TRITC Phalloidin罗丹明标记鬼笔环肽说明书
TY-PLY BN 产品说明书
USA SAFETY DATA SHEET3000000011641. CHEMICAL PRODUCT AND COMPANY IDENTIFICATIONProduct name: TY-PLY BN Product Use/Class:AdhesiveLORD Corporation 111 LORD DriveCary, NC 27511-7923 USATelephone: 814 868-3180Non-Transportation Emergency: 814 763-2345 Chemtrec 24 Hr Transportation Emergency No.800 424-9300 (Outside Continental U.S. 703 527-3887)EFFECTIVE DATE: 01/20/20202. HAZARDS IDENTIFICATIONGHS CLASSIFICATION:Flammable liquids Category 2Serious eye damage/eye irritation Category 2A Carcinogenicity Category 2Reproductive toxicity Category 1BSpecific target organ systemic toxicity (single exposure) Category 1 Central nervous system, Eyes, Systemic toxicitySpecific target organ systemic toxicity (single exposure) Category 3Specific target organ systemic toxicity (repeated exposure) Category 1 Central nervous system, Liver, Eyes Hazardous to the aquatic environment - acute hazard Category 2 Hazardous to the aquatic environment - chronic hazard Category 2GHS LABEL ELEMENTS:Symbol(s)Signal WordD ANGERHazard StatementsHighly flammable liquid and vapor. Causes serious eye irritation. Suspected of causing cancer.May damage fertility or the unborn child.Causes damage to organs.(Central nervous system, Eyes, Systemic toxicity) May cause drowsiness or dizziness. May cause respiratory irritation.Causes damage to organs through prolonged or repeated exposure.(Central nervous system, Liver, Eyes) Toxic to aquatic life.Toxic to aquatic life with long lasting effects.Precautionary Statements PreventionKeep away from heat/sparks/open flames/hot surfaces. - No smoking. Ground/Bond container and receiving equipment.Use explosion-proof electrical/ventilating/lighting equipment. Use only non-sparking tools.Take precautionary measures against static discharge.Obtain special instructions before use.Do not handle until all safety precautions have been read and understood.Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection.Use personal protective equipment as required.Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapors/spray.Wash thoroughly after handling.Do not eat, drink or smoke when using this product.Use only outdoors or in a well-ventilated area.Avoid release to the environment.ResponseIn case of fire: refer to section 5 of SDS for extinguishing media.Call a POISON CENTER or doctor/physician if you feel unwell.IF exposed: Call a POISON CENTER or doctor/physician.Specific treatment (see supplemental first aid instructions on this label).IF INHALED: Remove to fresh air and keep at rest in a position comfortable for breathing.IF ON SKIN (or hair): Remove/Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water/shower.IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do.Continue rinsing.Collect spillage.StorageStore in a well-ventilated place. Keep cool.Store in a well-ventilated place. Keep container tightly closed.Store locked up.Disposal:Dispose of contents/container in accordance with waste/disposal laws and regulations of your country or particular locality.Other Hazards:This product contains component(s) which have the following warnings; however based on the GHS classification criteria of your country or locale, the product mixture may be outside the respective category(s).Acute: Vapor harmful; may affect the brain or nervous system causing dizziness, headache or nausea. Possibleirritation of the respiratory system can occur causing a variety of symptoms such as dryness of the throat, tightness of the chest, and shortness of breath. May be absorbed through the skin in harmful amounts. May cause skin irritation.May cause central nervous system depression characterized by the following progressive steps: headache, dizziness, staggering gait, confusion, unconsciousness or coma. Contains methanol; may be harmful or fatal if swallowed;ingestion of methanol may cause blindness or permanent eye damage. Cannot be made non-poisonous.Chronic: May cause kidney damage. May affect the gastrointestinal system. Prolonged or repeated contact may result in dermatitis. This material contains methanol. Ingestion of methanol may cause permanent eye damage or blindness. IARC has designated carbon black as Group 2B - inadequate evidence for carcinogenicity in humans, but sufficient evidence in experimental animals. In 2006 IARC reaffirmed its 1995 finding that there is "inadequateevidence" from human health studies to assess whether carbon black causes cancer in humans. Further,epidemiological evidence from well-conducted investigations has shown no causative link between carbon black exposure and the risk of malignant or non-malignant respiratory disease in humans. IARC has designated Methyl isobutyl ketone to be in Group 2B - possibly carcinogenic to humans. ACGIH considers Ethyl alcohol to be an A3 carcinogen (confirmed animal carcinogen with unknown relevance in humans).3. COMPOSITION/INFORMATION ON INGREDIENTSChemical Name CAS Number RangeEthyl alcohol64-17-550 - 55%Methanol67-56-1 1 - 5%Carbon black1333-86-4 1 - 5%Methyl isobutyl ketone108-10-1 1 - 5%Any "PROPRIETARY" component(s) in the above table is considered trade secret, thus the specific chemical and its exact concentration is being withheld.4. FIRST AID MEASURESFIRST AID - EYE CONTACT: Flush eyes immediately with large amount of water for at least 15 minutes holding eyelids open while flushing. Get prompt medical attention.FIRST AID - SKIN CONTACT: Flush contaminated skin with large amounts of water while removing contaminated clothing. Wash affected skin areas with soap and water. Get medical attention if symptoms occur.FIRST AID - INHALATION: Move person to fresh air. Restore and support continued breathing. If breathing is difficult, give oxygen. Get immediate medical attention.FIRST AID - INGESTION: If swallowed, do not induce vomiting. Call a physician or poison control center immediately for further instructions. Never give anything by mouth if victim is rapidly losing consciousness, unconscious or convulsing.5. FIRE-FIGHTING MEASURESSUITABLE EXTINGUISHING MEDIA: Carbon Dioxide, Dry Chemical, Foam, Water FogUNSUITABLE EXTINGUISHING MEDIA: Not determined for this product.SPECIFIC HAZARDS POSSIBLY ARISING FROM THE CHEMICAL: Flammable liquid and vapor. Keep containers tightly closed. Isolate from heat, electrical equipment, sparks, open flame, and other sources of ignition. Closed containers may rupture when exposed to extreme heat. Use water spray to keep fire exposed containers cool. During a fire, irritating and/or toxic gases and particulate may be generated by thermal decomposition or combustion.SPECIAL PROTECTIVE EQUIPMENT AND PRECAUTIONS FOR FIRE-FIGHTERS: Wear full firefighting protective clothing, including self-contained breathing apparatus (SCBA). Water spray may be ineffective. If water is used, fog nozzles are preferable.6. ACCIDENTAL RELEASE MEASURESPERSONAL PRECAUTIONS, PROTECTIVE EQUIPMENT AND EMERGENCY PROCEDURES: Remove all sources of ignition (flame, hot surfaces, and electrical, static or frictional sparks). Avoid contact. Avoid breathing vapors. Use self-contained breathing equipment.ENVIRONMENTAL PRECAUTIONS: Do not contaminate bodies of water, waterways, or ditches, with chemical or used container.METHODS AND MATERIALS FOR CONTAINMENT AND CLEANUP: Keep non-essential personnel a safe distance away from the spill area. Notify appropriate authorities if necessary. Avoid contact. Before attempting cleanup, refer to hazard caution information in other sections of the SDS form. Contain and remove with inert absorbent material and non-sparking tools.7. HANDLING AND STORAGEHANDLING: Cannot be made non-poisonous. Keep closure tight and container upright to prevent leakage. Ground and bond containers when transferring material. Do not smoke where this product is used or stored. Use with adequate ventilation. Avoid breathing of vapor or spray mists. Avoid skin and eye contact. Wash thoroughly after handling. Do not handle until all safety precautions have been read and understood. Empty containers should not be re-used. Because empty containers may retain product residue and flammable vapors, keep away from heat, sparks and flame; do not cut, puncture or weld on or near the empty container.STORAGE: Do not store or use near heat, sparks, or open flame. Store only in well-ventilated areas. Do not puncture, drag, or slide container. Keep container closed when not in use. Refer to OSHA 29CFR Part 1910.106 "Flammable and Combustible Liquids" for specific storage requirements.INCOMPATIBILITY: Strong acids, bases, and strong oxidizers.8. EXPOSURE CONTROLS/PERSONAL PROTECTIONCOMPONENT EXPOSURE LIMITChemical Name ACGIH TLV-TWA ACGIH TLV-STELOSHA PEL-TWAOSHA PEL-CEILINGSkinEthyl alcohol N.E.1,000 