黑曲霉高产纤维素酶菌株的高通量筛选
高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株
米浆 1. 0 g,CaCO3 5. 0 g,琼脂 20. 0 g,pH 6. 5 ~ 7. 0。 培养基于 121℃ ,灭菌 20 min。
1. 3 主要与仪器
DHZ-D 大容量恒温振荡器,太仓市实验设备厂;
MJX-160C 型霉菌培养箱和 YXOQ-LS-75S11 立式蒸
汽灭菌器,上海博迅实业有限公司医疗设备厂; SW-
葡萄糖酸及其盐类广泛应用于食品、医药、化工、 建筑等行业,其中葡萄糖酸钙是白色晶体或粉末,不 仅能够预防钙缺乏症,促进牙齿和骨骼发育,还可治 疗血钙含量过低引起的抽搐和镁中毒等疾病。作为 营养药物,葡萄糖酸钙具有易溶解和吸收的特性,静 脉注射或口服皆可,因此在临床中用途广泛[1 - 3]。
葡萄糖酸 钙 的 制 备 普 遍 采 用 生 物 发 酵 法[4],一 般以黑曲霉作为生产菌种。葡萄糖酸钙用途广,市场 需求量大,筛选高产菌种是提高其产量的关键。高通 量筛选技术是 20 世纪 80 年代发展起来的目的菌种 选育的新技术,具有微型、高效和低成本等优点,已广 泛应用于菌种选育[5 - 7]。本文以经紫外线-LiCl 复合 诱变处理的黑曲霉为研究对象,建立高通量筛选葡萄 糖酸钙高产菌种的方法。
发酵培养基( g / L) : C6 H12 O6 ·H2 O 330. 0 g,CO ( NH2 ) 2 0. 1 g,KH2 PO40. 02 g,MgSO4 ·7H2 O 0. 2 g, 玉米浆 1. 0 g,CaCO3 38. 0 g,pH 6. 5 ~ 7. 0。
上述培养基均于 115℃ ,灭菌 30 min。
致死率 /%
=
对照菌落数 - 处理菌落数 对照菌落数
× 100
1. 4. 2 葡萄糖酸钙的测定方法
1. 4. 2. 1 酶标板分光光度法
高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述
农家参谋科技研究-220-NONG JIA CAN MOU高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述王琪(河南师范大学生命科学学院,河南新乡,453007)【摘 要】纤维素作为自然界最丰富的可再生资源之一,具有易获得、廉价等优点。
近年来,随着全球经济的迅速发展,能源消耗巨大,地球环境遭到严重破坏;因此,寻找可再生的清洁能源迫在眉睫,所以高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用得到了人们广泛的关注,也是当今微生物学、农业科学、生态学的研究热点。
本文对之前高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用的研究进行进行整合归总,展望今后的研究方向。
【关键词】高产纤维素;酶菌;筛选;鉴定1 高产纤维素酶自然界中纤维素广泛存在,但是降解过程生产成本高、环境污染问题,效果不理想。
经大量研究发现,纤维素酶是酶的一种,能够有效降解纤维素。
纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。
细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶,所以近年来各界学者致力于筛选及鉴定高产的纤维素酶菌的研究。
2 高产纤维素酶的筛选与鉴定经查阅资料与分析,从一定地区取样如:土样、常年堆积干枯腐败植物茎秆、东亚飞蝗肠道内等;取一定量样品在三角瓶中富集培养;先梯度稀释,然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于马铃薯平板与牛肉膏蛋白胨分离培养基之上,37℃恒温培养24d,菌落计数,然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落,重复划线接种于相应的琼脂平板上,直至纯化得到单菌落。
根据菌落形态观察,保存不同种的菌落,利用牙签蘸取菌落,放入离心管进一步富集;之后取富集液滴在圆形滤纸片上然后分别接种与刚果红培养基,保持对应关系,进行培养;继而用游标卡尺测量菌落周围水解透明圈的直径,并以其大小作为初步判断分解能力的指标;接下来把筛选出的菌株用单染色法、复染色法和指纹代谢法进行初步确定菌株类别;最后用16SrDNA 鉴定,通过PCR 电泳比对后送公司进行测序;确定菌株后进行酶活测定以及优化其酶活力的条件探究。
目前经大量实验,从陕北花马盐湖分离得到一株黑曲霉Aspergillusniger6MA1,发酵条件优化后酶活可达到47.8U/mL;从常年堆积干枯腐败植物茎秆中筛选出一株肠杆菌属Enterobactersp,在未进行发酵条件优化的情况下酶活达到为0.44u/mL;从湿润木屑中分离和筛选获得1株高产纤维素酶目的菌株LYW-1等。
黑曲霉高产纤维素酶活突变株的筛选
种 子 培 养 基 :玉 米 秸 秆 粉 2g ,营 养 盐 溶 液(2 % (NH4)2SO,0.05% MgSO·4 7H2O,0.01% KH2PO4)5 mL。
基础产酶培养基:玉米秸秆粉 60%,麸皮 40%,营养液 (2.0%(NH4)3PO4,0.05% MgSO4·7H2O,0.01% KH2PO4) 250%(v/w)。
Abstract: A mutant strain named ZM-8 with high activity of cellulase was selected from Aspergillus niger by space-flight mutation. The conditions of solid fermentation for cellulose production were corn stalk power 60%, wheat bran 40%, and tap water 250%(v/w), (NH4)3PO4 2%, pH6.0 at 30℃ for 72 hours. Under these conditions, its enzyme activities of cellobiohydrolase (C1), exoglucanase (CMCase) and β- glucosaccharase(β-Glase) toward filter paper reached 110.2 U/g, 389.9 U/g, 489.3 U/g and 1208.1 U/g and increased respectively by 2.1, 3.5, 1.7, 1.8 times compared to parent strain. It has very high stability of cellulase production after transferring for 5 generations and fermentation in solid medium. The results showed that the mutant A. niger is a preferable strain for the further application of crop stalks. Key words: Aspergillus niger; cellulase; screening
黑曲霉植酸酶高产菌株产酶条件的筛选
1 s m i a公 司 产 品 。 其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析 g
纯 或 生 物试 剂 。
获 取 足 够 的 磷 , 能 维 持 正 常 的 生 命 和 生 产 活 动 。植 酸 才
对 蛋 白质 及 多 种 微 量 元 素 的 利 用 率 , 生 物 产 生 的 植 微 酸 酶被 认 为 是 饲 用 植 酸 酶 的 最 佳 来 源 , 试 验 应 市 场 需 本 求 筛 选 出黑 曲霉 植 酸 酶 高 产 菌 株 产 酶 条 件 , 植 酸 酶 的 为
大 规模 工 业 化 生 产 、 究 和 开 发 新 型 微 生 物 生 物 制 剂 提 研 供试验依据 。
体 积 比例 ( / 分 别 接 种 到 黑 曲 霉 液 体 发 酵 培 养 基 中 , v v) 装 液 量 控 制 在 5 10m , 床 转 数 为 2 0rm n3 0— 0 l摇 0 i,0℃ 培 /
养 1 8 h 0 。 ’
2 2 黑 曲霉 粗 酶 液 的 制 备 .
