试验一蛋白质的定量测定
蛋白定量的实验报告
蛋白定量的实验报告本实验旨在利用免疫印迹（Western blot）技术进行蛋白定量，了解不同浓度蛋白样品的定量方法及其应用，为今后实验设计提供参考。
实验原理：免疫印迹是一种常用的蛋白分析技术，通过在蛋白印迹膜上利用特异性抗体与目标蛋白相互作用，从而检测和定量目标蛋白的存在量。
免疫印迹技术的基本步骤包括：电泳分离蛋白样品、将蛋白转移至膜上、与抗体结合、信号发光和检测。
实验步骤：1. 准备蛋白样品：将待测蛋白样品依次制备成不同浓度的标准品，分别为25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL和100 μg/mL。
2. SDS-PAGE电泳：将不同浓度的蛋白样品加入蛋白电泳缓冲液，按照分子量大小进行电泳分离。
3. 蛋白转移：将电泳分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，可以使用湿式转印法或半湿式转印法。
4. 阻断与孵育：用5%非脂乳糖或3%牛血清蛋白阻断膜上的非特异性结合位点，防止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将目标蛋白的一抗加入阻断液中，孵育膜，使抗体与目标蛋白特异性结合。
6. 二抗孵育：将与目标蛋白一抗结合的二抗加入孵育液中，孵育膜，二抗一般会携带荧光物质或酶标记，在可见光或紫外线下观察或进一步检测。
7. 发光与显影：通过添加发光底物或显色剂，观察蛋白在膜上的相对强度并进行定量分析。
结果与讨论：在本次实验中，我们成功制备了不同浓度的标准品，并进行了免疫印迹实验，通过观察膜上的发光信号强度来定量目标蛋白的含量。
从实验结果中我们可以看出，随着标准品蛋白浓度的增加，免疫印迹膜上的发光信号强度也呈现出增加的趋势。
这是因为在免疫印迹技术中，标准品的蛋白浓度与免疫印迹膜上的发光信号强度成正相关关系。
因此，通过在实验中测量标准品的发光信号强度，可以根据标准曲线来计算待测样品中目标蛋白的含量。
需要注意的是，在进行免疫印迹实验时，关键的环节是选择合适的抗体。
抗体的特异性与亲和力会直接影响免疫印迹结果的准确性。
因此，在实验设计中，需要充分考虑抗体的选择，并进行合适的预实验来验证抗体的特异性和性能。
实验一、protein_assay
光 电 源 件
读 数 单 元
测量完毕，请把光度计的盖打开 ！
TU1800 紫外可见分光光度计 波长范围：1100－200nm 测光系统：单光束 钨灯：340－1100nm 氘灯：200－340nm
光度测量
光谱扫描 定量测量
仪器使用完毕需在记录本上登记使用情况
Folin-酚试剂法（Lowry法）的特点： 4、因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操 作必须精确控制时间。
5、费时较长，试剂配制较繁琐。
实验步骤
0 标 准 蛋 白 (1mg/ml)ul 待测样品 ul 蒸馏水 ul Folin － 酚 试 剂 甲 ml Folin-试剂乙 ul A640 0 1000 4 1 20 980 4 2 40 960 4 3 80 920 4 4 120 880 4 5 160 840 4 6 200 800 4 0 400 600 4 7
注意事项： 1.测紫外吸收要用石英比色皿 ！ 2.定量实验取液要准确。 3. 从低浓度到高浓度依次测量，比色皿 不要润洗。 因此3ml溶液足够测定。 4.测量完毕，请把光度计的盖打开 ！ 5.如实填写仪器使用记录本。 6.进实验室后签到，做完离开时再签名. 7.每次实验时提交上一次的实验报告.
