Monascusruber5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析
洛伐他汀原料药的制备工艺及质量研究
洛伐他汀原料药的制备工艺及质量研究洛伐他汀原料药是一种高效的降脂药物，被广泛应用于心血管疾病的治疗。
本文主要介绍洛伐他汀原料药的制备工艺及质量研究，希望能够为相关研究人员提供参考。
1. 洛伐他汀原料药的制备工艺洛伐他汀原料药可以通过化学合成、酵素法和微生物法等多种方法制备。
其中，化学合成法是最常用的制备方法，下面将介绍化学合成法的具体步骤。
1.1 原料准备洛伐他汀的合成需要的原材料主要有：丁酸二乙酯、1,2-环己二烯、苯甲酸、氢氧化钠、2-丙酮基-4-甲基-γ-羟基丁酸等。
这些原材料需要经过严格的筛选和质量检验，以确保产品的质量和稳定性。
1.2 活化反应丁酸二乙酯被加入到一个反应器中，然后加入氢氧化钠水溶液和苯甲酸。
在搅拌的同时，将反应温度升至80-100℃。
接着加入1,2-环己二烯，继续搅拌15-30分钟，使反应物完全反应。
1.3 晶化和分离反应结束后，待反应液冷却至室温，加入乙醇和水混合液，晶体随着乙醇和水的加入而逐渐析出。
将晶体经过过滤和洗涤后，放置干燥至恒定重量即可得到洛伐他汀原料药。
2. 洛伐他汀原料药的质量研究洛伐他汀原料药的质量研究是制备过程中必不可少的环节。
下面将介绍几种常用的质量研究方法。
2.1 红外光谱法红外光谱法可以用来检测洛伐他汀原料药的分子结构和官能团，有助于判断样品的纯度及杂质成分。
此外，红外光谱法还可以与已知样品的光谱图进行比对，从而确保产品的质量。
2.2 氯仿提取法氯仿提取法也是一种常用的质量研究方法。
其基本原理是利用氯仿与样品中的化合物发生反应，从而将洛伐他汀等有机物氯仿层中提取出来。
提取后，可以通过旋转蒸发仪将氯仿去除，最后得到纯净的洛伐他汀原料药。
2.3 HPLC法高效液相色谱法（HPLC）是一种流行的药物分析方法，广泛应用于洛伐他汀原料药的质量研究。
通过使用特定的样品制备和柱层使用方法，HPLC法能够对样品中的成分进行有效的分离和识别，为产品质量控制提供了可靠的依据。
洛伐他汀原料药的制备工艺及质量研究
洛伐他汀原料药的制备工艺及质量研究一、洛伐他汀概述洛伐他汀是一种常用的降脂药，属于HMG-COA还原酶抑制剂类别。
它通过抑制胆固醇合成途径中的HMG-COA还原酶，从而降低了胆固醇和LDL-C水平，起到了显著的降脂作用。
由于其优异的疗效和稳定的性能，在临床治疗中得到了广泛的应用。
二、洛伐他汀原料药的制备工艺洛伐他汀原料药主要是通过化学合成的方式进行制备的。
目前已经有多种工艺可以进行原料药的制备，这里我们主要介绍其中较为常用的两种工艺。
1、工艺一洛伐他汀原料药的制备工艺一如下：（1）以黄酮为原料，通过硫酸催化得到轻酮。
（2）将轻酮进行羰基化反应，得到戊酸盐。
（3）将戊酸盐通过微生物法或化学还原法转化为酸。
（4）将酸经过多次水解反应后，得到三磷酸化学物。
（5）将三磷酸化学物在氢氧化钠的存在下进行脱羧反应，得到洛伐他汀原料药。
2、工艺二洛伐他汀原料药的制备工艺二如下：（1）以黄酮为原料，经过氧化反应得到被氧化化的黄酮，然后经过还原反应，得到精氨酸盐。
（2）将精氨酸盐与戊酸酐进行反应，得到戊酸精氨酯。
（3）将戊酸精氨酯通过生物转化反应，得到己酸精氨酯。
（4）将己酸精氨酯经过多次水解反应后，得到三磷酸化学物。
（5）将三磷酸化学物在氢氧化钠的存在下进行脱羧反应，得到洛伐他汀原料药。
以上两种工艺中，工艺一是较为简单的制备方法，容易操作，原材料来源也比较广泛，因此在实际制备过程中比较常用。
而工艺二虽然复杂，但其原材料来源更加纯净，得到的洛伐他汀原料药效果较好，因此也有一定的使用价值。
三、质量研究为了保证洛伐他汀原料药的质量，需要对其进行严格的质量研究。
目前常用的质量控制方法主要包括理化性质测试、纯度分析、结构鉴定、含量测定和杂质检验等。
在理化性质测试中，常用的方法主要包括颜色检查、溶解性测试、熔点测试、旋光度测定、水分含量测定等。
这些测试方法可以较为清晰地表征洛伐他汀原料药的物理和化学性质，有助于检验样品的成分和纯度。
洛伐他汀发酵条件研究
洛伐他汀发酵条件研究作者：游玟娟温拥军来源：《中国化工贸易·下旬刊》2018年第03期摘要：为了提高Monascus sp.UV-D-9发酵生产洛伐他汀的能力，对其发酵条件进行了研究。
结果表明：最佳温度为30 ℃，装液量130mL，转速180 r·min-1。
在此条件下，洛伐他汀产量为 0.312 mg·mL-1，比原始产量提高了8%。
关键词：洛伐他汀；红曲霉；发酵条件；研究洛伐他汀（Lovastatin）是临床上常用来治疗高血脂、高血压、冠心病等“富贵病”的药物，它作为体内羟甲戊二酰辅酶A（HMG-CoA）的结构类似物，能竞争性抑制HMG-CoA的代谢，减少机体内胆固醇的生成，从而对高血压和冠心病等疾病起到一定的防治作用。
随着社会经济的发展，人民生活水平日益升高，近年来高血脂、高血压、冠心病等“富贵病”发病率显著增加，因此对洛伐他汀的需求量也日益增加。
目前，洛伐他汀主要是通过微生物发酵生产，在微生物发酵中，优良的菌种和优化的发酵条件是获得高产的关键。
课题组采用复合诱变获得了洛伐他汀高产菌株Monascus sp.UV-D-9，本实验对Monascus sp.UV-D-9的发酵条件进行优化研究，以期进一步提高洛伐他汀的产量，为功能性红曲的开发提供理论依据。
1 材料与方法1.1 材料与仪器①菌株。
红曲霉（Monascus sp. UV-D-9），为本课题团队前期诱变得到的洛伐他汀高产菌株，保存于本校生物制药实训基地；②培养基。
斜面培养基： PDA培养基；种子及发酵培养基：PD培养基；③洛伐他汀标准品。
购于上海永叶生物科技有限公司，纯度≥98%；④主要仪器。
HPS-250生化培养箱（哈尔滨东明）；CBV-1500A超净工作台（上海瑞仰）；QYC.2102摇床（上海福玛）；DZ4-0.8A离心机（北京医用）；高效液相色谱仪（美国戴安）。
1.2 实验方法①菌种活化。
用接种环取1环红曲霉孢子，接种到斜面培养基上，置于生化培养箱中，于32℃下培养4d；②摇瓶种子液的制备。
红曲霉生产洛伐他汀的技术发展
红曲霉发酵生产Monacolin K的工程技术研究进展摘要：红曲的药用价值和保健功效日益引人关注，其中洛伐他汀作为红曲主要的调脂因子成为科研热点和红曲产业发展的重点。
概述红曲洛伐他汀的发现、用途、生产方法、提纯、检测方法、毒性物质问题以及生产现状进行综述。
关键词:红曲霉、洛伐他汀、检测、提取、桔霉素1.前言1.1 Monacolin K的发现及结构式Monacolin K是目前较好的降低人体血液中胆固醇的药剂,具有降胆醇、降血脂的作用,又叫洛伐他汀(lovastatin) ,存在于红曲霉及其它真菌如Pleurotus，Phoma，penicillium中。
生产所使用的菌种主要有两类:红曲霉和土曲霉,东方国家如日本及我国多采用红曲霉,欧美等国的研究多采用土曲霉川,最近几年,美国也开始意识到中国食品红曲中的药用价值。