ppm1,900 mg/m31,000 ppmN.E.N.A.Methanol200 ppm250 ppm260 mg/m3200 ppmN.E.SSCarbon black 3 mg/m3N.E. 3.5 mg/m3 N.E.N.A.Methyl isobutyl ketone50 ppm75 ppm410 mg/m3100 ppmN.E.N.A.N.A. - Not Applicable, N.E. - Not Established, S - Skin DesignationEngineering controls: Sufficient ventilation in pattern and volume should be provided in order to maintain air contaminant levels below recommended exposure limits. Caution: Solvent vapors are heavier than air and collect in lower levels of the work area. Sufficient ventilation (using explosion-proof equipment) should be provided to prevent flammable vapor/air mixtures from accumulating.PERSONAL PROTECTION MEASURES/EQUIPMENT:RESPIRATORY PROTECTION: Use a NIOSH approved chemical/mechanical filter respirator designed toremove a combination of particulates and organic vapor if occupational limits are exceeded. For emergencysituations, confined space use, or other conditions where exposure limits may be greatly exceeded, use an approved air-supplied respirator. For respirator use observe OSHA regulations (29CFR 1910.134) or use in accordance with applicable laws and regulations of your country or particular locality.SKIN PROTECTION: Use neoprene, nitrile, or rubber gloves to prevent skin contact.EYE PROTECTION: Use safety eyewear including safety glasses with side shields and chemical goggles where splashing may occur.OTHER PROTECTIVE EQUIPMENT: Use disposable or impervious clothing if work clothing contamination is likely. Remove and wash contaminated clothing before reuse.HYGIENIC PRACTICES: Wash hands before eating, smoking, or using toilet facility. Do not smoke in anychemical handling or storage area. Food or beverages should not be consumed anywhere this product is handled or stored. Wash thoroughly after handling.9. PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIESTypical values, not to be used for specification purposes.ODOR: Solvent VAPOR PRESSURE: N.D.APPEARANCE: Black VAPOR DENSITY: Heavier than Air PHYSICAL STATE: Liquid LOWER EXPLOSIVE LIMIT: 1.4 %(V)FLASH POINT: 42 °F, 5 °C SetaflashClosed CupUPPER EXPLOSIVE LIMIT: 36.5 %(V)BOILING RANGE: 65 - 117 °C EVAPORATION RATE: Slower than n-butyl-acetate AUTOIGNITION TEMPERATURE:N.D.DENSITY: 0.94 g/cm3 - 7.86 lb/gal DECOMPOSITION TEMPERATURE:N.D. VISCOSITY, DYNAMIC: N.D.ODOR THRESHOLD: N.D.VISCOSITY, KINEMATIC: N.D.SOLUBILITY IN H2O: Insoluble VOLATILE BY WEIGHT: 63.00 %pH: N.A.VOLATILE BY VOLUME: 75.05 %FREEZE POINT: N.D. VOC CALCULATED: 4.79 lb/gal, 574 g/l COEFFICIENT OF WATER/OILDISTRIBUTION:N.D.LEGEND: N.A. - Not Applicable, N.E. - Not Established, N.D. - Not Determined10. STABILITY AND REACTIVITYHAZARDOUS POLYMERIZATION: Hazardous polymerization will not occur under normal conditions.STABILITY: Product is stable under normal storage conditions.CONDITIONS TO AVOID: High temperatures. Sources of ignition. INCOMPATIBILITY: Strong acids, bases, and strong oxidizers.HAZARDOUS DECOMPOSITION PRODUCTS: Carbon monoxide, carbon dioxide11. TOXICOLOGICAL INFORMATION EXPOSURE PATH: Refer to section 2 of this SDS.SYMPTOMS:Refer to section 2 of this SDS.TOXICITY MEASURES:Chemical Name LD50/LC50Ethyl alcohol Oral LD50: Rat7,060 mg/kgInhalation LC50: Rat124.7 mg/l/4 h Methanol Oral LD50: Rat6,200 mg/kgDermal LD50: Rabbit15,840 mg/kgInhalation LC50: Rat22500 ppm/8 h Carbon black Oral LD50: Rat> 15,400 mg/kgDermal LD50: Rabbit> 3 g/kgGHS LC50 (vapour): Acute toxicity point estimate55 mg/l Methyl isobutyl ketone Oral LD50: Rat2,080 mg/kgDermal LD50: Rabbit3,000 mg/kgInhalation LC50: Rat2000 - 4000 ppm/4 h Germ cell mutagenicity: No classification proposedCarcinogenicity: Category 2 - Suspected of causing cancer.Components contributing to classification: Methyl isobutyl ketone.Reproductive toxicity: Category 1B - May damage fertility or the unborn child.Components contributing to classification: Methanol.12. ECOLOGICAL INFORMATION ECOTOXICITY:Chemical Name EcotoxicityEthyl alcohol Fish: Pimephales promelas> 100 mg/l96 h StaticPimephales promelas13,400 - 15,100 mg/l96 h flow-throughInvertebrates: Daphnia magna9,268 - 14,221 mg/l48 hDaphnia magna2 mg/l48 h StaticMethanol Fish: Pimephales promelas28,200 mg/l96 h flow-throughPimephales promelas> 100 mg/l96 h StaticOncorhynchus mykiss19,500 - 20,700 mg/l96 h flow-throughLepomis macrochirus13,500 - 17,600 mg/l96 h flow-through Carbon black N.D.Methyl isobutyl ketone Fish: Pimephales promelas496 - 514 mg/l96 h flow-throughInvertebrates: Daphnia magna170 mg/l48 hPlants: Pseudokirchneriella subcapitata400 mg/l96 h PERSISTENCE AND DEGRADABILITY:Not determined for this product. BIOACCUMULATIVE: Not determined for this product.MOBILITY IN SOIL: Not determined for this product.OTHER ADVERSE EFFECTS: Not determined for this product.13. DISPOSAL CONSIDERATIONSDISPOSAL METHOD: Disposal should be done in accordance with Federal (40CFR Part 261), state and local environmental control regulations. If waste is determined to be hazardous, use licensed hazardous waste transporter and disposal facility.14. TRANSPORT INFORMATIONUS DOT RoadProper Shipping Name: AdhesivesHazard Class: 3SECONDARY HAZARD: NoneUN/NA Number: 1133Packing Group: IIEmergency Response Guide Number: 128IATA CargoPROPER SHIPPING NAME: AdhesivesHazard Class: 3HAZARD CLASS: NoneUN NUMBER: 1133PACKING GROUP: IIEMS: 3LIMDGPROPER SHIPPING NAME: AdhesivesHazard Class: 3HAZARD CLASS: NoneUN NUMBER: 1133PACKING GROUP: IIEMS: F-EThe listed transportation classification applies to non-bulk shipments. It does not address regulatory variations due to changes in package size, mode of shipment or other regulatory descriptors. For the most accurate shipping information, refer to your transportation/compliance department.15. REGULATORY INFORMATIONU.S. FEDERAL REGULATIONS: AS FOLLOWS:SARA SECTION 313This product contains the following substances subject to the reporting requirements of Section 313 of Title III of the Superfund Amendment and Reauthorization Act of 1986 and 40 CFR part 372.:Chemical Name CAS Number Weight % Less ThanMethanol67-56-1 5.0%Methyl isobutyl ketone108-10-1 5.0%TOXIC SUBSTANCES CONTROL ACT:INVENTORY STATUSThe chemical substances in this product are on the TSCA Section 8 Inventory.EXPORT NOTIFICATIONThis product contains the following chemical substances subject to the reporting requirements of TSCA 12(B) if exported from the United States:None16. OTHER INFORMATIONUnder HazCom 2012 it is optional to continue using the HMIS rating system. It is important to ensure employees have been trained to recognize the different numeric ratings associated with the HazCom 2012 and HMIS schemes.HMIS RATINGS - HEALTH: 2* FLAMMABILITY: 3 PHYSICAL HAZARD: 0* - Indicates a chronic hazard; see Section 2Revision: Section 2Effective Date: 01/20/2020DISCLAIMERThe information contained herein is, to the best of our knowledge and belief, accurate. However, since the conditions of handling and use are beyond our control, we make no guarantee of results, and assume no liability for damages incurred by use of this material. It is the responsibility of the user to comply with all applicable federal, state and local laws and regulations.。
TRITC Phalloidin罗丹明标记鬼笔环肽使用说明
TRITC Phalloidin罗丹明标记鬼笔环肽使用说明货号:CA1610规格:300T（300μL）保存:-20℃避光干燥保存，1年有效。
产品说明:鬼笔环肽（Phalloidin）是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏（Amanita phalloides）的环状七肽毒素，以高亲和力（Kd=20nM）选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体系中的F-actin，从而对F-actin进行定性和定量分析。
另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。
且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。
因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白（Actin）抗体进行相关研究。
另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15Å，分子量＜2000Daltons，未标记肌动蛋白（Actin）的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能发生反应；鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质；以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。
鬼笔环肽（Phalloidin）的结合阻止丝状肌动蛋白（微丝）的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。
此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。
此外，鬼笔环肽还可抑制F-actin的ATP水解活性。
本品为TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）标记的鬼笔环肽，染色反应特异性强，对比性高，具有比Actin抗体更好的染色效果，适合用作F-actin的定性和定量检测。
另外，经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。
且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。
需要自备材料:1.（可选）甲醇2.1×PBS缓冲液,pH7.4,细胞培养级别3.固定液4%多聚甲醛（溶于PBS缓冲液）4.丙酮或透化液0.5%Triton X-100（溶于PBS缓冲液）5.Fluoromount-G TM水溶性封片剂（不含DAPI），DAPI6.（可选）DAPI Fluoromount-GTM水溶性封片剂（含DAPI）7.（可选）BSA，标准级别8.载玻片和盖玻片9.盖玻片周围密封液（如透明指甲油）10.组装有TRITC激发/发射滤片，以及DAPI激发/发射滤片的荧光显微镜或共聚焦显微镜。
锌指蛋白185通过与肌动蛋白纤维结合抑制肿瘤细胞增殖
锌指蛋白 185 通过与肌动蛋白纤维结合抑制肿瘤细胞增殖
郑全辉 陆 斌1 葛淑芝2 张爱红1 （ 河北联合大学基础医学院，河北 唐山 063000）
鬼笔环肽标记系列产品说明书