操作
图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱 图A是15μ g /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白 IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱，缓冲液为：0.01% Brij35,0.1M K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。 图B是10μ g /ml RNA和DNA的吸收 光谱。
3、所有的样品（包括标准样品），都必须在规定时间 内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出 的样品浓度与实际的浓度不符。
试验一考马斯亮蓝G-250染色法蛋白质定量
考马斯亮蓝G-250染色法是一种常用的蛋白质定量方法，具有灵敏度高、操作简 便、结果准确可靠等优点。该方法基于蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250之间的特 异性结合，通过比色法可实现对蛋白质的定量检测。
试验原理
蛋白质与染料的结合
考马斯亮蓝G-250是一种阴离子染料，在酸性条件下可与蛋白质中的碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸等）发生静 电相互作用，形成蛋白质-染料复合物。该复合物在595nm波长处有最大吸收峰，且吸光度与蛋白质浓度成正比。
避免染色液溅到皮肤和眼睛。
改进建议
优化染色条件
可以尝试调整染色液的pH值、离子 强度等条件，以提高染色的灵敏度和 特异性。
增加标准品数量
在制作标准曲线时，可以增加标准品 的数量，以覆盖更广泛的蛋白质浓度 范围，提高定量的准确性。
引入内标法
通过添加内标物，可以校正实验操作 过程中可能引入的误差，提高结果的 可靠性。
06
注意事项与改进建议
注意事项
样品处理
确保样品中无干扰物质，如去 污剂、还原剂等，以避免影响
染色结果。
标准曲线制作
制作标准曲线时，应使用与待测 样品相同或相似的蛋白质作为标 准品，以确保结果的准确性。
染色液配制
考马斯亮蓝G-250染色液应新 鲜配制，避免长时间存放导致 试剂失效。
操作规范
在操作过程中，应遵循实验室安 全规范，佩戴防护眼镜和手套，
标准品测定
将不同浓度的标准品与考马斯亮蓝G250染液混合，静置一定时间后，在 分光光度计上测定吸光度。
样品测定
样品处理
将待测蛋白质样品进行适当稀释 和处理，以获得适合测定的浓度
范围。
样品测定
蛋白质的定量测定方法
【实验材料】 1.实验器材 微量凯氏定氮仪1套；50mL凯氏烧瓶4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃 珠 2.试验试剂
置于棕色瓶中暗处保存。
使用前用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂，以标定该试
剂的酸度，一般为2mol／L左右(由于滤液为浅黄色，滴定时滤
液需稀释100倍，以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释 (约1倍)，使最后浓度为lmol／L酸。 (3)标准蛋白质溶液：用分析天平精密称取牛(或人)血清白蛋 白100毫克，用少量蒸馏水完全溶解后，转移至100毫升容量瓶 中，准确稀释至刻度，使蛋白质浓度1mg/mL。 (4)样品溶液：配制约0.5mg/mL的酪蛋白溶液作为未知样品
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含
量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方 法之一。
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂 (1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50mL0.lmol／L氢氧化钠溶液中， 再把0.5g硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液， 然后将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查 出样品溶液的蛋白质含量。
三、微量凯氏定氮法
【实验目的】
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
【实验原理】 凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时， 则可用此法测定样品中蛋白质的含量。 当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳 和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程 通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加 入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂， 以促进反应的进行。
实验一 蛋白质的定量测定 Lowry法
0.9% NaCl
碱性铜试剂
5.0
混匀，37℃ 保温20 分钟 酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混匀，37℃ 保温30分钟
四、 结果与分析
血清蛋白质含量的计算
直接比色法：根据标准管吸光度值计算血清中蛋白质 的含量
标准曲线法：绘制标准曲线，根据标准曲线求得血清 中蛋白质的含量
酚试剂
蓝紫色溶液
A=KLC
ห้องสมุดไป่ตู้直接比色法
标准曲线法
三、 实验步骤
试剂（ml） 标准蛋白溶液
（250μg/ml）
1
2
3
4
5
6
测 定 管
稀释血清
标 准 管
空 白 管
1.0
5.0
0.2 0.8
5.0
0.4 0.6