其结构式为：分子式为C24H36O5,Mr为404。
1979年,日本学者远藤章首先从红色红曲霉菌Monascus ruber中发现某些能产生强力抑制胆固醇合成的活性物质,命名为Monacolin K, Monacolin K 类物质不仅可以降低胆固醇,而且对重症胆固醇血症患者也极为有效,特别是对导致动脉硬化最严重的低密度蛋白胆固醇有优先降低的作用,其中以Monacolin K抑制HMG一COA还原酶的活性最高川。
1980年,美国Albert等从土曲霉中发现了与Monacolin K相同的物质侧,命名为mevinolin,现称作洛伐他汀(Lovastatin)。
但是采用土曲霉发酵,菌株的安全性对下游工程的技术要求较高,因此提取收率较低。
由药用红曲霉制成的制剂具有较强的降血脂能力,副作用较低于Lovastatin制剂。
近些年来,我国开展了红曲霉降血脂生理活性物质的研究。
1.2 Monacolin K的基本性状见表1。
1.3Monacolin K抑制胆固醇合成的作用机理生物化学的研究表明,胆固醇合成的关键步骤是甲经戊酸的合成(见结构式)。
洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH的克隆及其序列分析比较
洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH 的克隆及其序列分析比较【摘要】目的克隆红曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH，并进行序列分析和同源性比较。
方法根据GeneBank土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因序列设计引物，以土曲霉和红曲霉基因组DNA为PCR扩增lovE和mkH基因并克隆到pMD19T simple载体。
利用DNAMAN等以及互联网资源对lovE和mkH测序结果与其编码的氨基酸序列进行分析比对。
结果分别扩增得到1 512 bp和1 464 bp的目的片段lovE和mkH。
结论 lovE和mkH同源性很高，并与GeneBank中相关已知序列基本相同，是洛伐他汀生物合成酶调控基因，且其表达产物为GAL4类转录因子。
【关键词】土曲霉红曲霉洛伐他汀转录因子调控基因洛伐他汀是胆固醇生物合成中的关键酶还原酶的竞争性抑制剂，是目前治疗高血脂症最有效的药物之一［1-3］，它可下调炎症相关转录因子的表达，减缓动脉粥样硬化［4,5］，并可促进恶性甲状腺细胞凋亡［6,7］，具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能［8］。
土曲霉洛伐他汀合成酶基因簇包括以及lovI和lvrA等基因［9-11］。
红曲霉洛伐他汀合成酶基因簇包括等9个基因。
其中lovE和mkH分别是土曲霉和红曲霉洛伐他汀生物合成的调控基因，编码GAL4类转录因子，其氨基酸序列中半胱氨酸富集的DNA结合区域表明含有Zn2Cys6型锌指结构域［12-14］。
为深入研究洛伐他汀生物合成调控基因的生物学功能并利用这类转录因子来调控洛伐他汀合成代谢，本研究首次从国内常用工业原始出发菌株土曲霉CCTCC AF93208和红曲霉CICC5031基因组中PCR扩增克隆洛伐他汀合成酶调控基因，并对该基因和其编码的蛋白产物进行序列分析对比。
1 实验材料菌株和培养基土曲霉CCTCC AF93208：中国典型培养物保藏中心;红曲霉CICC 5031：中国工业微生物菌种保藏中心;大肠杆菌DH5α为本实验室保藏;大肠杆菌LB培养基和LB/Amp培养基均按实验室常用培养基的配置方法配置。
4种功能红曲相关标准中洛伐他汀含量测定方法的比较
4种功能红曲相关标准中洛伐他汀含量测定方法的比较李志强，刘颖，林风，吴丽云**(福建省微生物研究所福建省新药(微生物）筛选重点实验室，福建福州350007)摘要:功能红曲中的洛伐他汀是具有降脂功能的生物活性物质，其含量是功能红曲重要的质量指标之一。
现阶段我国功能红曲产品相关标准中规定的洛伐他汀含量测定方法并不完全相同。
为准确测定功能红曲中的洛伐他汀含量，该研究选取5份红曲，分别按 4种功能红曲产品标准中规定的方法进行洛伐他汀含量测定，发现《中国药典》2015年版的方法会导致酸式洛伐他汀的保留时间异常、峰形不对称。
其他3种标准中规定的高效液相色谱方法均可测定功能红曲中洛伐他汀酸式和内酯式构型的含量，但洛伐他汀总含量测定结果有较大差异，使用《四川省中药饮片炮制规范》2015年版的方法测定结果较好。
关键词:功能红曲;洛伐他汀;高效液相色谱中图分类号:TS202.3 文章编号：0254-5071 (2018)05-0184-05 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2018.05.036Comparison o f lovastatin determination methods o f four related standards o f functional red kojiLI Zhiqiang, LIU Ying, LIN Feng, WU Liyun*(Fujian P rovincial K e y Laboratory o f S creening fo r N o v el M icrobial Products，F ujian In stitu te o f M icrobiology，F uzhou 350007, China)Abstract: Lovastatin, produced by functional red koji, is a beneficial bioactive substance with lipid-lowering function. The content of lovastatin is one of important quality indexes of functional red koji. However, the methods described in functional red koji related standards in China are different. In order to determine the content of lovastatin accurately, five functional red koji samples were selected, and the contents of lovastatin were determined according to four related standards. Results showed that using the method in China Pharmacopoeia the 2015 edition, the retention time of the acid forms of lovastatin was abnormal, and the acid forms of lovastatin showed the asymmetric peak shapes. Both acid and lactone forms of lovastatin were determined synchronously by HPLC methods in the other three standards, but there was much difference among the total contents of lovastatin determined by these methods. The method of Sichuan Standards for the Processing of Chinese Herbal Pieces the 2015 edition was a better one.Key words：functional red koji; lovastatin; HPLC红曲是用红曲菌(Monascus sp.)