鬼笔环肽标记系列产品说明书货号产品名称规格Ex/EmCA1640SF488标记鬼笔环肽（绿色）300T490/515CA1650SF680R标记鬼笔环肽（远红）300T681/698CA1660SF555标记鬼笔环肽（橙红）300T555/565CA1670SF633标记鬼笔环肽（远红）300T630/650CA1680SF594标记鬼笔环肽（橘红）300T593/614保存：-20℃干燥、避光保存，有效期一年。
若配制成水溶液，请小量分装保存，避免反复冻融。
注意：本产品为冻干粉形式，使用前请瞬时离心，加适当溶剂溶解后使用。
产品介绍：鬼笔环肽是从致命的伞形毒蕈蘑菇中分离出来的一种毒素。
它是特异性结合于F-肌动蛋白的双环肽（1）。
因此用荧光染料标记的鬼笔环肽可以非常方便的研究F-肌动蛋白的分布。
鬼笔环肽内部，在半胱氨酸和色氨酸之间含有不常见的硫醚桥形成内环结构。
在pH升高时，该硫醚被裂解，鬼笔环肽失去对肌动蛋白的亲和力。
荧光标记的鬼笔环肽可在纳摩尔水平染色F-肌动蛋白（1-3）。
在各种植物细胞或动物细胞中，标记的鬼笔环肽对大、小细丝具有相似的亲和力，平均每个肌动蛋白亚基结合一个鬼笔环肽分子。
不同于抗体，鬼笔环肽与肌动蛋白的结合亲和力在不同物种间没有显着变化。
非特异性染色可以忽略不计，染色和未染色区域之间的对比度非常大。
鬼笔环肽将单体/聚合物的平衡转向聚合状态，将聚合临界浓度降低至30倍（3,4）。
Phallotoxins可通过抑制细胞松弛素的解聚，碘化钾和升高的温度，稳定F-肌动蛋白。
因为鬼笔环肽缀合物很小，大约直径12-15埃，分子量<2000道尔顿，多种肌动蛋白结合蛋白，包括肌球蛋白，原肌球蛋白和后肌钙蛋白依然可以和鬼笔环肽标记的肌动蛋白结合。
更重要的是，鬼笔环肽标记的肌动蛋白丝保持功能，标记甘油肌纤维仍然收缩，标记的肌动蛋白丝仍然可以继续移动（5,6）。
而且荧光标记的鬼笔环肽也可用于对细胞中F-肌动蛋白进行定量研究（7,8）。
鬼笔环肽
鬼笔环肽学术资料一二F- actin微丝蛋白简介肌动蛋白单体（又被称为G-Actin，全称为球状肌动蛋白，Globular Actin，下文简称G肌动蛋白）为球形，其表面上有一ATP结合位点。
肌动蛋白单体一个接一个连成一串肌动蛋白链，两串这样的肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝。
这种肌动蛋白多聚体又被称为纤维形肌动蛋白（F-Actin，Fibrous Actin。
微丝(microfilaments)是由肌动蛋白分子螺旋状聚合成的纤丝，又称肌动蛋白丝(actin filament)，与微管和中间纤维共同组成细胞骨架，是一种所有真核细胞中均存在的分子量大约42kDa的蛋白质，也是一种高度保守的蛋白质，因物种差异（例如藻类与人类）的不同不会超过20%。
微丝对细胞贴附、铺展、运动、内吞、细胞分裂等许多细胞功能具有重要作用，做这些细胞功能实验时可以用到鬼笔环肽。
微丝的主要功能有：微丝聚集成束，沿平行于胞质环流的方向排列，控制细胞的胞质环流。
三标记荧光的鬼笔环肽的卖点1）与actin亚单位一比一结合，并且不与G-actin结合，具有比Actin抗体更好的染色效果，实验结果图鲜艳，美观；2）且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛；3）鬼笔环肽标记的非特异性信号可忽略，因而图像的反差较好；4）染色与用于细胞分析的其他荧光染色完全兼容，包括荧光蛋白、Qdot® 纳米晶体和其他Alexa Fluor偶联物（包含Alexa Fluor偶联二抗）；5）经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。
五参考文献1. Lin G, Qiu X, Fandel TM, Albersen M, Wang Z, Lue TF, Lin CS. (2011) Improved penilehistology by phalloidin stain: circular and longitudinal cavernous smooth muscles,dual-endothelium arteries, and erectile dysfunction-associated changes. Urology, 78, 970 e1.2. Diensthuber RP, Muller M, Heissler SM, Taft MH, Chizhov I, Manstein DJ. (2011)Phalloidin perturbs the interaction of human non-muscle myosin isoforms 2A and 2C1 with F-actin. FEBS Lett, 585, 767.3. An M, Wijesinghe D, Andreev OA, Reshetnyak YK, Engelman DM. (2010)pH-(low)-insertion-peptide (pHLIP) translocation of membrane impermeable phalloidin toxin inhibits cancer cell proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A, 107, 20246.4. Chazotte B. (2010) Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluoresceinphalloidin for imaging. Cold Spring Harb Protoc, 2010, pdb prot4947.5. Genikhovich G, Technau U. (2009) Anti-acetylated tubulin antibody staining and phalloidinstaining in the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Cold Spring Harb Protoc, 2009, pdb prot5283.6. Herraez E, Macias RI, Vazquez-Tato J, Vicens M, Monte MJ, Marin JJ. (2009) In vitroinhibition of OATP-mediated uptake of phalloidin using bile acid derivatives. ToxicolAppl Pharmacol, 239, 13.7. Wollesen T, Loesel R, Wanninger A. (2009) Pygmy squids and giant brains: mapping thecomplex cephalopod CNS by phalloidin staining of vibratome sections andwhole-mount preparations. J Neurosci Methods, 179, 63.8. Herraez E, Macias RI, Vazquez-Tato J, Hierro C, Monte MJ, Marin JJ. (2009) Protectiveeffect of bile acid derivatives in phalloidin-induced rat liver toxicity. Toxicol ApplPharmacol, 239, 21.9. Luo H, Hallen-Adams HE, Walton JD. (2009) Processing of the phalloidin proprotein byprolyl oligopeptidase from the mushroom Conocybe albipes. J Biol Chem, 284, 18070.10. Vig A, Dudas R, Kupi T, Orban J, Hild G, Lorinczy D, Nyitrai M. (2009) Effect of Phalloidinon Filaments Polymerized from Heart Muscle Adp-Actin Monomers. J Therm AnalCalorim, 95, 721.。
细胞黏附相关结构的染色标记与表征
细胞黏附相关结构的染色标记与表征YAO Xiang染色原理：细胞黏附一般会涉及到细胞黏附密度与粘附状态的评估（如黏附面积、形状、焦点黏附强弱），评估细胞黏附状态可以通过利用不同种类的荧光基团对不同的细胞粘附结构进行标记，后续再通过荧光显微成像的方法来对细胞黏附进行统计分析与评估。
例如选用如下荧光组合：用Alexa Fluor 488荧光基团标记粘着斑蛋白vinculin （利用抗原-抗体特异性结合的方式，一抗选用Mouse monoclonal anti-vinculin antibody，二抗选用Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG）；用TRITC 荧光基团标记微丝蛋白（染色试剂一端带TRITC荧光基团，另一端的鬼笔环肽phalloidin能够与微丝特异性结合）；用DAPI对细胞核进行标记。
选用上述荧光组合的典型荧光显微照片如图1-3所示（本例虽然展示的均是骨髓基质干细胞的染色显微照片，但其它种类细胞黏附相关结构的染色标记与表征均可采用类似方法），对应详细的染色步骤及所需试剂见后页内容。
图1：MSC（骨髓基质干细胞）粘附于不同基材（L-CYS, D-CYS）后的vinculin、F-actin和细胞核的复合荧光染色照片（merged）。
vinculin标记为绿色、F-actin标记为红色、细胞核标记为蓝色。
图2：骨髓基质干细胞粘附于玻片表面后的荧光显微图片。
红色为F-actin，蓝色为细胞核。
图3：骨髓基质干细胞粘附于特殊基材后的荧光显微照片。
从上到下依次为标记为绿色的vinculin、标记为红色的F-actin、标记为蓝色的细胞核在仅考察细胞的黏附问题时，细胞黏附到材料上一段时间（依据实验需求而定，一般需大于4小时）后便可对其同时进行vinculin、F-actin和细胞核的复合标记染色。
该荧光组合染色结果便于观察细胞的应力纤维丝和焦点粘附情况。