5.0
0.6 0.4
5.0
0.8 0.2
5.0
1.0 5.0
1.0
0.4 0.6
5.0
1.0
5.0
蛋白质的定量测定 （改良Lowry法）
一、 实验目的
1、 熟悉改良Lowry法测定血清蛋白质含量的原理。
2 、掌握直接比色法和标准曲线法的应用。
3 、熟悉分光光度计的使用。
二、 实验原理
考马斯亮蓝法 紫外分光光度法 Lowry法
二、 实验原理
蛋白质
碱性铜试剂
肽键
酪氨酸、色氨酸等 紫红色蛋白质-铜的络合物 氨基酸残基
蛋白质的定量测定(一)─紫外吸收测定法
实验名称：蛋白质的定量测定（一)─紫外吸收测定法【实验原理】蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基，使蛋白质在280nm处有最大吸收峰。
在一定浓度范围内，蛋白质溶液280nm吸光度与蛋白质浓度成正比，可以用这一性质用作蛋白质定量测定。
【实验准备】一、材料（1）血清（2）待测蛋白质溶液二、试剂（1）标准蛋白质溶液：牛血清白蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，再根据其纯度用0.9%NaCl配制成浓度为1.0mg/ml蛋白质溶液。
（2）0.9%NaCl溶液（3）饱和（NH4）2SO4溶液三、器材（1）紫外分光光度计（2）试管和试管架（3）吸量管（4）离心机（5）移液枪【实验步骤】一、制作标准曲线取8支试管，编号，按下表加入试剂。
测定各管溶液的吸光度值（A280）。
以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。
二、样品测定（1）待测蛋白质溶液含量测定：取待测蛋白质溶液1ml置于10ml试管中，加入3ml0.9%NaCl 溶液，混匀。
以0.9%NaCl溶液为空白溶液，用紫外分光光度计测出待测蛋白质溶液280nm 的吸光度值（A280）。
（2）血清球蛋白含量测定：取新鲜血清100μｌ，边播边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液100μｌ，混匀后室温放置10min，3000rpm离心10min，弃去含清蛋白的上清液，于淀中加入0.9%NaCl 溶液0.5ml，振摇使其溶解，即为粗提球蛋白溶液，再加0.9%NaCl溶液7.5ml，混匀，以0.9%NaCl溶液为空白溶液，测出血清球蛋白溶液280nm的吸光值（A280）。
【实验结果】（1）测出数据如下图所示（2）以标准蛋白质浓度为横坐标，对应吸光度值为纵坐标，绘出标准曲线。
（3）根据测得的待测蛋白质溶液的吸光度值（A280），在已绘制好的标准曲线图中查出蛋白质含量，再乘以稀释倍数，即为待测蛋白质溶液的蛋白质含量。
0.27×4=1.08mg•ml-1（3）根据血清球蛋白溶液的吸光度值（A280），在绘制好的标准曲线图中查出蛋白质含量，并乘以稀释倍数，即为血清球蛋白溶液的蛋白质含量。
蛋白质的定量测定实验报告
8’54”29
8’55”45
8’56”55
8’57”55
冷却等待
9’02”09
9’03”22
9’04”29
9’05”45
9’06”55
9’08”00
操作技巧：
①在这一次的实验中，关键的要点在于滴加Folin-酚试剂的摇匀，必须快速摇匀，保证反应优先进行。振荡试管时，振荡的正确方法是用手腕的力左右摆动，使试管中液体混合均匀且不漏出。最后放入到水浴中加热。
每隔一分钟，依次往1号试管到6号试管中加入2mL的碱性硫酸铜溶液，摇匀并记录每支试管的加入硫酸铜时间，室温静置10min
（3）Folin-酚反应
①将静置时间达到10min中的试管中，加入的Folin-酚试剂，快速摇匀（一般在2s以内）。
②在40 下水浴加热10min钟同样需计时。
③10min钟后取出冷却至室温。
实验时间表：
总表
实验步骤
消耗时间
混合溶液
未计时
滴加溶液静置
10min
加Folin-酚试剂、水浴
10min
室温冷却
27min
等待
20min
比色测定
6min
附表
项目时刻表
试管1
试管2
试管3
试管4
试管5
试管6
加硫酸铜
8’42”09
8’43”20
8’44”29
8’45”45
8’46”55
8’47”55
水浴
8’52”09
注意事项
①试剂要求：实验所需的试剂必须是新鲜配制，不然会存在被空气及其他物质氧化还原的情况，干扰实验的测定。
②控制时间：Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。严格按照实验步骤的操作，规定的时间是多少就多少。水浴时间也不宜过长。同时，在最后从水浴加热后取出冷却后，需及时的进行比色测定。防止混合液中物质发生系列变化和反应。
实验一蛋白质定量测定
优点
费时间较长，要精确 控制操作时间，标准 曲线不是严格的直线 形式，专一性较差，
干扰物质较多
缺点
试验结果的干扰因素
缓冲液
蔗糖
尿素
胍 硫酸钠
干扰物质
硫酸胺
三氯乙酸
乙醇
酚类
丙酮
柠檬酸
为了消除干扰因素的影响，用已知浓度的标准蛋白质进行实验，绘
制标准曲线。
三 试剂与器材
器材 [] 试管及试管架 [] 移液管(、、)、移液枪（,用于样品蛋白质） [] 型分光光度计 [] 电热恒温水浴
蛋白质(g)/ 100ml血清 ＝A640值对应标准曲线蛋白质含量＊10 -6 血清稀释倍数＊100 测定时用稀释血清的ml数
分光光度计：
.开电源预热分钟
.调波长
.用黑体调值(透光率） 为
.用对照管的溶液调 值（吸光率）为。
.测各浓度的标准蛋 白质和血清蛋白质的 值。
【思 考 题】
1.酚法进行蛋白定量测定的优缺点。 2.常用的蛋白质含量测定方法在哪些？
一目的要求
学习酚法测定蛋白质含量的原理和方法。 制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质 含量。
二原 理 、
. 凯氏微量定氮法
蛋白质的定量测定一-双缩脲法
06
CATALOGUE
双缩脲法的改进和发展方向
改进方法
优化试剂配比
通过调整试剂浓度和比例，提高方法的灵敏度和 准确性，减少误差。
扩大应用范围
针对不同来源和性质的蛋白质样品，优化实验条 件，使其能够适用于更多样品的测定。
ABCD
简化操作步骤