2 试 验方 法
2 1 黑 曲霉 菌 种 活 化 以 及 酶 液 发 酵 条 件 .
1 试 验 材 料
1 1 菌 株 .
将 黑 曲霉 菌 种 接 种 于 马 铃 薯 培 养 基 中 ,O ℃ 培 养 3 9 , 行 菌 种 活 化 。将 黑 曲 霉 菌 种 活 化 后 , 照 5 的 6h 进 按 %
闻雅 男 , 赵 娜 滕 雪 莹 王 学 英 , ,
(. 宁省蚕业科学研究所 , 宁 凤城 1辽 辽 18 0 ; 2沈 阳农 业 大 学 , 宁 沈 阳 10 6 1 10 辽 1 1 1)
纤维素酶产生菌黑曲霉的选育及其产酶条件的研究
Breeding of Aspergillus Niger and Study of Its Conditions for Producing Cellulase
SU Xiang-ping,GONG Da-chun ,ZENG Jing and YIN Jia-hong
(College of Chemistry and Life Science, Three Gorges University, Yichang, Hubei 443002, China) Abstract: The breeding of high-cellulase-yield strains was operated and the fermentation conditions of the selected strains were studied. As.niger strain S1 was used as mutan strain for ultraviolet irradiation and the cellulase-producing conditions of the mutant strain were optimized through single-factor test and orthogonal test. Finally a high-cellulase-yield strain As. niger S12 was obtained and its optimum cellulase-producing conditions were summed up as follows: pH value was 6.0, culture temperature was at 28 ℃ and 96 h culture time, the use level of stalk meal and wheat bran and 1 % (NH4)2SO4 were 2.5 g, 2.5 g and 10 mL respectively. Under the above conditions, its enzyme activities toward filter paper (FPA), CMCase and β-glucosidase reached 3.79 IU/mL, 19.06 IU/g and 47.33 IU/mL respectively (increased by 1.20, 1.70 and 1.13 times, respectively). Key words: Aspergillus niger; cellulase; mutation breeding
一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法
一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法在工业生产中,柠檬酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、医药、化工等领域。
而黑曲霉是目前最主要的柠檬酸生产微生物,因其高效、高产等优点而备受青睐。
然而,对于黑曲霉发酵生产柠檬酸的方法,如何提高其产量一直是一个备受关注的问题。
本文将从深度和广度的角度,探讨一种提高黑曲霉发酵生产柠檬酸产量的方法。
一、原理解析在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时,关键的生产环节是发酵过程。
而要提高柠檬酸的产量,需要从以下几个方面进行优化:发酵菌株的选取、培养基的配方、发酵条件的控制等。
1. 发酵菌株的选取在选择发酵菌株时,需要考虑其对柠檬酸产量的影响。
一般来说,通过筛选高产菌株,可以有效提高柠檬酸的产量。
选择某些高柠檬酸产量的黑曲霉菌株,能够在一定程度上提高发酵产酸量。
2. 培养基的配方培养基的配方是影响柠檬酸产量的重要因素之一。
通过优化培养基的氮源、碳源、矿物盐等成分比例,可以为黑曲霉提供更适宜的生长环境,从而增加柠檬酸的产量。
添加适量的葡萄糖、氨基酸等营养物质,可以刺激黑曲霉的生长,提高柠檬酸的产量。
3. 发酵条件的控制发酵过程中的温度、pH值、氧气供应等条件的控制对柠檬酸产量也有着重要的影响。
合理的温度和pH值可以促进黑曲霉的生长和柠檬酸的产生,而充足的氧气供应则能提高发酵效率,进而增加柠檬酸的产量。
二、实践应用上述原理虽然看似简单,但在实际应用中却需要综合考虑各个因素,并进行合理的优化。
在进行黑曲霉发酵生产柠檬酸时,可以通过以下方法来提高产量:1. 优化菌株选取首先需要对已有的黑曲霉菌株进行筛选,选择出高产柠檬酸的菌株。
这需要借助研究机构或者实验室的支持,通过采用分子生物学技术等手段进行筛选和改良。
2. 调整培养基配方针对不同菌株、不同生产条件,可以优化培养基的配方,以满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。
在生产实践中,可以根据具体情况进行调整,以获得最佳效果。
3. 控制发酵条件在实际生产过程中,通过精确控制发酵过程中的温度、pH值和氧气供应,可以更好地满足黑曲霉生长和柠檬酸产量的需求。
高产纤维素酶的黑曲霉菌种的选育
安徽农业科学 。 unl f nu A J ra 0 A hi .Si 08 3 (4 :0 0 —134 o c. 0 。6 2 ) 13 3 0 0 2
责任编辑
王淼
责
屈二军 , 索向阳 , 桢 , 英 , 2 赵 陈兰 谷令彪’
(. 1 平强山工学院生 物工程系, 河南平顶山4 0  ̄. 642 7 4 平顶山 市畜产品 质量安全监测中 河南平顶山47 4 心, 6 4) o
摘要 [ 目的 ] 纤维素的进一 步开发利 用奠定理论 基础 。【 为 方法] 选取 茵落直径较 大的黑 霉菌株 W1 作为 出发 菌株进 行 紫外线诱 变, 检 测诱 变菌株在 不 同发 酵时间的 纤维素酶 活力。[ 结果 ] 黑曲霉 WI 紫外线诱 变 1 i达到 9%致死率 。在 试验检 测的 1 范 围内, 经 0rn a 2 0h 8 随 着培 养时间在一 定范 围内延 长 , 出发 菌株 wl 菌株和从 中筛选 出的 高产 纤维素酶 茵株 N 的酶 活均有 不同程度 的提 高 ,W1 2 W1 N 在 8℃1 0 0 rmn 养 8 后 酶活最 高达到 1 1 U m , 培 养 8 酶 活达到 0 98U r , 出发 茵株 W1 高 了 15 倍 。之后 2 / i培 4h .5 / l 5 W1 4 h . / l较 5 n 提 .8 者的酶 活都随 着 培养 时间的延长稍 有降低 。利 用 0 1 刚果红 染液初 步检测诱 变 1 an的黑 曲霉分泌 纤维素酶情 况 , . % 0r i 结果发现诱 变菌株 N 分 泌纤 维 w1 素酶 能力最强 。[ 结论 ] 黑曲霉诱 变茵株具 有较强 的分泌纤 维素酶的能 力。 关键词 纤维素 酶 ; 曲霉 ; 黑 紫外线诱 变; 酶活 中图分 类号 S8 文献标 识码 A 11 文章 编号 1 — 6120)4 00 — 2 7 61(082 —1 3 0 3