发酵米饭制成的一种 紫红色曲米，在我国已有超过1 000年的历史，被广泛应用 于食品着色，醋、酒酿造，生物催化及传统中医药等领域，是极为珍贵的药食两用原料，具有极高的开发价值。
产洛伐他汀红曲菌的筛选及中药对其固态发酵的影响
产洛伐他汀红曲菌的筛选及中药对其固态发酵的影响车 鑫1,2，毛 健1,2,3,*，刘双平1,2,3，周志磊1,2,3，薛景波1,2（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡 214122；3.国家黄酒工程技术研究中心，浙江绍兴 312000）摘 要：经洛伐他汀（Monacolin K）抗性平板筛选和固态发酵实验验证，从红曲分离源中得到一株产洛伐他汀能力最强的菌株，并命名为M2-1，发酵12 d后其洛伐他汀产量可达1.472 mg/g（以干基计）。
结合形态学特征和核糖体DNA内转录间隔区序列分析，将其鉴定为红色红曲菌（Monascus ruber）。
考察15 种药食同源中药及其添加形式（药粉、药汁）对菌株M2-1固态发酵产洛伐他汀、色价等指标的影响，结果显示：陈皮粉、山楂粉、山楂汁、桑叶粉、丁香汁、黑胡椒汁、白芷粉制备药红曲效果最佳（P＜0.05），其中陈皮粉红曲和山楂汁红曲的洛伐他汀和色价最高，分别为2.118 mg/g和320.12 U/g，分别较普通红曲提高43.89%和71.79%。
本研究发现多种中药能够促进红曲菌产洛伐他汀和红曲色素，为进一步提升传统红曲的药食两用功能提供了新的思路。
关键词：红色红曲菌；中药；固态发酵；洛伐他汀；色价Screening of Monacolin K-Producing Monascus and Effects of Chinese Medicinal Herbal Materials on Monacolin KProduction in Solid-State FermentationCHE Xin1,2, MAO Jian1,2,3,*, LIU Shuangping1,2,3, ZHOU Zhilei1,2,3, XUE Jingbo1,2(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;3. National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine, Shaoxing 312000, China)Abstract: One strain with the most powerful capability of producing Monacolin K named M2-1 was screened from red mold rice (RMR) using Monacolin K-containing plates and validated by solid-state fermentation. The yield of Monacolin K reached 1.472 mg/g (dry basis) after 12 d fermentation. The strain was identified as Monascus ruber by morphological and rDNA-ITS sequence analysis. The effects of powders and water extracts of 15 edible and medicinal herbs on Monacolin K production and color value of M2-1 in solid-state fermentation were studied. Results indicated that Pericarpium Citri Reticulatae, Fructus Crataegi, Folium Mori and Radix Angelicae Dahuricae powder as well as Fructus Crataegi, Flos Caryophylli and Fructus Piperis extracts significantly improved the quality of RMR (P < 0.05). By adding Pericarpium Citri Reticulatae powder and Fructus Crataegi extract to the fermentation medium, the maximum Monacolin K production of2.118 mg/g and the highest color value of RMR of 320.12 U/g were obtained which were increased by 43.89% and 71.79%compared those obtained with the ordinary strain, respectively. This study discovered a variety of Chinese medicinal herbs that could promote the production of Monacolin K and Monascus pigment by Monascus ruber, which will provide a novel strategy for improving the efficacy of traditional RMR as an edible and medicinal resource.Key words: Monascus ruber; Chinese medicinal herb; solid-state fermentation; Monacolin K; color valueDOI:10.7506/spkx1002-6630-201613020中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2016）13-0114-06引文格式：车鑫, 毛健, 刘双平, 等. 产洛伐他汀红曲菌的筛选及中药对其固态发酵的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(13): 114-119.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613020. 收稿日期：2015-09-10基金项目：国家自然科学基金面上项目（31571823）作者简介：车鑫（1990—），男，硕士研究生，主要从事食品生物技术研究。