减少实验步骤，降低操作难度，提高实验效率。
提高检测速度
采用快速显色反应或缩短反应时间的方法，缩短 实验周期，提高检测速度。
蛋白质结构研究
通过双缩脲法测定不同蛋白质的含量，有助于研究蛋白质的结构和 功能，进一步了解生物体的生命活动。
蛋白质合成与代谢研究
双缩脲法可以用于研究生物体内蛋白质的合成与代谢过程，探索相 关生理机制。
在医学研究中的应用
临床诊断
双缩脲法可以用于检测尿液、血 液等生物样本中的蛋白质含量， 辅助医生进行临床诊断。
药物研发
在药物研发过程中，双缩脲法可 用于检测药物对蛋白质的影响， 评估药物的疗效和安全性。
病理学研究
通过双缩脲法测定病变组织中蛋 白质的含量，有助于病理学研究 ，深入了解疾病的发生和发展机 制。
在食品工业中的应用
食品品质控制
01
双缩脲法可以用于检测食品中的蛋白质含量，确保食品品质符
合标准。
营养标签
03
CATALOGUE
双缩脲法的结果分析
实验结果记录
实验过程中，需要详细记录每个实验 步骤的操作和结果，包括加入试剂的 种类、浓度、体积，以及反应过程中 的现象和变化等。
实验结果记录应准确、详细，包括实 验数据和观察到的现象，以便后续分 析和处理。
结果计算与处理
根据实验记录的数据，进行相应的计 算和处理，以得出蛋白质的含量。
蛋白质定量(LOWRY法)
蛋白质定量/蛋白质含量的测定(LOWRY法)实验原理Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。
因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。
由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。
Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。
实验试剂Na2WO4•2H2O；Na2MoO4•2H2O；85% H3PO4；浓HCl；Li2SO4•H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4•5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。
实验设备试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl；分光光度计。
实验材料可溶性蛋白质实验步骤1. 酚试剂的制备（1）取Na2WO4•2H2O 100g，Na2MoO4•2H2O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml。
安上回流冷却装置（使用磨口接头。
用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入Li2SO4•H2O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。
冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。
使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。
滴定终点由蓝变灰。
实验一蛋白质的定量测定
实验一蛋白质的定量测定——Folin-酚法一、目的要求（1）学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法；（2）制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。
二、实验原理（一）蛋白质定量测定的方法目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量克氏定氮，双缩脲反应，Folin—酚试剂法（Lowry法）。
这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根据实验要求和实验条件进行选择。
（二）Folin—酚法原理1.原理Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。
乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸，溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。
本法可测定范围是25—250ug蛋白质2.优缺点目前实验室多用Folin—酚法测定蛋白质含量。
此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可以稳定几个小时。
缺点是此反应受多种因素干扰。
在测定时应排除干扰因素或做空白试验消除。
此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。
此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。
而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。
生化实验 蛋白定量分析实验报告
蛋白定量分析实验实验一双缩脲法测定蛋白质含量一．实验目的掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和标准曲线的绘制。
二．实验原理在碱性溶液中，具有两个或两个以上肽键的化合物（如蛋白质）可与Cu2+结合生成紫色化合物（双缩脲反应），颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的浓度。
在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于520nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。