高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究
高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究研究目标本研究旨在筛选高产纤维素酶的菌株,并优化其产酶条件,以提高纤维素降解效率和产酶量。
方法1. 菌种收集与筛选1.收集土壤、水源等环境样品,分离出潜在的纤维素酶产生菌株。
2.通过平板培养和传代培养,筛选出具有纤维素酶活性的菌株。
2. 纤维素酶活性测定1.利用Congo Red染色法测定菌株的纤维素酶活性。
2.选择具有较高纤维素酶活性的菌株作为后续研究对象。
3. 优化产酶条件1.确定最适pH:在不同初始pH值下培养菌株,测定产酶量和纤维素酶活性。
2.确定最适温度:在不同培养温度下培养菌株,测定产酶量和纤维素酶活性。
3.确定最适碳源:使用不同碳源(如纤维素、木质素等)培养菌株,测定产酶量和纤维素酶活性。
4.确定最适氮源:使用不同氮源(如蛋白质、尿素等)培养菌株,测定产酶量和纤维素酶活性。
4. 鉴定菌株1.利用生化和分子生物学方法对优选出的菌株进行鉴定,确定其属于哪个科、属、种。
2.利用16S rRNA基因序列分析确定菌株的系统发育关系。
5. 产酶机制研究1.利用电镜观察菌株在不同培养条件下的形态结构变化。
2.利用基因组学方法分析纤维素酶基因在不同条件下的表达情况。
发现1.从环境样品中筛选出了多个具有纤维素酶活性的菌株,其中某一菌株表现出较高的纤维素酶活性。
2.最适pH为7.0,最适温度为50℃,最适碳源为纤维素,最适氮源为蛋白质。
3.经鉴定,该菌株属于纤维素酶产生菌属,并命名为XX菌株。
4.电镜观察发现,在最适产酶条件下,XX菌株的纤维素酶形态结构清晰可见。
5.通过基因组学方法分析,发现XX菌株在最适产酶条件下纤维素酶基因的表达水平较高。
结论1.通过本研究筛选出了一株高产纤维素酶的菌株XX。
2.最适产酶条件为pH 7.0、温度50℃、碳源为纤维素、氮源为蛋白质。
3.该菌株具有潜力应用于纤维素降解和生物质转化领域。
4.通过深入研究其产酶机制,可以进一步优化该菌株的产酶性能和应用前景。
高产纤维素酶菌株的筛选
高产纤维素酶菌株的筛选作者:周成徐磊肖新谢越汪建飞马忠友来源:《安徽农学通报》2016年第08期摘要:该研究从农田土壤中分离得到67株细菌,并从中选出一株高产纤维素酶菌株。
将这些菌株接种到纤维素培养基上,在pH 5.5和28℃的条件下,利用刚果红染色溶液进行染色后,测其水解透明圈与菌落的比值的大小,进行初步筛选。
将这些初筛的菌株接种到培养基中进行摇床培养后,制得粗酶液,并分析羧甲基纤维素酶(CMC)活力测定和滤纸酶(FP)活力及β-葡萄糖苷酶(BG)。
在不同温度的条件下,对纤维素酶活力测定,最终筛选出曲霉A25(Aspergillus sp.)这一株菌株,最适酶活温度为50℃。
产纤维素酶酶活力分别为:CMC 酶活达2 340.92 U/mL;FP酶活达2.66U/mL;BG酶活达164.72U/mL。
关键词:羧甲基纤维素酶;滤纸酶;β-葡萄糖苷酶;曲霉A25中图分类号 S154 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2016)08-22-04Abstract:67 strains of soil bacteria were isolated form farmland,from which a high-yielding cellulase strain was screened.These strains were inoculated on the cellulose medium,and a preliminary screening was conducted,in which we measured hydrolysis transparent circle and the ratio of the size of the colony under pH5.5 and 28℃ conditions by using the Congo Redstaining.Furthermore,these selected strains were cultured,and a crude enzyme liquid was extracted for analyzing the activities of carboxymethyl cellulose(CMC),filter paper enzyme(FP)and β-glucosidase(BG).Under different temperature conditions,the activity of cellulase was determined,and ultimately this one strain of Aspergillus A25 was obtained.Its great activity is under the condition of optimum temperature for 50 ℃.Producing cellulose enzyme activity was as following:CMC amounted to 2 340.92 U/mL,FP activity amounted to 2.66 U/mL,and BG activity amounted to 164.72 U/mL.Key words:Cerboxymethl cellulose;Filter paper enzyme;β- glucosidase;Aspergillus A25纤维素物质是地球上含量最丰富的碳水化合物[1],而目前人类对纤维素的开发与利用还非常有限,因此如何更有效地开发和利用纤维素资源已成为当今世界的热门课题之一。
重离子辐照诱变黑曲霉产纤维素酶菌株的筛选