一种紫色红曲菌及其共酵产洛伐他汀的方法与应用[发明专利]
![一种紫色红曲菌及其共酵产洛伐他汀的方法与应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/d3d1331c0166f5335a8102d276a20029bd64636c.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910655078.X(22)申请日 2019.07.19(83)生物保藏信息CCTCC NO：M 2018910 2018.12.20(71)申请人 江南大学地址 214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号(72)发明人 毛健 刘双平 韩笑 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211代理人 张勇(51)Int.Cl.C12N 1/14(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12N 1/18(2006.01)C12G 3/022(2019.01)C12J 1/04(2006.01)C12R 1/645(2006.01)C12R 1/25(2006.01)C12R 1/07(2006.01)C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称一种紫色红曲菌及其共酵产洛伐他汀的方法与应用(57)摘要本发明公开了一种紫色红曲菌及其共酵产洛伐他汀的方法与应用，属于发酵工程与生物技术领域。
本发明的紫色红曲菌已于2018年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2018910，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
该种红曲菌固态发酵制备红曲发酵剂中洛伐他汀产量可达6～12mg/g，色价可达1500～2500μ/g，均处于较高水平且无桔霉素检出。
权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 110373332 A 2019.10.25C N 110373332A1.一种紫色红曲菌，分类命名为紫色红曲菌(Monascus purpureus)H8-2，所述菌株已于在2018年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018910。
2.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的紫色红曲菌H8-2。
高效液相色谱法测定洛伐他汀胶囊的含量
高效液相色谱法测定洛伐他汀胶囊的含量作者：李月明来源：《科学与财富》2017年第29期摘要：本文采用高校液相测定了洛伐他汀胶囊中洛伐他汀的含量，固定相为：安捷伦Cl8（4.6mm×250mm，5um），甲醇-10mmol/L甲酸铵-0.2%甲酸水溶液（70：30）为流动相，检测波长为238nm，流速1.0mL·min-1，柱温：30℃。
洛伐他汀在30～110μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。
洛伐他汀的平均回收率为99.3%，RSD为0.81%（n=6）；此方法简便、准确、重现性好，可用于洛伐他汀胶囊中洛伐他汀的含量测定。
关键词：洛伐他汀胶囊；洛伐他汀；含量洛伐他汀胶囊在体内竞争性地抑制胆固醇合成过程中的限速酶羟甲戊二酰辅酶A还原酶，使胆固醇的合成减少，也使低密度脂蛋白受体合成增加，结果使血胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平降低，适用于高脂血症，高胆固醇血症等症状。
洛伐他汀胶囊还可降低血清甘油三酯水平和增高血高密度脂蛋白水平。
洛伐他汀胶囊最常见的不良反应为胃肠道不适、腹泻、胀气等。
本文采用高校液相测定了洛伐他汀胶囊中洛伐他汀的含量。
1 仪器与试药Dura 12/24超纯水系统（上海和泰仪器有限公司）；CLEAN PH200便携式酸碱度测试仪（西安优普仪器设备有限公司）；SPECORD250 PLUS紫外可见分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司）；实验室玻璃器皿自动洗瓶机（西安优普仪器设备有限公司）；PTX-FA110万分之一天平（上海鑫仓电子科技有限公司）；KQ250DE超声波清洗器超声波检测仪器（烟台鑫康商贸有限公司）；LDW-S实验室污水处理机（上海路岛分析仪器有限公司）；LC3000高效液相色谱仪（山东滕州市滕海分析仪器有限公司）。
洛伐他汀对照品由中国药品生物制品检定所提供。
乙腈（山东浩中化工科技有限公司）、三乙胺（山东浩中化工科技有限公司）、磷酸（武汉市伟琪博星生物科技有限公司）、甲醇（山东浩中化工科技有限公司）、甲酸铵（山东浩中化工科技有限公司）、甲酸（山东浩中化工科技有限公司）、冰醋酸（山东浩中化工科技有限公司）、磷酸氢二钠（武汉市伟琪博星生物科技有限公司）、三乙胺（山东浩中化工科技有限公司）、氢氧化钠（山东浩中化工科技有限公司）。
土曲霉与红曲霉双灭活原生质体融合选育洛伐他汀高产菌株
土曲霉与红曲霉双灭活原生质体融合选育洛伐他汀高产菌株李桂杭;朱碧云;李浩明【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2012(031)002【摘要】研究原生质体融合技术选育洛伐他汀高产菌株的方法.土曲霉(Aspergillusterreus)和红曲霉(Monascus anka)用混合酶液(体积分数0.5％溶菌酶,0.3％纤维素酶,0.3％蜗牛酶)分别酶解5.0h和3.5h制备原生质体,土曲霉原生质体和红曲霉原生质体在紫外线(20 W,30cm)下分别照射5 min和4 min灭活,灭活后混合并用PEG(体积分数30％ PEG,0.05 mol/LCaC12,0.05 mol/L甘氨酸)介导融合.在187株融合子中筛选得到27株洛伐他汀产量高于红曲霉出发菌株的融合子,其中有7株的洛伐他汀产量是出发菌的2倍以上.双灭活原生质体融合方法成功选育出红曲霉洛伐他汀高产菌株.【总页数】6页(P183-188)【作者】李桂杭;朱碧云;李浩明【作者单位】广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.不同灭活方法在原生质体融合选育米曲霉菌株中应用的研究 [J], 唐洁;车振明;李明元;罗海2.应用双亲株灭活原生质体融合法选育林可霉素高产菌株 [J], 李铁;刘瑞华3.双灭活原生质体融合构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株研究 [J], 宋安东;谢慧;王风芹;张建4.非对称灭活双亲原生质体融合法选育产果糖基转移酶的米曲霉新菌株的研究 [J], 何小妮;蒋波;王玉海;张毅;陈子健5.双亲灭活原生质体融合法选育阿维菌素高产菌株 [J], 李佳玮;张文琴;林海;徐威因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