三．实验仪器及试剂容量瓶、试管、试管架、恒温水浴槽、吸量管、分光光度计、比色皿试剂：①标准酪蛋白溶液10mg/ml②双缩脲试剂: 溶解2.5g CuSO4·5H2O于100ml水中，加热溶解，取酒石酸钠10g、碘化钾5g，溶于500ml水中，再加5mol/L NaOH溶液300ml混合，倒入硫酸铜溶液，加水至1000ml③小鼠肝脏蛋白原浆四．实验内容（1）取小试管7支，编号，按下表注入溶液（2）混匀后，于37℃水浴中保温15min，在520nm波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。
（3）按表中第七管的数据加入溶液，在37℃水浴中放置15min，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每100ml小鼠肝脏蛋白原浆溶液中蛋白质的克数。
五.实验数据记录及结果分析绘制曲线如下：由图可知，当吸光度为0.107时，相对应的蛋白质克数为1.38 mg，则100ml 小鼠肝脏蛋白原浆液中蛋白质克数为1.38 g。
实验二考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一．实验目的掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法；熟悉紫外分光光度计的使用。
二．实验原理考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，结合物在595 nm波长下有最大吸收峰，测其光的吸收量即可得结合蛋白质的量。
三．实验仪器及试剂仪器：分光光度计，试管，吸量管，比色皿试剂：①考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 ml。
蛋白质的定量分析方法
蛋白质的定量分析方法1．蛋白质的常规检测方法1.1凯氏定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。
原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好。
缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大。
1.2双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。
原理：双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。
优点：较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。
缺点：灵敏度差、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。
1.3Folin酚试剂法原理：与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。
同时也由于Folin酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。
在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含量的测定很有效。
缺点：费时，要精确控制操作时间；Folin酚试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和尿素均会干扰反应。
1.4紫外吸收法原理：蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在280nm处的吸光值与肽键含量成正比。
利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比关系可以测定蛋白质含量。
优点：简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回收。
缺点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。
蛋白质定量测定的方法有哪些
蛋白质定量测定的方法有哪些
蛋白质定量测定的常见方法有以下几种：
1. Bradford方法：基于蛋白质和Bradford试剂反应产生吸光度的变化，利用标准曲线来测定样品中蛋白质的浓度。
2. BCA方法：基于蛋白质和BCA试剂的反应产生的复合物的紫外吸收光谱变化来测定蛋白质浓度。
3. Lowry方法：基于蛋白质与染料（如Folin-Ciocalteu试剂）反应生成的蓝色化合物的峰值吸收度变化来测定蛋白质浓度。
4. UV吸光度法：利用蛋白质在特定波长下的紫外吸收光谱来测定浓度，如在280nm测量腺苷酸蛋白质的含量。
5. 比色法：利用蛋白质与染料或金属离子反应生成的复合物的颜色变化来测定蛋白质浓度，如利用Coomassie蓝染色法或浊度法。
6. 尿素-酸性PAGE测定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和二次洗脱凝胶电泳（acid-urea-Triton X-100-PAGE）相结合的方法，通过与已知浓度的标准蛋白进行定量。
7. 精氨酸测定法：利用精氨酸与二恶安脱水酶反应生成吲哚染料，测定蛋白质的含量。
需要根据具体实验目的和条件选择合适的测定方法。
实验一蛋白质的定量测定
实验一蛋白质的定量测定蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。
在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA 法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。
例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA 法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。