重离子辐照诱变黑曲霉产纤维素酶菌株的筛选唐嘉徽;杨富民;王曙阳;陈积红;刘敬【摘要】为提高黑曲霉(=AS3.316)产纤维素酶的活力,用20、40、60、80、100、120、140 Gy剂量的重离子束对其进行辐照诱变,并通过初筛、复筛筛选出了纤维素酶活力提高的菌株.结果表明:通过重离子束辐照共筛选出了5株突变体T2-1、T3-1、T5-1、T6-3、T6-4,其中突变体T6-4的纤维素酶活力最高,滤纸酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶、β-葡萄糖苷酶活力分别为:61.3、116.2、29.9、35.9U/mL,与初始菌株相比纤维素酶活力分别提高了3.0、3.78、2.76和2.52倍;其余突变体纤维素酶活力大小依次为T6-3>T5-1>T3-1>T2-1; 120 Gy辐照条件下,诱变效果最为显著;经9代传代稳定性试验,5株突变体在传代过程中虽有不同程度的变化,但总体表现相对稳定.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2012(047)003【总页数】7页(P143-148,154)【关键词】黑曲霉;重离子束辐照;诱变;突变体;纤维素酶【作者】唐嘉徽;杨富民;王曙阳;陈积红;刘敬【作者单位】甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州730070;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000【正文语种】中文【中图分类】Q939.97纤维素酶在食品、饲料、环境污染治理等方面应用广泛,但目前对纤维素酶产生菌的研究大多数集中于木霉属[1],而木霉属由于存在安全性,在食品和饲料上的应用受到限制.黑曲霉是一种纤维素酶的产生菌[2],具较好的安全性,所以目前国内外对其产纤维素酶能力的相关研究报道较多.李爱华等[3]通过优化培养条件提高了黑曲霉产滤纸酶和木聚酶的能力.但仅从优化培养条件来提高黑曲霉产纤维素酶的能力,手段过于单一,所以为获得纤维素酶高产菌株,目前国内外常采用紫外诱变、Co60-γ辐射、激光诱变、离子注入诱变育种[4-5]等多种途径对其进行诱变处理,并取得了一定的效果.赵小立等[6]以黑曲霉为出发菌株,采用铜蒸汽激光诱变处理获得了4株高产的突变菌株,每克湿曲的滤纸酶活力达到299mg葡萄糖/(g·h).王家林等[7]在吸收国内外经验的基础上引进了XX-15A,采用紫外线、特定电磁波辐射、线性加速器、亚硝基胍等物理、化学的诱变方法,获得了高产菌株XT-15H、XT-15H1.重离子束辐照作为微生物诱变育种的一种新技术,与传统辐射源相比,有相对生物效率高、传能线密度大、损伤后修复效应小、能量沉积的空间分辨性好、典型Bragg峰和较小的氧增比等优点[8].尚勇良、杨进才等[5]通过重离子辐照诱变阿佛曼链霉菌发现,辐照诱变后的阿维链霉菌效价浮动范围远远超过一般诱变剂诱变的范围,最高效价水平达到了7 826g/mL,所得高产菌株的辐照剂量仅为10Gy.可见,运用重离子束诱变阿佛曼链霉菌的效果显著,是以往任何诱变源都达不到的.为了探讨重离子束辐照下黑曲霉产纤维素酶活力的影响,本文利用重离子束辐照诱变黑曲霉(=AS3.316),旨在筛选出分解纤维素能力强的黑曲霉菌株.1 材料与方法1.1 菌株黑曲霉(=AS3.316,Aspergillusniger),购于中国工业微生物菌种保藏中心. 1.2 主要试验仪器与试剂高温高压灭菌锅,上海申安医疗机械厂;恒温振荡培养箱,上海一恒科技有限公司;超净工作台,苏州净化设备有限公司;紫外分光光度计,上海光谱仪器有限公司;常规玻璃器具:培养皿、锥形瓶、涂布棒,四川蜀玻有限公司.酒石酸钾钠、无水亚硫酸、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、重蒸苯酚,分析纯,石家庄斯迪亚诺精细化工有限公司;葡萄糖、蔗糖、硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸,分析纯,天津市天新精细化工开发中心;刚果红、明胶、琼脂、蛋白胨、硫酸亚铁、Tween-80,分析纯,兰州市鹏程生物技术有限公司;羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维素、D-(-)Salicin水杨苷、微晶纤维素,超纯,生工生物工程(上海)有限公司.1.3 培养基1.3.1 PDA斜面、平板培养基去皮马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g,蒸馏水1 000mL.1.3.2 纤维素-刚果红平板筛选培养基硫酸铵5g,硫酸镁0.25g,磷酸二氢钾1g,氯化钠0.1g,羟甲基纤维素粉5g,刚果红0.2g,明胶2g,琼脂20g,水1000mL.1.3.3 种子培养基微晶纤维素粉12g,蛋白胨2g,硫酸铵1g,磷酸二氢钾0.5g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.15g,硫酸亚铁0.05g,水1 000mL.1.3.4 发酵培养基草粉60g(过40目筛),麦麸40g(过40目筛),Tween-80 3mL,硫酸铵8g,磷酸二氢钾0.5g,氯化钠0.15g,硫酸亚铁0.05g,硫酸镁0.2g,水1 000mL.1.4 方法1.4.1 12C+6重离子束辐照诱变将黑曲霉接种于PDA斜面培养基上,取得成熟的分生抱子并用无菌生理盐水制成孢子液于盛有小玻璃珠的无菌三角瓶内,充分振荡培养2h后过滤菌液,取滤液制成孢子浓度为10-6个/mL的悬浊液,取5mL孢子悬浊液置于直径为35mm的辐照培养皿中,以封口膜密封.使用兰州重离子加速器国家重点实验室提供的12C+6离子束按照辐照剂量(0,20,40,60,80,100,120,140Gy)对黑曲霉孢子悬浊液进行辐照.1.4.2 突变菌株的选育1.4.2.1 致死率统计分别对每个剂量经过挑选转接后的分离平板和出发菌种对照平板进行菌落计数,按剂量计算出诱变前后的平均孢子浓度,得到每个剂量的致死率[9].1.4.2.2 初筛将辐照后孢子液与对照菌液稀释摇匀,取0.4μL菌液涂布于纤维素刚果红平板上[10-12],封口膜封口置于恒温培养箱中培养,温度28℃,培养60h.不同辐照剂量分设3组平行对照,测量变色圈直径与菌落直径比值(HC比值).1.4.2.3 复筛将初筛菌株转接于PDA斜面培养基上保存,将保存后的菌株接于种子培养基中,按7%接种量接入发酵培养基,于恒温振荡培养箱中,以220r/min,28℃条件下培养72h,发酵液离心(6 000r/min,10min)后取上清液测定酶活,不同突变体分设5组平行对照求其平均值.1.4.3 葡萄糖标准曲线的绘制葡萄糖标准曲线制作,参照DNS法测定发酵液中还原糖的操作方法进行绘制.葡萄糖标准曲线见图1.图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve1.4.4 纤维素酶活力的测定1.4.4.1 滤纸酶活力(FPA)测定在50mL具塞试管底部放入一张新华滤纸(1cm×6cm,(50±1)mg),加入0.5mL适当稀释的酶液,加入1.5mL pH 4.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,50℃水浴保温60min,加入3.0mL DNS试剂,沸水浴显色5min,冷却后定容,摇匀,于540nm处测定样品吸光度,以煮沸5min的酶液作为酶空白,由标准曲线计算样品中所含还原糖的量,根据酶活力单位定义计算出酶活力大小[10-14].1.4.4.2 纤维素内切酶活力(CMC酶)的测定取0.5mL适当稀释的酶液,加入1.5mL的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,于50℃水浴保温30min,加入2mL 10%氢氧化钠溶液终止反应,加入3mL DNS试剂,沸水浴5min,冷却后于540nm处测定样品的吸光度,以煮沸5min的酶液作为酶空白,由标准曲线计算样品中所含还原糖的量,根据酶活力单位定义计算出酶活力大小[10-14]. 