鬼笔环肽：能给细胞染色标记的多肽
鬼笔环肽：能给细胞染色标记的多肽
鬼笔环肽是一种双环七肽，含有不寻常的半胱氨酸-色氨酸键。
编码鬼笔环肽合成的基因是死亡帽蘑菇中MSDIN家族的一部分，编码34个氨基酸的前肽。
脯氨酸残基位于七个残基区域的两侧，稍后将变成鬼笔环肽。
翻译后，必须对肽进行蛋白水解切除，环化，羟基化，使Trp-Cys交联形成色氨酸，并差向异构化以形成D-Thr。
这些步骤的顺序和确切的生化机理尚未完全了解。
目前的看法是，必要的生物合成基因聚集在MSDIN基因附近。
34-mer的第一个翻译后修饰是通过脯氨酰寡肽酶（POP）进行蛋白水解切割，以去除10个氨基酸的“前导”肽。
然后，POP通过氨基酸1（Ala）和氨基酸7（Pro）之间的转肽作用使七肽Ala-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Pro环化。
据信，接下来将通过Trp-Cys交联形成色氨酸。
鬼笔环肽（又称鬼笔鹅膏素）是从毒蕈类鬼笔鹅膏中得到的有毒环状七肽，能选择性的与动植物体内的肌动蛋白结合，其作用与细胞松弛素Ｂ恰好相反，只与聚合的微丝结合，而不与肌动蛋白单体分子结合，使鬼笔环肽染色成为研究细胞内肌动蛋白微丝的有力工具，是细胞骨架的染色神器。
光学显微镜下, 荧光标记过的鬼笔环肽可以清晰地显示出细胞内微丝的形态和分布，已广泛应用于生物医学研究中。
由于鬼笔环肽因其结合和稳定肌动蛋白聚合物的能力而被开发利用，但细胞无法轻易吸收，因此科学家发现鬼笔环肽衍生物在研究中更有用。
本质上，它遵循典型的使用羟脯氨酸的小肽合成。
合成的主要困难是色氨酸的形成（半胱氨酸-色氨酸交联）。
phalloidin染色
phalloidin染色鬼笔环肽 (phalloidin) 是一种双环七肽毒素，只与聚合的微丝结合，而不与肌动蛋白单体分子结合。
鬼笔环肽通过与聚合的微丝结合，抑制了微丝的解体，破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡，在光学显微镜下, 荧光标记过的鬼笔环肽可以清晰地显示出细胞内微丝的形态和分布，广泛应用于生物化学、免疫学、分子生物学、病理学、诊断学等方面。
具体方法：1、在室温下用3-4%的甲醛/PBS液固定细胞10-30min。
2、吸弃固定液，用PBS洗涤细胞2-3次。
注意：可以在PBS中加入10mMethanolamine(or0.1Mglycine)反应5min来淬灭过量的甲醛。
然后在固定的细胞中加入PBS+0.1％TritonX-100孵育3-5分钟来增加细胞的通透性，然后再用PBS洗涤细胞2-3次。
3、添加鬼笔环肽-缀合物工作溶液(Phalloidin-conjugateworkingsolution)，在室温条件下孵育20-90分钟注意：可在此时加入DNA染色染料。
注意：对于脊椎动物细胞，可以将鬼笔环肽-缀合物添加到的PBS洗液洗涤，然后可加封片剂（mountingmedium）封片。
4、用PBS冲洗细胞2-3次，每次冲洗5分钟。
5、用盖玻片加封片剂封片，保持荧光。
6、在荧光显微镜下观察细胞，使用Ex/Em=493/517nm的滤光片（filter）。
1、鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITON X-100处理。
2、药品价格昂贵，0.1mg的售价接近两千元，要节约使用。
3、鬼笔环肽毒性较大，戴上手套操作。
4、避免使用含有甲醇或丙酮的固定剂，这些会破坏肌动蛋白的结构而影响鬼笔环肽染色效果。
5、在使用盖玻片上的细胞染色时，尽量将盖玻片置于有盖子的容器中以减少蒸发。
FITC-Phalloidin(鬼笔环肽)
联科生物技术有限公司 全国免费电话：400 6721 600 传真：0571-2882 8618全国免费电话：400 6721 600联科杭州：0571-2882 8608 联科上海：021-6413 2459 联科北京：010-8219 1878联科广州：020-3420 5572 联科南京：025-8453 0667 联科苏州：0512-6866 66231FITC-Phalloidin(鬼笔环肽)使用说明【产品】 产品名称产品编号 规格 生产商 Phalloidin (FITC) 9A-ALX-350-268-MC010.1 mg Enzo (Alexis/Biomol/Assay Designs)【贮存液配制】0.1mg FITC-Phalloidin 溶于0.5ml 无水甲醇 (或DMSO)，配成200 μg/ml 贮存液。
分装冻存于-20o C ，干燥、避光保存至少一年。
【染色方法】1. 细胞爬片生长24-48小时；2. 预温PBS(37 o C)清洗细胞2次，每次10分钟；3. 4%多聚甲醛室温固定5-10分钟，PBS 清洗细胞3次；注：也可用 3.7%的甲醛溶液固定，但甲醛中不能含有甲醇，因为在固定过程中甲醇可能会破坏肌动蛋白。
4. 0.1%Triton X-100/PBS 室温破膜3-5分钟，PBS 清洗细胞3次；注：该步骤可以省略，因为Phalloidin 分子量很小，多聚甲醛固定后细胞膜产生的孔洞足以让Phalloidin 进入细胞。
且经Triton 破膜后，Phalloidin 可能对细胞核有非特异性染色。
5. 5 μl FITC-Phalloidin 贮存液加入150 ul PBS 中配成工作液 (5 μg/ml )并用以染细胞，室温染色30-60分钟；注：1) FITC-Phalloidin 工作浓度范围为2-50 μg/ml ，一般使用浓度为5 μg/ml ；2) 为降低非特异性染色，配制FITC-Phalloidin 工作液时，可在PBS 中加入1% BSA(牛血清白蛋白)。
鬼笔环肽说明书
Phalloidin；鬼笔环肽分子量788.88CAS17466-45-4溶解性DMSO储存条件-20℃产品规格1mg简介：鬼笔环肽是一种双环七肽毒素，特异性结合在F-肌动蛋白亚基之间的界面上，将相邻的亚基锁定在一起。
鬼笔环肽与肌动蛋白丝的结合比与肌动蛋白单体的结合要紧密得多，从而导致肌动蛋白亚基从丝端解离的速率常数降低，因此通过防止纤维解聚而基本稳定了肌动蛋白纤维，最终，发现鬼笔环肽抑制F-肌动蛋白的ATP水解活性。
因此，鬼笔环肽以不同于G-肌动蛋白的构型捕获肌动蛋白单体，并通过大大降低单体解离的速率常数来稳定F-肌动蛋白的结构。
鬼笔环肽的性质是研究F-肌动蛋白在细胞中分布的有用工具，方法是用荧光类似物标记鬼笔环肽并将其用于染色肌动蛋白丝以进行光学显微镜检查。
鬼笔环肽的荧光衍生物已被证明在定位活细胞或固定细胞中的肌动蛋白丝以及体外观察单个肌动蛋白丝方面非常有用。
荧光鬼笔环肽衍生物已被用作高分辨率研究肌动蛋白网络的重要工具。
操作说明仅供参考1.制备1000X鬼笔环肽DMSO储备液：将30μLDMSO加入小瓶中。
2.制备1X鬼笔环肽结合物工作溶液：加入1μL1000X鬼笔环肽结合物DMSO溶液至1 mL含1％BSA的PBS。
注意1：鬼笔环肽结合物未使用的1000X DMSO储备溶液应等分并储存在-20℃，避光。
注意2：不同的细胞类型可能染色不同。
应相应地制备鬼笔环肽结合物工作溶液。
3.染色细胞：3.1进行甲醛固定，在室温下将含3.0-4.0％甲醛的细胞在PBS中孵育10-30分钟。
注意：避免使用任何含甲醇的固定剂，因为甲醇会在固定过程中破坏肌动蛋白。
优选的固定剂是不含甲醇的甲醛。
3.2用PBS冲洗固定的细胞2-3次。
3.3可选：在PBS中加入0.1％Triton X-100固定细胞3至5分钟，以增加渗透性。
用PBS冲洗细胞2-3次。
3.4将100μL/孔（96孔板）鬼笔环肽结合物工作溶液加入固定的细胞，并在室温下染色细胞20至90分钟。
罗丹明标记鬼笔环肽丨“不一般”的鬼笔环肽研究
罗丹明标记鬼笔环肽丨“不一般”的鬼笔环肽研究
鬼笔环肽是最早发现的环状肽之一。
它是从Amanita phalloides中分离出来的，并于1937年由Feodor Lynen和Ulrich Wieland结晶。
由于其对肌动蛋白的高亲和力，科学家发现了其潜在用途，可作为一种染色剂有效地观察肌动蛋白显微镜检查。
与荧光团缀合的衍生物被广泛出售。
由于其能够选择性结合丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）而不是肌动蛋白单体（G-肌动蛋白），荧光标记的鬼笔环肽比抗肌动蛋白的抗体更有效。
鬼笔环肽的荧光衍生物在活体或固定细胞内，定位Actin丝状物在体外观察actin丝的实验中起着重要的作用。
罗丹明-鬼笔环肽可用于染色细胞中的肌动蛋白细胞骨架，也可作为用于运动测定的微丝的荧光标记物/稳定剂。
作为一种实验室工具，鬼笔环肽蛋白的用途已被证实，并在于它抑制微丝去聚合的能力。
因此，鬼笔环肽稳定的微丝被用作鉴定和表征不断增加的微丝相关蛋白的底物。
此外，罗丹明标记鬼笔环肽（14 uM 甲醇）Cat#PHDR1可用于染色细胞中的肌动蛋白细胞骨架，也可作为用于运动测定的微丝的荧光标记物/稳定剂。
罗丹明-鬼笔环肽以冻干粉形式提供。
当用500µ甲醇，是14µM（200 x库存）。
Figure 1. 一种瑞士3T3成纤维细胞，用罗丹明-光倍体蛋白（货号：PHDR1）染色。
三倍体蛋白与F-actin特异结合，因此会染色细胞中肌动蛋白应激纤维。
实验九 new 微丝的观察-鬼笔环肽标记
• 3 本实验中能使用甲醇固定细胞吗？为什么？
• 4 动物细胞内重组表达的GFP-Actin 融合蛋白也 能装配成微丝，试设计实验观察GFP-Actin装配形 成的微丝结构，拟出实验的标题，原理、目的和 实验的步骤。
实验九 new 微丝的观察-鬼笔 环肽标记
主要仪器与溶液
• 主要仪器 • 荧光显微镜、移液器（1000ul 和100ul) • 材料：细胞爬片，两人一孔。 • 溶液
• PBS配制的3.7%甲醛溶液。 • 0.1% Triton X-100的PBS洗涤液 • 含有5%BSA和0.1% Triton X-100的PBS按照1:200的比例
稀释Actin-Tracker Green
实验步骤
• a 用PBS洗涤细胞或组织切片2次。每次0.4ml.