常用的测定蛋白质含量方法的比较测定范围（μ 不同种类最大吸收波方法特点g/ml）蛋白的差异长nm 标准方法，准确，操作麻烦，费时，凯氏定氮法小灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物100—1000 大280205 度法质有影响重复性、线性关系好，灵敏度低，测双缩脲法1000—10000 小540 定范围窄，样品需要量大Folin-酚试20—500 大750 灵敏，费时较长，干扰物质多剂法考马氏亮蓝灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会50—500 大595 G-250 转移灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时BCA 50—500 大562 较长由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250 染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。
蛋白质定量测定的方法
蛋白质定量测定的方法蛋白质是生物体内一类重要的生物大分子，它们参与了生物体内的各种生命活动，对于维持生命活动的正常进行起着至关重要的作用。
因此，蛋白质的定量测定对于生物学研究具有重要意义。
本文将介绍几种常用的蛋白质定量测定方法。
首先，比色法是一种常用的蛋白质定量测定方法。
比色法利用蛋白质与某些特定试剂反应产生颜色，然后通过比色计测定颜色的深浅来确定蛋白质的含量。
常用的试剂有布拉德福试剂、伯杰试剂等。
比色法操作简便，准确度较高，是实验室中常用的蛋白质定量方法之一。
其次，BCA法也是一种常用的蛋白质定量测定方法。
BCA法利用蛋白质与BCA试剂在碱性条件下发生还原反应生成蓝色产物，然后通过比色计测定产物的吸光度来确定蛋白质的含量。
BCA法对于含有还原剂或脂肪的样品有较好的适用性，操作简便，灵敏度高，是蛋白质定量的常用方法之一。
另外，Lowry法也是一种常用的蛋白质定量测定方法。
Lowry法利用蛋白质与铜离子和碱性试剂在碱性条件下发生还原反应，生成蓝色络合物，然后通过比色计测定络合物的吸光度来确定蛋白质的含量。
Lowry法对于蛋白质浓度较低的样品有较好的适用性，操作简便，灵敏度高，是蛋白质定量的常用方法之一。
最后，荧光法也是一种常用的蛋白质定量测定方法。
荧光法利用蛋白质与荧光素染料结合后发生荧光，然后通过荧光光度计测定荧光强度来确定蛋白质的含量。
荧光法对于蛋白质浓度较低的样品有较好的适用性，操作简便，灵敏度高，是蛋白质定量的常用方法之一。
综上所述，蛋白质定量测定是生物学研究中的重要内容，而比色法、BCA法、Lowry法和荧光法则是常用的蛋白质定量测定方法。
在实际操作中，可以根据样品的特点和实验的要求选择合适的方法进行蛋白质定量测定，以确保实验结果的准确性和可靠性。
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比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。
进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波 长：若蛋白质含量高时（25-100μg）在500nm波长 处进行测定，含量低时(5-25μg)在755nm波长处进行
测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋
白质的含量。
此法的优点是：操作简单，迅速，不需特殊仪器设备， 灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20倍，较双缩脲法 灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可
蛋白质遇硝酸后，产生白色沉淀，加热 后沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深呈 橙黄色。
（三）酚试剂反应
蛋白质分子一般都有酪氨酸，而酪氨酸
中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷 钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝 的混合物）。
（四）乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管 壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会 出现紫色环，凡含有吲哚基结构的化合 物都有这一反应。
蒸馏水(ml)
Fo1in-酚试剂甲(ml)
1.0
5
0.9
5
0.8
5
0.7
5
0.6
5
0.5
5
0.4
5
摇匀，室温下放置10分钟 Fo1in-酚试剂乙(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
，以蒸馏水为空白， 在500nm处比色 A500
实验一 蛋白质的定量测定
——Folin-酚试剂法(Lowry法)
蛋白质及氨基酸的呈色反应
（一）双缩脲反应 是由两分子尿素缩合成一种化合物的反 应。
2尿素
180度
双缩脲+氨
双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复 杂的紫红色络合物，这一呈色反应称为双缩脲 反应。
蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相
似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形
成紫红色或蓝紫色络合物。通常可用此
法来定性鉴定蛋白质的存在，也可根据
反应生成颜色的深浅，在540nm波长处 进行比色，定量测定蛋白质的浓度。允 许测定范围为0.2-1.7mg蛋白质/ml。
（二）蛋白质的黄色反应 芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的 蛋白质所特有的呈色反应。
凯氏定氮法 双缩脲法 Folin-酚法 紫外（UV）分光光度法 考马斯亮兰染色法
一、实验目的
1.学习Folin-酚试剂法测定蛋白质 含量的原理。 2.掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质