红曲霉洛伐他汀的液态发酵及其分离纯化研究
红曲霉洛伐他汀的液态发酵及其分离纯化研究陈景智;王力超;李亮;叶秀云;林娟【摘要】通过培养基和发酵条件的优化提高红曲霉R”-30的洛伐他汀产量,并通过分离纯化制备高纯度的洛伐他汀.研究碳源、氮源、金属离子、培养基初始pH 值、接种菌龄、接种量、装液量、摇床转速以及温度等对洛伐他汀产量的影响;进一步采用硅胶柱和Sephadex LH20柱层析对发酵液中洛伐他汀进行分离纯化.结果表明,最佳培养基配方为:甘油30 g/L,黄豆粉15 g/L,ZnSO4·7H2O 6.6g/L,KH2PO4 0.17 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L;最适发酵条件为:培养基初始pH 5.0,接种龄64 h,接种量8％(体积分数),温度30℃,转速150 r/min,装液量50mL/250 mL;在此条件下发酵12d,洛伐他汀产量达615.3 mg/L,比优化前(312 mg/L)提高了97.2％;发酵液经NaOH碱提,柱层析分离纯化后,洛伐他汀纯度达93％,得率达45％.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2019(045)002【总页数】8页(P31-38)【关键词】红曲霉;洛伐他汀;培养基;发酵条件;分离纯化【作者】陈景智;王力超;李亮;叶秀云;林娟【作者单位】福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州,350116;福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州,350116;福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州,350116;福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州,350116;福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州,350116【正文语种】中文红曲，在我国已有1000多年历史，是古代食疗两用的中药材[1]，红曲中含有多种功能性成分，如红曲色素、氨基丁酸、洛伐他汀、麦角甾醇等[2]，还含有淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、酯化酶等多种酶类物质[3-5]，具有很好的研究意义。
洛伐他汀
洛伐他汀发酵培养基配方优化及15L罐放大作者:作者：吴波陈长华* 杨琳作者单位：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237 来源：医学期刊 / 药学收藏本文章【摘要】利用响应面方法对土曲霉生产洛伐他汀的培养基进行了优化，使用两水平因子实验对培养基中的碳、氮源组分：葡萄糖、豆粕、蛋白胨、麦精和硝酸钠对洛伐他汀效价的影响进行分析，发现主要的影响因素为葡萄糖和豆粕。
通过进一步中心组合实验，考察葡萄糖和豆粕浓度对菌浓、效价、残糖浓度、单位菌体产量(YP/X)和得率(YP/S)的作用。
并通过引进残糖浓度为参考，得到最优的葡萄糖和豆粕配比分别为22%和5%，结果比对照提高了17%。
同时在15L发酵罐上放大，确定最适初始葡萄糖浓度为21%，效价为7.34g/L。
【关键词】响应面设计法；洛伐他汀；土曲霉；发酵Optimization of medium components forlovastatin production and scale up in 15L bioreactorWu Bo, Chen Chang-hua and Yang Lin(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University ofScience and Technology, Shanghai 200237)ABSTRACT Response surface design method was used to optimize the medium components for lovastatin produced by Aspergillus terreus. Effects of glucose, soybean meal, peptone, malt extract and NaNO3 on lovastatin productivity were evaluated using a 2-level factorial design. Among the components investigated, glucose and soybean meal played important roles in lovastatin production. A central composite design was used to review the effects of glucose and soybean meal to concentration of biomass, lovastation, and residual glucose respectively, as well as YP/X and YP/S. The optimized concentrations of glucose and soybean meal were 22% and 5% respectively, by using residual glucose concentration as a reference, and the optimized medium resulted in a significant increase of lovastatin yield by 17%, as compared with the original one. It was concluded that the optimal concertration of glucose was about 21% and the lovastatin yield was 7.34g/L.KEY WORDS Response surface design; Lovastatin; Aspergillus terreus; Fermentation洛伐他汀(lovastatin)是第一个经FDA批准上市的降血脂他汀类药物，由于其竞争性的抑制了体内胆固醇合成的关键酶-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG)的活性，从而起到降低血液中胆固醇含量的作用。