1.4.4.3 纤维素外切酶活力的测定取浓度为1g/100mL的微晶纤维素溶液0.5mL,加入0.5mL酶液,于30℃、200r/min震荡20h,加入3mLDNS试剂,沸水浴5min,冷却后在540nm处测定样品的吸光度,以煮沸5min的酶液作为酶空白,由标准曲线计算样品中所含还原糖的量,根据酶活力单位定义计算出酶活力大小[10-14].1.4.4.4 β-葡萄糖苷酶活力的测定取浓度为1g/100mL的水杨素溶液1.0mL,加入1.0mL酶液,50℃反应30min,加入3mLDNS试剂,沸水浴5min,冷却后在540nm处测定样品的吸光度,以煮沸5min的酶液作为酶空白,由标准曲线计算样品中所含还原糖的量,根据酶活力单位定义计算出酶活力大小[10-14].以上酶活定义为:在上述特定的反应条件下1min水解底物产生1μg还原糖的酶量为1U.1.4.5 突变体稳定性测定将辐照诱变筛选出的突变体在PDA斜面上连续传9代,分别取第1代、第3代、第5代和第7代进行纤维素酶活力测定,考察突变体的稳定性.将传代后的突变体菌株接于种子培养基中,按7%接种量接入发酵培养基置于恒温振荡培养箱中,不同代数分设5组平行对照,以220r/min,28℃条件下培养72h,发酵液离心(6 000r/min,10min)后取上清液测定酶活.2 结果与分析2.1 重离子束辐照诱变黑曲霉的致死率由图2可见,随着辐照剂量的不断增加,致死率不断增大,但不呈线性关系.在140Gy时,致死率达到100%,所以黑曲霉的重离子辐照致死剂量为140 Gy.2.2 诱变黑曲霉菌株初筛图2 辐照剂量与致死率的关系Fig.2 The relationship between irradiation dose and the death rate通过测定,对照组(初始菌株)的平均HC值为(1.40±0.23),为确保筛选效果,选择 HC值≥1.80为正向突变体,HC值≤1.0的为负向突变体,从不同辐照剂量中共筛选出12株HC值≥1.80的正向突变体,见表1.由表1可见,辐照剂量在20Gy下正突变体的HC值突变范围最小,在0.98~1.88之间;在120Gy下正向突变体HC值突变程度最大,正向突变体的最大HC值为2.25,负向突变体的最小HC值为0.36,表现出辐照剂量增加HC值突变范围随之变大的趋势.高辐照剂量下获得正、负向突变体的几率越大,更有利于获得高产的正向突变体.但本试验中80Gy辐照剂量下的突变体不符合以上规律,其原因可能是诱变变异的不定向性和随机性所致.表1 不同辐照剂量对突变体HC值及范围的影响Tab.1 The influence of different irradiation dos to mutants′HCvalue and scope“-”:未产生突变体;同一列中辐照组与对照组相比,**表示差异极显著(P<0.01),*表示差异显著(P<0.05)辐照计量/Gy HC值正向突变体/个正向突变体HC 20 0.98~1.88 2 T1-1 T1-2 1.85 1.88 40 0.85~1.93 2 T2-1 T2-2 1.90*1.93*60 0.67~1.86 1 T3-1 1.86*80 0.45~1.72 0 -100 0.38~2.07 3 T5-1 T5-2 T5-3 1.91*2.07*1.89*120 0.36~2.25 4 T6-1 T6-2 T6-3 T6-4 1.80*1.91*2.10**2.25**2.4 诱变黑曲霉菌株的复筛将初筛得到的12株突变体进行复筛,通过测定发酵液纤维素酶活力,筛选出了5株稳定的突变体,其纤维素酶活力测定结果见表2.由表2可以看出,经过初筛得到的突变体,复筛后,5株突变体纤维素酶活力表现较为稳定.其中突变体T6-4纤维素酶活力提高最多,与初始菌株相比,滤纸酶活力提高了3.5倍,纤维素内切酶活力提高了3.78倍,纤维素外切酶活力提高了2.76倍,β-葡萄糖苷酶活力提高了2.52倍.而其他突变体T2-1、T3-1和T5-1虽然纤维素酶活力有所提高,但没有120Gy下的2株突变体T6-3、T6-4提高得多.表2 不同辐照剂量对突变体纤维素酶活力的影响Tab.2 The influence of different irradiation dos to the cellulose enzyme vitality同一列中辐照组与对照组相比,**表示差异极显著(P<0.01),*表示差异显著(P<0.05);同一列中与突变体T6-4相比,△△表示差异极显著(P<0.01),△表示差异显著(P<0.05).菌株辐照剂量/Gy HC值滤纸酶/(U·mL-1)纤维素内切酶/(U·mL-1)纤维素外切酶/(U·mL-1)β-葡萄糖苷酶/(U·mL-1)突变体T2-1 40 1.90*37.8±0.6*△△ 67.1±0.9**△△ 26.0±0.3*25.9±0.4*△突变体T3-1 60 1.86*40.9±0.7*△△ 69.8±0.8**△△ 27.6±0.2*30.7±0.6*突变体T5-1 100 1.91*45.1±0.9**△ 80.4±1.3**△ 30.1±0.3**31.1±0.4**突变体T6-3 120 2.10**53.5±1.1**100.9±1.8**30.8±0.5**33.7±0.7**突变体T6-4 120 2.25**61.3±1.2**116.2±2.4**29.9±0.4**35.9±0.5**初始菌株(CK)0 1.40 24.5±0.6 30.7±0.410.8±0.4 14.2±0.32.4 突变体的稳定性由图3可见,突变体T2-1的纤维素酶系活力在传至第3代后有所下降,在第5代后下降至最低,在第7代、第9代又有所回升,酶活力变化在5%以内,总体保持相对稳定.图3 突变体T2-1遗传稳定性Fig.3 The genetic stability of Mutant T2-1由图4可见,突变体T3-1的纤维素酶系活力在传至9代的过程中,每代虽有下降,但下降幅度不大,酶活力变化在5%以内,总体保持相对稳定.图4 突变体T3-1遗传稳定性Fig.4 The genetic stability of Mutant T3-1由图5可见,突变体T5-1的纤维素酶系活力在传至第3代出现了下降,但在传至第5代出现小的升高趋势,随后保持相对稳定,酶活力变化在5%以内,突变体T5-1也表现出了相对稳定性.由图6可见,突变体T6-3的纤维素内切酶活力出现上下波动的趋势,在第3代、第7代下降较为明显,而在第5代、第9代明显提高,其原因也许与正负调控基因的修复有关.滤纸酶活力也表现出小幅上下波动的趋势,而纤维素外切酶和β-葡萄糖苷酶在传代过程中表现最为稳定,变化幅度最小.突变体T6-3的纤维素酶系活力虽出现小幅波动,但总体相对稳定.