含量的方法和操作。
二、实验原理
Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由 碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质 中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用， 生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸，硫酸， 溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸 的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正
（五）坂口反应 精氨酸分子中所含量胍基能与次溴酸钠 （或次氯酸钠）及α -萘酚在碱性溶液中 形成红色产物。
（六）米伦反应（Ｍillon）
米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、
亚硝酸的混合液。蛋白质溶液中加入米 伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀 变为红色。酚类化合物有此反应。
常用的蛋白质定量测定的方法
试剂乙： 称钨酸钠（Na2WO2•2H2O）100g，钼酸钠 （Na2MoO4•2H2O）25g置2000ml磨口回流装置内， 加蒸馏水700ml，85%磷酸50ml和浓硫酸100ml。 充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加 小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂 （LiSO4）150g，蒸馏水50ml及液溴数滴。在通风橱 中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至 1000ml，过滤即成Folin-酚试剂乙贮存液，此液应为 鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中，可在冰箱长期保 存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液 溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。 试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢 氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶 液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试 剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于 1mol/L酸度应用。
三、实验材料
（一）实验器材 100毫升容量瓶 2只；移液管 1毫升4 支，5毫升2支；722型分光光度计。
（二）实验试剂 试剂甲： 1) 4%碳酸钠溶液 2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液 3) 1%硫酸铜溶液 4) 2%酒石酸钾钠溶液。 临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢 氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸 铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1 的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂 临用前配制，一天内有效。
以稳定几个小时。
缺点是此反应受多种因素干扰。在测定时应排除干扰因素或做空 白试验消除。此法是在Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂， 因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CSNH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗 糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin—酚反应。此外，所测 的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。 而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸 钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇 （5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些 物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品 中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若 样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即 可纠正显色后色浅的弊病。
（二）标准和待测蛋白质溶液 1. 标准蛋白质溶液 结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量 凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度 配制成150ug/ml蛋白溶液 2. 待测蛋白质溶液 人血清，使用前稀释100倍。
四、实验操作
1. 绘制标准曲线:取7支试管，按下表分别加入各试剂
试 剂 标准蛋白质溶液(ml) 管 0 0 1 0.1 2 0.2 号 3 0.3 4 0.4 5 0.5 6 0.6