洛伐他汀有关物质HPLC方法的优化
备液。取储备液 5 mL 置 25 mL 量瓶中， 加乙腈稀释 至刻 度， 摇 匀， 即 得 未 降 解 溶 液； 取 未 降 解 溶 液 置 4500 lx 光照强度下， 放置 8 h， 即得光降解溶液； 取 未降解溶液在 60 ħ 水浴加热 6 h， 放冷至室温， 即得 加 热降解溶液； 取储备液 5 mL 置 25 mL 量 瓶 中， 30% 双氧水 2 mL， 放置 6 h 后， 加入乙腈至刻度， 摇 ， ； 5 mL 25 mL 匀 即得氧化降解溶液 取储备液 置 量
析因设计中， 响应指标 （ Y ） 与因素 （ X ） 的关系 为： Y = β0 +
∑ i = 1 βi Xi + ∑ i = 1 ∑ j = i +1 βij Xi Xj
n
n
n
（ 1）
式中 n 是因 素 数 目 ， β0 、 βi 、 β ij 为 每 个 因 素 和 交 互 作用系数 。 经预实 验 ， 确定了 4 因素 2 水平的析
［5］ HPLC 系统， 再利用响应面法优化色谱条件 。 所
； 中国药典［3］采用 C18 色谱系统。
对化学药品中杂质的控制是目前药品质量控制 的 热 点。 按 照 质 量 源 于 设 计 （ quality by design，
*
通讯作者
Tel： （ 010 ） 67095308 ； E － mail： hucq@ nicpbp． org． cn
— 1708 —
31 （ 9 ） 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2011 ，
建立的 质 控 方 法 能 有 效 地 控 制 洛 伐 他 汀 的 有 关 物质。 1 仪器与试药 岛津 LC － 20AT 高效液相色谱仪； Waters 2695 METTLER AE240 型电子天平； 型高效液相色谱仪， Design Expert Version 8. 0. 2 软件 （ 美国 Stat － Ease， Inc． ） 。 乙腈为 色 谱 纯； 磷 酸 为 国 产 分 析 纯； 水 为 超 纯水。 洛伐他汀对照品 （ 100600 － 200502 ） 由中国药 品生物制品检定所提供； 洛伐他汀原料由浙江海正 药业有限公司和重庆大新药业有限公司提供 。 2 溶液的制备 2. 1 2. 2 2. 3 供试品溶液 精密称取样品约 20 mg， 置 50 mL 量瓶中， 用乙腈溶解并稀释至刻度， 摇匀， 即得。
HPLC法测定红曲霉发酵液中洛伐他汀含量
HPLC法测定红曲霉发酵液中洛伐他汀含量【摘要】目的建立测定红曲霉发酵液中洛伐他汀含量的方法。
方法采用HPLC法，以甲醇作溶剂、摇床振荡（150 r/min）3 h提取洛伐他汀，色谱条件：以甲醇18 mmol/L磷酸溶液（体积比为80∶20）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为237 nm。
结果洛伐他汀在5～50 μg/ mL质量浓度范围内与峰面积线性关系良好，加样平均回收率为100.75%，RSD为0.87%。
结论本方法简便有效，重复性好，可作为红曲霉相关产品的质量控制方法。
【关键词】高效液相色谱法；红曲霉；洛伐他汀Abstract:Objective To establish an HPLC method for determining the content of lovastatin in fermentation broth of Monascus. Method Lovastatin could be completely extracted from the fermentation broth by methanol under shaking for 3 h with 150 r/min. Then, samples were analyzed on the HPLC column using methanol18 mmol/L phasphate(80∶20) as mobile phase under the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 237 nm. Result The method had good linearity over the concentration of 5～50 μg/mL for lovastatin. The average recovery was 100.75% and RSD 0.87%.Conclusion The method is convenient, effective and accurate, which is suitable for the quality control of Monascus products.Key words:HPLC; Monascus; lovastatin红曲霉的应用在我国已有近两千年的历史，红曲霉的早期研究主要集中在其所产的红曲色素和各种酶类，如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶等，因此早期红曲霉主要用于食品着色、酿酒、食品发酵等［1,2］。
土曲霉洛伐他汀合成调控基因lovE的克隆与表达
土曲霉洛伐他汀合成调控基因lovE的克隆与表达朱碧云;黄欣;刘宝意;李浩明【摘要】Objective To acquire lovastatin synthesis regulatory genes lovE , recombinant lovE protein , and to study its biological functions. Methods The recombinant expression plasmid was constructed by using prokaryotic pET21b( + ) vector,which was inducible expression by IPTC in E. Coli. Recombinant protein was purified by chromatography under denatured conditions. Results Recombinant plasmid pET-lovE was constructed. 