图5 突变体T5-1遗传稳定性Fig.5 The genetic stability of Mutant T5-1图6 突变体T6-3遗传稳定性Fig.6 The genetic stability of Mutant T6-3图7 突变体T6-4遗传稳定性Fig.7 The genetic stability of Mutant T6-4由7图可见,突变体T6-4纤维素外切酶活力在第3代、第5代出现下降,而在第7代和第9代出现了提高,与第1代相差不大,酶活力变化在5%以内.滤纸酶活力与β-葡萄糖苷酶活力保持相对稳定,酶活力变化在5%以内.纤维素外切酶活力由第1代至第5代出现下降趋势,传至第7代时下降趋势减缓与第9代基本持平,酶活力变化在5%以内.因此,突变体T6-4总体表现相对稳定.3 讨论与结论1)采用重离子束辐照诱变黑曲霉(=AS 3.316),经过初筛、复筛最终获得5株突变体:T2-1、T3-1、T5-1、T6-3、T6-4.通过稳定性测定表明,5株突变体的纤维素酶活力虽在传代过程中出现不同程度的波动,但总体保持相对稳定.通过纤维素酶活力的测定表明,辐照剂量为120Gy时,可获得较好的诱变效果.在该辐照剂量下诱变得到的突变体T6-3与T6-4纤维素酶活力提高相对较多,其中突变体T6-4的纤维素酶活力提高最多,其滤纸酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶、β-葡萄糖苷酶活力分别为:61.3、116.2、29.9、35.9U/mL.突变体纤维素酶活力由高到低依次为 T6-4>T6-3>T5-1>T3-1>T2-1.表明随着辐照剂量的增加,突变体发生突变的程度越强.2)对黑曲霉(=AS3.316)进行重离子辐照诱变试验表明,菌株的致死率随着辐照剂量的增加而增大,呈现出一种波浪状变化趋势,不存在明显的线性关系[15-16],这与相关文献中所报道的辐照剂量与存活率呈现“马鞍形”的变化趋势相类似[17-18].由于HC值与纤维素酶活力之间存在一定的相关性,即HC值的大小可较为直观的反应菌株纤维素酶活力的强弱.所以由HC值的大小初筛选出12株正向突变体,然而HC值的大小仍无法准确具体的说明纤维素酶活力的大小,也不能说明突变体是否在进行发酵培养后仍能表现较强的纤维素酶活力.因此,初筛获得的突变体需进行复筛.通过复筛,筛选出5株突变体,其中突变体T6-3与T6-4纤维素酶活力提高相对较多,与初始菌株相比,滤纸酶活力分别提高了3.00倍、3.50倍,纤维素内切酶活力分别提高了3.30倍、3.78倍,纤维素外切酶活力分别提高了2.85倍、2.76倍,β-葡萄糖苷酶活力分别提高了2.37倍、2.52倍.该结果表明在辐照剂量接近致死剂量时,存活菌株发生突变的可能越大,获得正向突变体的可能越大,并且突变的程度也越强.在筛选过程中出现了12株突变体中仅有5株纤维素酶活力提高且相对稳定,其余在经过传代后均发生明显下降的现象,该现象可能与辐照后突变体基因的自我修复、回复突变及突变体的不稳定性有关.由于辐照诱变引起细胞损伤,所以筛选出的5株突变体在传代过程中纤维素酶系活力出现了小幅变化,这可能与DNA修复以及正负调控基因的修复有关. 3)重离子束属于高LET(高传能线密度)辐射,它诱变菌株的选择范围要远远高于其他物理诱变源,能产生较高的突变频率和较宽的变异谱[19],有利于选育新品种.在多种诱变方法中,重离子为工业微生物诱变育种提供了新的方法.因此利用重离子辐照诱变微生物并对突变体进行科学有效的方向性选育,可获得更多有利的微生物突变体,这对工业微生物的利用将起到重要的推动作用.参考文献[1]王沁,赵学慧.黑曲霉纤维素酶的研究[J].工业徽生物,1992,22(5):20-23[2]刘桂荣,张鑫,郑明珠.纤维素的生产及应用前景[J].食品研究与开发,2004,25(1):14-16[3]李爱华,王之道.培养条件对黑曲霉产酶条件的影响[J].中国饲料,2006,20(1):19-21[4]李仁民,王菊芳,李文健.重离子束在微生物诱变育种及生物能源开发中的应用[J].原子核物理评论,2007,24(3):234-236[5]尚勇良,杨进才,卫广森,等.重离子辐照诱变阿佛曼链霉菌的实验观察[J].现代生物医学进展,2009,19(15):2844-2846[6]赵小立,贺筱蓉,周红军,等.黑曲霉产纤维素酶菌种的激光选育[J].中国激光,1996,23(7):667-672[7]王家林,王煜.啤酒槽的综合应用[J].酿酒科技,2009,7(1):22-26[8]YIN R C,WU L F.Research development in low-energyion beam-mediated gene transfer[J].Biotechnology Bull,2001,3(1):32-35 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Bioeng,2005,89:606-608(责任编辑胡文忠)。
高产纤维素酶的黑曲霉菌种的选育
高产纤维素酶的黑曲霉菌种的选育屈二军1,索向阳2,赵桢1,陈兰英1,谷令彪1(1.平顶山工学院生物工程系,河南平顶山467044;2.平顶山市畜产品质量安全监测中心,河南平顶山467044)摘要 [目的]为纤维素的进一步开发利用奠定理论基础。
[方法]选取菌落直径较大的黑霉菌株W 1作为出发菌株进行紫外线诱变,检测诱变菌株在不同发酵时间的纤维素酶活力。
[结果]黑曲霉W 1经紫外线诱变10m in 达到92%致死率。
在试验检测的108h 范围内,随着培养时间在一定范围内延长,出发菌株W 1菌株和从中筛选出的高产纤维素酶菌株NW 1的酶活均有不同程度的提高,NW 1在28℃100r/m in 培养84h 后酶活最高达到1.515U/m l ,W 1培养84h 酶活达到0.958U/m l ,较出发菌株W 1提高了1.58倍。
之后2者的酶活都随着培养时间的延长稍有降低。
利用0.1%刚果红染液初步检测诱变10m in 的黑曲霉分泌纤维素酶情况,结果发现诱变菌株NW 1分泌纤维素酶能力最强。
[结论]黑曲霉诱变菌株具有较强的分泌纤维素酶的能力。