• b.弃去洗涤液，用PBS配制的3.7%甲醛溶液室温固 定细胞或组织切片约10分钟。注意：甲醇可以破 坏actin蛋白，因此不能使用含有甲醇的固定液。 并且尽量使用不含甲醇的甲醛。每孔0.2 ml.
• f. 在载玻片上加一滴PBS, 反扣盖玻片（生长有 细胞的一面朝下），随后可以用荧光显微镜进行 观察。
• 为长期保存，可以在片子自然干燥后封片并于4℃ 避光保存，保存时间可长达6个月左右。
实验结果
荧光显微镜
激光共聚焦显微镜
显示的细胞中的微丝分布
作业
• 1 为什么不能使用细胞松弛素B标记微丝结构？
• c.弃去固定液，用含0.1% Triton X-100ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱPBS洗 涤2-4次，每次约5分钟。每次0.2 ml.
• d 弃去洗涤液，把Actin-tracker Green染色工作 液按照每个片子约100μl的比例滴加到片子上， 室温避光孵育30分钟。
鬼笔环肽流式
鬼笔环肽流式引言鬼笔环肽是一种具有重要生物学功能的多肽，其结构特殊且稳定，使其成为药物开发领域的研究热点。
鬼笔环肽流式分析技术是一种基于流式细胞仪的分析方法，能够快速、准确地检测和定量鬼笔环肽的表达水平和分布情况。
本文将从鬼笔环肽的结构和功能、流式细胞仪原理、鬼笔环肽流式分析的方法和应用等方面进行全面深入的探讨。
鬼笔环肽的结构和功能鬼笔环肽是一种特殊的多肽，其主要特点是具有环状结构。
鬼笔环肽通过特殊的肽键连接方式形成一个环状结构，使其具有较高的稳定性和生物活性。
鬼笔环肽的环状结构可以增加其抗酶降解的能力，延长其生物活性，同时也使其在体内作用更加特异性。
鬼笔环肽常见的结构包括α-鬼笔环肽和β-鬼笔环肽，它们在结构上存在一定的差异，因此在功能上也存在差异。
鬼笔环肽具有丰富的生物学功能。
它们可以通过与特定的受体结合，调控细胞的增殖、分化、凋亡等过程，参与多种信号转导通路的调节。
此外，鬼笔环肽还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用，被广泛应用于药物研发和治疗。
流式细胞仪原理流式细胞仪是一种基于光学原理的仪器，用于分析和计数细胞及其内部的各种分子。
流式细胞仪利用激光光源照射样品中的细胞，测量样品中细胞的荧光强度和散射能力，从而实现对细胞的分析和分类。
流式细胞仪的主要原理包括激光照射、荧光检测和散射光检测。
首先，流式细胞仪通过激光器产生高能的单色激光束，照射到样品中的细胞。
然后，细胞吸收激光能量后，会发射出荧光信号。
流式细胞仪通过荧光检测系统收集并测量细胞发射的荧光信号，从而获得不同细胞的荧光强度。
此外，流式细胞仪还可以通过散射光检测系统测量细胞散射光的强度和角度，进一步了解细胞的大小、形状等信息。
鬼笔环肽流式分析的方法鬼笔环肽流式分析是一种利用流式细胞仪对鬼笔环肽进行定量和分布分析的方法。
鬼笔环肽流式分析的主要步骤包括样品制备、细胞染色、流式细胞仪分析和数据处理。
首先，需准备待分析的细胞样品。
样品可以来自动物体内的细胞、体外培养的细胞等。
植物细胞荧光检测技术
植物细胞荧光检测技术前言：细胞荧光检测技术比一般光学检测技术具有灵敏度高、特异性强和测定快速等优点，因 此近年来荧光组织化学，特别是免疫荧光技术有了很大的发展。
当用一种波长的光（如紫外光）照射某种物质时，这个物质会在极短的时间内，发射出较照 射波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。
若发射的光的波长较荧光的长，即为磷光。
有 些生物体受到紫外线的照射后，能直接发出荧光，如叶绿素的红色荧光、木质素的黄色荧光等， 通称为自发荧光或直接荧光。
有的生物材料受紫外线照射后并不发光，但当它结合荧光染料后， 也同样产生荧光，这种荧光称为间接荧光或次生荧光。
除少数生活物质含有自发荧光外，大多数研究，需外加荧光染料，进行特异性的显示，因此 生物荧光色素的选择和研制是荧光细胞化学特别重要的一环。
荧光素是用于荧光检测技术的的经典的荧光染料，可用紫外光（小于 400nm）或蓝光（常为 490nm）激发，然后发射出绿色荧光（500~550nm），其波长范围正是暗适应时眼睛最敏感的范围。
化学反应活性很好的异硫氰酸荧光素（FITC）容易与抗体相连接，是常用的免疫荧光染料。
这类 二抗可从供应商那里买到。
罗丹明、伊红、四甲基罗丹明、Texas 红是一组相关的荧光染料，它们 的激发光波长为 520~590nm，发射光波长为 550~620nm。
它们可以通过一个异硫氰酸侧基与抗体 相连结。
DAPI 是用于荧光标记双链 DNA 最常用的荧光染料。
DAPI 与 AT 碱基结合后其荧光比处于 溶液中的自由状态或与 GC 碱基结合的荧光强约 20 倍。
因此常用于显示细胞核和染色体。
DAPI 可用 330~430nm的光激发，发射出 400~500nm的光，主要是绿光，红光很弱。
DAPI的一个不足 是在多色成像时当用 360nm 的光激发时，DAPI 发射的光太亮从而掩盖了其他的荧光信号，降低 DAPI信号强度的一个简单方法是用405nm的光代替 360nm的光作激发光。
考马斯亮蓝染色法观察细胞微丝
[apparatus, material and reagent]
光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染
色缸、载玻片、盖玻片；
新鲜洋葱鳞茎;
试剂 1.细胞骨架稳定液(CSB ，pH 6.1)：10 mM MES; 138 mM KCl; 3 mM MgCl; 2 mM EGTA; 0.4M 甘 露醇 2. PBS：含0.1% 的TritonX-100 3.封闭液：PBS; 0.1% Ttiton X-100; 2% BSA 4.微丝荧光染料：0.4 µ g/ml罗丹明标记的鬼笔环肽 （Rhodamine-Phalloidin） (用封闭液配制；贮存 液为0.2mg/ml，临用前稀释) 5.封片液： PBS; 0.1% p-phenylenediamine(抗淬灭 剂); 90% 甘油
cytoskeleton
Cytoskeleton of onion cell
B、 dye by Rhodamine-Phalloidin 【purpose】
熟悉细胞骨架固定染色的方法，掌 握用荧光标记的鬼笔环肽显示微丝的原 笔环肽能够特异地与微丝紧密结合。 荧光标记的鬼笔环肽能够在荧光显微镜 下显示微丝的形态和结构。
A、dye by Coomassie blue
【Purpose】
掌握用考马斯亮蓝（Coomassie blue） R250染色法观察植物细胞骨架的方法。
【Principle】
