：层析
37
4.1. 层析（ chromatography ）
原理：
流动相：缓冲液
固定相：凝胶
38
•凝胶介质
Pharmacia
Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel
glucose (dextrose) agarose glucose + acrylamide cellulose
Bio-Rad
BioGelA BioGel P
agarose acrylamide
39
• 层析装置（Chromatographic equipment）
蠕动泵 层析柱 检测器 记录仪 部分收集器
• 方法：沉淀法
▫ 盐析法（eg. 硫酸铵） ▫ 有机溶剂沉淀法（eg. 丙酮） ▫ 等电点沉淀法
21
•盐析法
• 蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出， 称为盐析。
• 盐析原理： ▫ 高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化 膜，影响蛋白质分子表面所带电荷，从而 引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质 的变性。
22
1.5配体特异性结合
• 原理
▫ 生物大分子的某些特定结构区域能够特异性识 别其他分子并可逆结合，生物分子间的这种结 合能力称为亲和力。
• 方法
▫ 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶 性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆 性对另一个分子进行分离纯化。
• 分类
▫ 免疫亲和层析 ▫ 生物亲和层析 ▫ 金属螯合亲和层析
55
4.2.电泳（ Electrophoresis ）
• 常用的实验技术：层析
37
4.1. 层析（ chromatography ）
原理：
流动相：缓冲液
固定相：凝胶
38
•凝胶介质
Pharmacia
Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel
glucose (dextrose) agarose glucose + acrylamide cellulose
Bio-Rad
BioGelA BioGel P
agarose acrylamide
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• 层析装置（Chromatographic equipment）
蠕动泵 层析柱 检测器 记录仪 部分收集器
• 方法：沉淀法
▫ 盐析法（eg. 硫酸铵） ▫ 有机溶剂沉淀法（eg. 丙酮） ▫ 等电点沉淀法
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•盐析法
• 蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出， 称为盐析。
• 盐析原理： ▫ 高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化 膜，影响蛋白质分子表面所带电荷，从而 引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质 的变性。
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1.5配体特异性结合
• 原理
▫ 生物大分子的某些特定结构区域能够特异性识 别其他分子并可逆结合，生物分子间的这种结 合能力称为亲和力。
• 方法
▫ 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶 性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆 性对另一个分子进行分离纯化。
• 分类
▫ 免疫亲和层析 ▫ 生物亲和层析 ▫ 金属螯合亲和层析
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4.2.电泳（ Electrophoresis ）