关键词 纤维素酶;黑曲霉;紫外线诱变;酶活中图分类号 S181 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)24-10303-02B reeding of a H igh C ellulase P roducing Strain Aspergillus nigerQU E r 2jun et al (Bioengineering Departm ent ,Pingdingshan Institute of T echn ology ,Pingdingshan ,H enan 467044)Abstract [Objective]T he aim was to lay the theoretical basis for the further developm ent and utilization of cellulase.[M eth od]Selecting Aspergillus niger W 1w ith large diam eter as original strain ,the cellulase activity in different ferm entation tim e of the mutant strain was detected after ultraviolet muta 2tion.[Result ]T he lethality of A.nige W 1reached 92%through ultraviolet mutation for 10m in.During the 108h detecting period ,the enzym e activity of the original strain W 1and the screened high cellulase producing strain NW 1increased w ith the prolonging of culture tim e in certain extent.T he enzym e activity of NW 1was highest (1.515U/m l )after culture 84h w ith 100r/m in at 28℃and that of W 1reached 0.958U/m l after culture 84h ,and then that of the tw o strains decreased slightly w ith the prolonging of culture tim e in the follow ing tim e.T he secretion of cellulase from A.nige for 10m in mutation was detected initially by 0.1%C ong o red dyeing s olution and the result sh owed that the ability of cellulase secreted by the mutant strain NW 1was strongest and increased 1.62tim es than that of the original strain W 1.[C onclusion]T he mutant strain of A.nige had strong ability of secreting cellulase.K ey w ords Cellulase ;Aspergillus niger ;Ultraviolet mutation ;Enzym e activity作者简介 屈二军(1975-),男,河南平顶山人,硕士,讲师,从事分子细胞生物学的教学和科研工作。
高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法和使用方法[发明专利]
专利名称:高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法和使用方法专利类型:发明专利
发明人:钟方达,胡峰,唐云容,李波,杨开梅,张文学,赵盈盈,吴正云,钟霞
申请号:CN201210395035.0
申请日:20121017
公开号:CN102876589A
公开日:
20130116
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本发明涉及酿酒领域,具体涉及一种高产纤维素酶活力的菌株及其筛选方法和使用方法。
本高产纤维素酶活力的菌株为曲霉菌,该筛选包括:A.通过无机盐培养基富集培育菌;B.将A富集培育的菌在浸有无机盐培养基的滤纸上进行一次或多次接种;C.获取滤纸断裂处的培养物并将其在羧甲基纤维素培养基平板上进行一次或多次划线分离,得到纯菌株;D.将C得到的纯菌株在无机盐培养基中进行培养并进行纤维素分解;E.将D中纤维素分解能力强的纯菌株接种于灭菌的固态发酵培养基中进行培养;F.通过水浴法提取粗酶液并进行酶活力测试得到高产纤维素酶菌株。
该菌株与酿酒酵母复配使用,以白酒丢糟、麸皮为主要原料进行发酵。
本发明能够提高白酒丢糟的发酵率。
申请人:贵州茅台酒厂(集团)习酒有限责任公司
地址:564622 贵州省遵义市习水县习酒镇
国籍:CN
代理机构:北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人:李世喆
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产纤维素酶真菌的筛选与鉴定
产纤维素酶真菌的筛选与鉴定史同瑞;刘宇;王岩;王爽;李丹;陈曦;秦平伟【摘要】为从秸秆中分离出能够降解纤维的菌株,试验采取秸秆样品接种马铃薯琼脂培养基,在室温环境下培养,取分离菌接种纤维素刚果红琼脂培养基,筛选能形成较大降解圈的细菌,并进行形态学和分子生物学鉴定,测定其纤维素酶性质.结果表明,经分子生物学鉴定,筛选菌为黑曲霉菌,该菌在室温环境能够生长,菌株降解圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)为7.64.筛选菌在20℃环境下培养5d酶活达到最高值,为42.18 U/mL.纤维素酶最适pH为7.0,最适反应温度为20℃,在20~40℃或pH 6.0~8.0环境下作用1h,相对酶活力仍保持在90%以上.综上所述,本试验分离的黑曲霉菌株是低温产纤维素酶菌株,产酶能力较强,具有潜在的开发价值.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)010【总页数】6页(P2794-2799)【关键词】秸秆降解;黑曲霉;纤维素酶【作者】史同瑞;刘宇;王岩;王爽;李丹;陈曦;秦平伟【作者单位】黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006;黑龙江省兽医科学研究所,齐齐哈尔161006【正文语种】中文【中图分类】TQ925植物秸秆是自然界中最为丰富的有机物资源,据统计,2010年中国仅农作物秸秆产量就达8.4亿t[1]。
植物秸秆干重的33.4%~50.0%是植物纤维,植物纤维是工农业生产可利用的重要再生资源,然而由于受植物纤维利用技术的限制,植物秸秆尚未得到充分有效的利用[2]。
每年产生的大量植物秸秆或是被废弃在自然环境中,或是被焚烧处理,这不仅严重污染自然环境,且还造成资源的浪费。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展近年来,随着对可再生能源的需求增加,纤维素酶作为生物质能源转化的重要酶类受到了广泛关注。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究成为了热点和难点,本文将以此为核心,对其研究进展进行综述。
1. 产纤维素酶菌的研究目前已发现的产纤维素酶菌主要包括枯草芽孢杆菌、放线菌、真菌等。
其中,枯草芽孢杆菌是目前被广泛应用于纤维素酶生产的菌种之一,因为其产酶量高、生长速度快、生长条件较为简单等特点而备受青睐。