6 × His-lovE fusion protein was obtained through prokaryotic expression and affinity chromatography ,its purity was more than 90％ . Conclusions lovE protein was expressed and purified , and this work provides a basis for further study.%目的克隆表达土曲霉洛伐他汀合成调控基因lovE,为研究lovE蛋白的生物学功能奠定基础.方法利用原核表达载体pET21b(+)构建lovE原核表达质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白.结果构建了pET-lovE原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得6×His-lovE融合蛋白,蛋白纯度在90%以上.结论原核表达可获得lovE蛋白,为lovE蛋白的生物学功能研究奠定了基础.【期刊名称】《广东药学院学报》【年(卷),期】2011(027)001【总页数】4页(P77-80)【关键词】土曲霉;洛伐他汀;调控基因;亲和层析【作者】朱碧云;黄欣;刘宝意;李浩明【作者单位】广东药学院,生命科学与生物制药学院,广东,广州,510006;广东药学院,生命科学与生物制药学院,广东,广州,510006;广东药学院,生命科学与生物制药学院,广东,广州,510006;广东药学院,生命科学与生物制药学院,广东,广州,510006【正文语种】中文【中图分类】Q786洛伐他汀(lovastatin,也称mevinolin、monacolin K)是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,是治疗高胆固醇血症的首选药物,它能阻止动脉硬化发展,减少心肌梗死等危险[1-3]。
洛伐他汀增强人内皮型一氧化氮合酶mRNA稳定性的分子信号机制
洛伐他汀增强人内皮型一氧化氮合酶mRNA稳定性的分子信
号机制
宋国华;秦树存;Jae Won Choi
【期刊名称】《中国动脉硬化杂志》
【年(卷),期】2009(0)7
【总页数】1页(P618-618)
【关键词】洛伐他汀;内皮型一氧化氮舍酶;mRNA稳定性;分子信号机制
【作者】宋国华;秦树存;Jae Won Choi
【作者单位】泰山医学院;韩国延世大学
【正文语种】中文
【中图分类】R543.2;R749.16
【相关文献】
1.血流切应力调控内皮型一氧化氮合酶的分子机制 [J], 马双陶;陈卫军
2.内皮型一氧化氮合酶脱偶联分子机制 [J], 王妍琦
3.低氧对人脐静脉内皮细胞一氧化氮和内皮素-1的生成及诱导型一氧化氮合酶mRNA表达的影响 [J], 胡晓兰;林树新;于代华;张世范
4.黑素瘤细胞中诱导型一氧化氮合酶信号调控机制及其促淋巴内皮细胞增殖 [J], 赵伟;赵斌;原杰;王智权;赵轶波;陆向东;王永峰
5.实时荧光定量PCR检测高压氧对实验兔血管内皮素-1及内皮型一氧化氮合酶mRNA表达的影响 [J], 范祯祯;刘志艳;蔡宏斌;梁成;赵翀翀;张旭东;张翠杰;张兰芳;葛朝明
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【基础医学】M onascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的PCR 分析高 蓝(广东药学院生物化学教研室,广东广州510006)摘要:目的分析M onascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的结构。
方法用3对以土曲霉洛伐他汀合成酶基因为基础设计的PCR 引物对红曲霉基因组进行了PCR 分析,其中一对引物序列为,正向:5’TTC G AT GCG GCC TTC TTC AAT3’和反向5’ATG GTT CGG CAT CGT AAT TCC 3’。
结果在红曲霉基因组中相当于土曲霉洛伐他汀合成酶基因的LNKS 区域扩增出了745bp 的核酸片段,其序列与土曲霉合成酶的这一区域序列相同。
结论土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因存在同源区域。
关键词:红曲霉平;土曲霉;洛伐他汀合成酶合成酶;PCR 中图分类号:Q 814 文献标识码:A 文章编号:1006-8783(2006)01-0082-03基金项目:广东药学院2004年立项课题作者简介:高蓝(1964-),女,副研究员,从事生化与分子生物学研究工作。
PCR ana lyses of M onascus ruber 5031m onacoli n K b i osyn thetic gene clusterG AO Lan (Section of B ioche m istry,Guangdong College of Phar m acy,Guangzhou 510006,China )Abstract:O bjecti ve Analyses the structure of M onascus ruber 5031l ovastatin bi osynthesis gene cluster .M ethods Three pairs of degenerate PCR p ri m ers were designed matching the regi ons of l ovastatin bi osynthesis gene cluster in Aspergillus terreus ,one of the m is,5’p ri m er:TT C G AT GCG GCC TTC TT C AAT,3’p ri m er:ATG GTT CGG CAT CGT AAT TCC .Results A 745bp DNA sequence was a mp lified by PCR fr om M onascus ruber 5031genom ic DNA and the sequence is the same with Aspergillus terreus l ovastatin bi osynthesis gene .Conclusi on There is si m ilar sequence within the l ovastatin bi osynthesis gene cluster of Aspergillus terreus and M onascus Ruber .Key words:M onascus ruber ;Aspergillus terreus ;l ovastatin bi osynthesis gene cluster;PCR 红曲霉(M onascus ruber )中产生的莫那可林K (monacolin K )即洛伐他汀(l ovastatin ),是胆固醇生物合成中的关键酶HMG 2CoA 还原酶的竞争性抑制剂,是目前治疗高血脂症最有效的药物之一,并且对心绞痛患者和心肌梗死患者也有一定的治疗效果[1]。