• 细胞骨架(Cytoskeleton) 组成：主要包括微 管、微丝和中间纤维以及核骨架-核纤层体系。 微管主要分布在核周围，呈放射状向四周扩散， 微丝主要分布于细胞质膜的内侧，而中间纤维 则分布在整个细胞中。 • 细胞骨架作用：具有维持细胞形态结构和内部 结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能 量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能。 • 细胞骨架的研究方法：考马斯亮兰R250染色 法、荧光素标记的鬼笔环肽染色法、间接免疫 荧光法等。
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TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽说明书货号:CA1610
规格:300T（300μL）
保存:-20℃避光干燥保存，
1年有效。
产品说明:
鬼笔环肽（Phalloidin）是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏（Amanita phalloides ）的环状七肽毒素，以高亲和力（Kd=20nM）选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin 结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体系中的F-actin，从而对F-actin 进行定性和定量分析。
另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。
且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。
因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白（Actin）抗体进行相关研究。
另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15Å，分子量＜2000Daltons，未标记肌动蛋白（Actin）的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I 等仍能发生反应；鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质；以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。
鬼笔环肽（Phalloidin）的结合阻止丝状肌动蛋白（微丝）的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。
此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。
此外，鬼笔环肽还可抑制F-actin 的ATP 水解活性。
产品性质:
分子式（Molecular Formula）C 60H 70N 12O 13S 2
分子量（Molecular Weight）1231.4
最大激发/发射波长（Ex/Em）540~546/565~575nm
多肽序列（Sequence）TRITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-T rp-4-hydroxy-5-amino-Leu)(S-3to 6)
外观（Appearance）紫色液体
需要自备材料:
1.（可选）甲醇
2.1×PBS缓冲液,pH7.4,细胞培养级别
3.固定液4%多聚甲醛（溶于PBS缓冲液）
4.丙酮或透化液0.5%Triton X-100（溶于PBS缓冲液）
5.Fluoromount-G TM水溶性封片剂（不含DAPI），DAPI
6.（可选）DAPI Fluoromount-GTM水溶性封片剂（含DAPI）
7.（可选）BSA，标准级别
8.载玻片和盖玻片
9.盖玻片周围密封液（如透明指甲油）
10.组装有TRITC激发/发射滤片，以及DAPI激发/发射滤片的荧光显微镜或共聚焦显微镜。
操作步骤:
1.工作液准备
本品以溶于甲醇的20µM储存液形式提供，总量为300µl。
按照100nM的工作液浓度来换算，可制备总量为60ml的工作液。
建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，-20℃避光冻存，一年稳定。
开始实验前，使用1×PBS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。
推荐工作浓度为：80~200nM。
现配现用。
2.染色步骤
1）细胞爬片生长24h，使其密度达到50%汇合度。
2）吸掉培养液，37℃预热的1×PBS（pH7.4）清洗细胞2次。
3）使用溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定10min。
注意：避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。
4）室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。
5）室温条件下，用丙酮（≤-20℃）脱水或者用0.5%Triton X-100溶液透化处理5min。
6）室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10min。
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7）取200µl配制好的TRITC标记鬼笔环肽工作液，覆盖住盖玻片上的细胞，室温避光孵育30min（通常情况下，4℃~37℃孵育皆可）。
注意：为了降低背景，可于TRITC标记的鬼笔环肽工作液内加入1%BSA；另外，孵育过程中为了避免溶液挥发，可将盖玻片转移到一个密封的容器内。
8）用PBS清洗盖玻片3次，每次5min。
9）使用200µl DAPI溶液（浓度：100nM）对细胞核进行复染，约30s。
10)用PBS清洗盖玻片，然后倒置在已经滴有一滴Fluoromount-G TM水溶性封片剂的载玻片上。
使用纸巾轻轻檫掉多余封片剂，然后用指甲油永久封片。
此法制备的标本玻片可置于4℃避光保存，通常6个月内可继续做F-actin染色分析。
注意：也可以直接使用含有DAPI的抗荧光淬灭封片剂合并步骤9）10），简化步骤。
11)荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择TRITC激发/发射滤片（Ex/Em=540/570nm）和DAPI 激发/发射滤片（Ex/Em=364/454nm）。
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