同时,枯草芽孢杆菌的基因组测序也为其分子遗传学和代谢分析等研究提供了可能。
除枯草芽孢杆菌外,还有放线菌属和糯米壳属等菌种也被报道能够分泌纤维素酶。
这些菌株相对于枯草芽孢杆菌的优点在于产酶能力更强,而缺点在于生长周期长、生长条件较苛刻,且在发酵过程中容易受到杂菌的污染等。
因此,在生产实践中,不同菌种或不同菌株的选择需要根据具体情况进行。
2.1 筛选纤维素酶的筛选方法主要有传统筛选和高通量筛选两种。
传统筛选方法常常是采用纤维素颗粒为基质,利用纤维素降解能力较强的菌株筛选;或者采用含有纤维素的大量自然产物、如木屑等物质进行筛选。
此外,还有利用血红蛋白作为指示物的筛选方法。
这些方法的优点在于操作简单易行,且与实际应用环境接近,但筛选效率较低、筛选速度较慢。
高通量筛选方法是近年来发展起来的一种新型筛选方法。
该方法利用微流控技术,快速筛选出高效纤维素酶生产菌株,并能够评估其酶的活力和稳定性。
同时,还可以利用基因工程手段进行优化,以提高酶的产量和稳定性。
该方法具有快速、高效、高精度等优点,可以大大缩短筛选周期和降低筛选成本。
2.2 改良为了提高纤维素酶的产量和性能,研究人员采用了多种改良方法,包括物理改良、化学改良和基因工程改良等。
物理改良是利用辐射、超声波、高压等物理手段对纤维素酶生产菌株进行改良。
该方法具有操作简单、安全易行、无毒副作用等优点,但改良效果不一定理想。
化学改良主要是利用化学物质处理菌株,使其产生变异,进而产生更高产的纤维素酶。
高产细菌纤维素菌株的筛选及发酵工艺优化的开题报告
高产细菌纤维素菌株的筛选及发酵工艺优化的开题报告
一、研究背景
细菌纤维素是一种具有广泛应用前景的生物质资源,其可用于制备生物燃料、化学品和新型材料等领域。
然而,纤维素的分解需要通过微生物发酵才能实现,因此寻
求高产纤维素酶的菌株和优化发酵工艺具有重要意义。
二、研究目的
本研究旨在筛选纤维素酶高产的菌株,并通过优化发酵工艺提高酶的产量和纯度,为纤维素资源的充分开发利用提供技术支持。
三、研究内容和方法
1. 筛选纤维素酶高产菌株:通过采用胶体酶谱法筛选具有纤维素酶活性的菌株,并使用Shake Flask法对纤维素酶活性进行初步筛选。
2. 优化发酵工艺:对纤维素酶发酵条件进行优化,包括菌株发酵条件、培养基成分优化、培养条件参数优化等。
3. 酶活性测定和纯化:对发酵产生的纤维素酶进行酶活性测定和纯化,为后续纤维素酶工业应用提供基础。
四、预期结果
本研究预期可以筛选出具有高纤维素酶活性的菌株,并通过优化发酵工艺提高产酶量和纯度,为纤维素资源的充分利用提供技术支持。
五、研究意义
纤维素酶在生产生物燃料、化学品和新型材料等领域具有广泛应用前景,而高产纤维素酶的菌株和优化发酵工艺对于提高产量和纯度具有至关重要的作用。
因此,本
研究的结果将为纤维素资源的充分利用提供技术支持,并为相关领域的发展提供创新
思路和技术支持。
【精品】产纤维素酶菌株的筛选
【精品】产纤维素酶菌株的筛选综述纤维素是植物细胞壁中最常见的多糖之一,由β-1,4-葡聚糖链和其它多糖组成。
由于其普遍存在于植物生物体中,纤维素是最广泛分布的生物大分子之一。
纤维素在生物质燃烧、压缩和暴露于微生物作用等过程中产生可再生能源,并且还可以用于生产生物质燃料、化学品和其他生物制品。
利用纤维素聚合物(包括木材纤维素、竹杆和淀粉纤维素等)进行生物质转化是一项重要的能源和环境保护技术。
纤维素酶是能够水解纤维素并将其转化为可利用的糖的一种酶,其催化作用是将纤维素链切割成较小的可溶性碳水化合物。
纤维素酶可分为三类:β-葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶和β-葡聚糖磷酸酶。
纤维素酶是一种关键的生物质转化酶,也是生物质转化技术的核心之一。
然而,纤维素在自然界中很难被“消化”,因此生产纤维素酶具有较高的技术难度。
在微生物界中,产纤维素酶的菌株很少。
因此,筛选高效的纤维素酶制造菌株是极其必要的。
本文将介绍产纤维素酶菌株的筛选方法,以期为该领域的研究提供一定的参考价值。
筛选方法1.体外筛选1.1 纤维素酶活性测定法纤维素酶的活性可以通过测定其水解纤维素的能力来衡量。
常用的纤维素酶活性测定法有半定量法和定量法两种。
(1)半定量法:将预处理(物理或化学,使它们易于分散或离解)的纤维素培养基(如Whatman No. 1滤纸或微晶纤维素)片加入Petridish中,加入菌株后在37℃下培养,48小时后菌落上出现消耗氧气的透明区,即为阳性。
(2)定量法:在已知含量的标准纤维素上加入纤维素酶样品,反应一定时间后滴加定量白蚁葡聚糖重量的Barfoed试剂,重量测定所得的还原糖量即为纤维素酶酶活的计算量。
1.2 瓶内发酵筛选法把菌株预处理后接种于纤维素培养基液体中进行发酵,无细菌法(革兰氏阴性菌类)的来源可从沉淀性污泥、土壤、泉水、海水、挖掘蚕豆瓢虫肠道中获得。
在瓶内发酵过程中,间断取样测定纤维素酶的活性,并通过相关的统计学方法得到产酶量几何平均值和标准差,从而筛选出高产纤维素酶的菌株。
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孔间和板 间酶活力值 的变异 系数均在 5 以下 , 重现性和稳定性均能够满足高通量 复筛 的需要 ; 经过对所得菌株 固 态发酵条件优化后发现 , 当碳源为稻草粉和麸皮 的混合物 , 氮源为 25 硫酸铵添加量 为 15 时 的玉米 浆作为生 . .
长促进剂 , 加水量 为 3 / 1 0g 的 培养 基产 酶 效果 最 好. 最 佳 培养 条 件下 , 分 泌纤 维 素 滤纸 酶 活力 为 5mL (0 ) 在 其
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第 46卷 双 月 刊
黑 曲霉 高产纤维 素酶菌株 的高通量筛选
李兆周 , 学红 陈化靓 梁 剑平 王 , ,
立 的高通量微孔板法进行 复筛 以获得高产纤维素酶菌株 . 果表 明 : 得到 1 结 试验 株稳定 高产 的纤 维素酶 菌株黑 曲
霉 E R 1 6所建立 的复筛 方法的标准 曲线在葡萄糖质量浓度为 O 1 / B -0 ; ~ Omg mL的范 围内线性 良好 (=O 9 97 ) r . 9 5 ,
(. 1 中国农业科学 院兰州畜牧 与兽药研究 所 , 农业部兽用药物创制 重点 实验室 , 甘肃省/ 中国农 业科 学院新兽 药工程 重点实验室 , 甘肃 兰州 7 0 5 ;. 3 0 0 2 兰州理工大学生命科学 与工程学 院 , 甘肃 兰州 705) 30 0
摘要 : 以黑曲霉 GSC 0 0 IC 6 1 8为出发菌株 , 经紫外和 电子束诱 变处理 后 , 采用纤 维素一 刚果 红平板初 筛和新建
3 8 1 P . 7 . F U/ 1 mL
关键词 : 曲霉 ; 黑 纤维素酶 ; 纤维 素一 刚果红平板 ; 微孔板筛选 法
中图分类号 : 9 5 TQ 2 文献标识码 : A 文章编号 :10 —3 5 2 1 ) 50 5—6 0 34 1 (0 1 0— 110
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