此外,它还可下调炎症相关转录因子的表达,从而有益于治疗动脉粥样硬化症[2]。
近期研究表明,它可促进恶性甲状腺细胞凋亡[3],具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能[4]。
对参与洛伐他汀生物合成的聚酮合成酶的研究主要在土曲霉中进行[5-7],土曲霉也是目前工业化生产洛伐他汀的主要菌种。
Reeves 和Vederas 等研究了土曲霉(Aspergillus terreus )洛伐他汀的PKS 基因结构,序列分析发现在克隆的64kb DNA 中有18个开放读框(ORF ),经序列对比分析确定了13个ORF 的功能。
其基因簇可分为洛伐他汀结构中九酮部分的合成酶基因(即LN KS )和二酮部分的合成酶基因(即LDKS ),LNKS 也称为lov B,而LDKS 含有的功能域有:lov C (烯酯酰还原酶)、lov D (转脂酶)、ORF 8(H MG 2CoA 还原酶)、lov E (调节蛋白)、lov F (聚酮合成酶)、ORF 13(调节蛋白)及细胞色素P450加单氧酶等。
红曲霉中与合成洛伐他汀相关基因的结构的研究则较少,Chen 等[8]于2005年8月发往Genebank 的丛毛红曲霉的莫那可林K 合成酶基因簇是第一个被发现的红曲霉合成洛伐他汀相关酶的基因簇。
由于红曲霉中可产生洛伐他汀及多种有生理活性的物质,它又是传统的食品添加剂,所以通过分析研究红曲霉中洛伐他汀合成相关基因将有利于更好地开发利用红曲霉。
本文分别以土曲霉的LN KS 基因的KS 区域(位于lov B 基因区域内)、土曲LD KS 基因簇中的lov C (烯酯酰还原酶功能域)及lov E (调控蛋白功能域)基因为靶标设计了3对PCR 引物,以这3组引物对产洛伐他汀的红色红曲霉菌的基因组DNA 进行了PCR 分析。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和培养基红曲菌种:中国工业微生物菌种保藏中心红色红曲霉M onascus ruber 5031。
斜面培养基:取50g 大米,洗净加水800mL,煮成稀粥,冷却到60～65℃。
将150g 麦芽粉掺入大米粥中搅拌均匀,放入55～60℃保温箱内糖化4h,取出过滤。
取250mL 加250mL 水,加2%的琼脂,装瓶、灭菌。
菌丝生长培养基:以上培养基不加琼脂。
1.1.2 仪器与试剂28第22卷第1期广 东 药 学 院 学 报Vol .22No .12006年2月JOURNAL OF G UANG DONG COLLEGE OF PHAR MACY Feb .2006日立高速冷冻离心机。
Monacolin K标准品,购自Sig ma公司。
PCR引物由上海生工合成。
Taq酶采用上海生工的Taq Plus。
上海生工的胶回收试剂盒UN I Q -10。
TaKaRa公司的pMD-18T克隆载体。
1.2 方法1.2.1 培养方法 用2mL无菌水冲洗孢子,接入固体斜面培养。
固体斜面培养7d后,以5mL水洗下,稀释至浓度为107个/mL,取2mL加入100mL菌丝生长培养基,培养温度28℃,转速150r/m in。
培养4d。
1.2.2 红曲基因组DNA的提取 根据文献[9]的方法改进而成。
取1g菌丝,液氮中磨成粉状,加入5mL 2×CT AB缓冲液[100mmol/L tris Cl(pH8.0),20 mmol/L EDT A,1.4mol/L NaCl,2%(ρ)CT AB,2%(ρ)β2巯基乙醇],58℃1h,冷至室温后加入等体积氯仿2异戊醇(24∶1)抽提,10000g离心10m in,取上清,加入0.1倍体积10%CT AB20.7mol/L NaCl溶液,温和摇动,再加入等体积氯仿2异戊醇(24∶1)抽提,10000g 离心10m in,取上清,加入2/3体积预冷异丙醇沉淀DNA,1000g离心15m in,沉淀溶于100μL TE中,加入RnaseA至终质量浓度100μg/mL,37℃作用2h,加入等体积酚2氯仿(1∶1)抽提,10000g离心10m in,上清中加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA,沉淀用70%乙醇洗1遍,风干,溶于TE,4℃保存。
1.2.3 PCR引物的设计 3对PCR引物的设计详见表1。
表1 PCR引物的设计Tab.1 Pr i m er design引物组号引物序列(5’-3’)基因预期产物第1组5’TT C G AT G CG G CC TT C TT C AAT3’5’ATG GTT CGG C AT CGT AAT T CC3’lov B745bp第2组5’ATG GG C G AC C AG CC A TT C ATT CC3’5’TT A CGG CCC CT C G AG CCGAAC C A3’lov C1253bp第3组5’ATG G CT G C A G AT C AA GGT AT A T3’5’T C A TGG AGG AAT ATT GTT G AG G3’lov E1512bp 第1组引物是参照Thomas等[10]针对土曲霉的lov B基因的KS功能域序列设计的引物设计的。
1.2.4 PCR反应 ①反应体系:200μmol/L dNTPs,1 U Taq酶,2.625mmol/L MgCl2,2μmol/L MgS O4,10mmol/L KCl,10mmol/L(NH4)2S O4,20mmol/LTris HCl(pH8.75),0.1%Tritonx2100,0.1mg/mL BS A,模板40ng(基因组DNA和cDNA),引物60ng,总反应体积20μL。
②热循环条件:94℃预变性5m in,之后以94℃1m in,50℃1m in,72℃2m in程序45个循环,延伸72℃10m in。
1.2.5 lov B扩增片段的克隆与测序 回收及克隆红曲的lov B引物扩增产物中约750bp的片段,其中连接反应液成分为p MD218T载体1μL,PCR产物4.5μL,含T4连接酶和连接酶缓冲液的soluti onⅠ5μL,在16℃连接2h。
大肠杆菌DH5α感受态的制备及转化均按分子克隆指南方法操作。
克隆的片段交由TaRaKa 公司完成测序。
2 结果2.1 以基因组DNA进行扩增反应的结果,见图1。
M为DNA分子量Marker(2kb,1.8kb,1.6kb,1.4kb,1.2kb,1kb,800bp,600bp,400bp,200bp)A第1组引物对lov B的扩增结果;B第2组引物对lov C扩增的结果;C第3组引物对lov E的扩增结果图1 三组引物对红曲基因组D NA的扩增结果F i g.1 PCR am plif i ca tion obta i ned w ith genom ic tem pla te D NAfrom M onascus rubber5031图1表明第1组引物对lov B的扩增得到了预期的产物(745bp),而第2组和第3组引物对lov C和lov E 的扩增均未得到预计的产物。