牛瘤胃液中链球菌的分离与鉴定

万方数据

・４６・生理生化中国畜牧兽医２００９年第３６卷第５期

１．３．１瘤胃液的采集用导胃管从健康奶牛导出瘤胃液，装入无菌烧瓶中，密封，３７℃保温，立即送入实验室。用４层滤网（１８０目）过滤后通５ｍｉｎＣＯ：，使之饱和，４℃３００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去除饲料颗粒、纤毛虫等。吸取上清用埃氏巨型球菌营养液冲洗２次，每次４℃，２３００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。将瘤胃菌液收集入１５０ｍＩ。营养液的三角烧瓶中，于３７℃的温箱内厌氧环境培养４８ｈ进行增菌（李涤生等，１９８３）。

１．３．２细菌的分离培养和形态学及生化反应鉴定将配制好的厌氧血琼脂放置在无菌操作台上，用无菌枪头吸取摇匀的瘤胃液５０肛Ｌ，用涂布棒涂匀，放人厌氧培养罐内，加入厌氧产气袋，密闭，置于３７℃进行厌氧培养，经过反复分离纯培养从培养基上得到单菌落接种于专性厌氧液体培养基内，同样培养４８ｈ，根据其生物学性状、染色特点、生化反应进行初步鉴定（Ｂｕｃｈａｎａｎ等，１９８４）。

１．３．３细菌的分子生物学鉴定

１．３．３．１染色体基因组ＤＮＡ提取取对数生长的液体培养基内的菌液２ｍＬ，用细菌基因组ＤＮＡ小量制备试剂盒提取细菌ＤＮＡ。操作按照小量细菌基因组ＤＮＡ制备试剂盒操作说明书进行（奥斯伯等，１９９８；萨姆布鲁克等，２００２）。

１．３．３．２ＰＣＲ扩增以提取的细菌染色体基因组为模板，根据ＧｅｎＢａｎｋ中埃氏巨型球菌（ＡＹｌ９６９１９）的１６ＳｒＲＮＡ序列，设计、合成如下的引物序列：上游引物Ｐ１：５’一ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴ—ＧＧ一３’；下游引物Ｐ２：５’一ＧＧＡＣＴＡＣＴＡＧＧＧ—ＴＡＴＣＴＡＡＴ一３７，ＰＣＲ预计扩增目的片段大小为８０５ｂｐ。ＰＣＲ反应体系为２５弘Ｌ，灭菌三蒸水１７．３ｐＬ，Ｐ１、Ｐ２引物各１弘Ｌ，基因组模板１耻Ｌ，１０×Ｔａｑ—ｂｕｆｆｅｒ２．５肛Ｌ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２／－ｔＬ，ＥｘＴａｑ酶０．２弘Ｌ。扩增条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ，３３℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０次循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。

１．３．３．３扩增产物电泳分析、回收取ＰＣＲ扩增产物在１％琼脂糖凝胶用６０Ｖ电泳１５ｍｉｎ，紫外灯下观察电泳结果，对于目的片段用凝胶回收试剂盒回收。

１．３．３．４ＰＣＲ产物的连接和转化将回收的ＰＣＲ产物与ｐＭＤｌ８一Ｔ载体连接，１６℃连接过夜。将连接产物与大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞轻轻混匀，在冰水中放置４５ｍｉｎ后，４２℃热激２ｍｉｎ，冰浴５ｍｉｎ，加入２００ｌｕＬ无菌ＬＢ培养基，混匀后３７℃摇床培养１ｈ．然后将菌液均匀涂布在含Ａｍｐ的ＬＢ琼脂平板上，３７℃倒置培养１２～１６ｈ。在含Ａｍｐ的ＬＢ平板上挑取单个菌落接种到５ｍＬ的ＬＢ液体培养基（含Ａｍｐ的量）上，在３７℃恒温震荡培养１２～１６ｈ。

１．３．３．５重组质粒的扩增与测序用质粒ＤＮＡ小剂量纯化试剂盒提取重组质粒，电泳观察提取结果。ＰＣＲ扩增重组质粒，电泳观察并送到ＴａＫａＰａ公司测序，由ＤＮＡｓｉｓ软件分析测序结果。根据测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ上利用ＢＬＡＳＴ进行序列的同源性分析。

２试验结果

２．１细菌的形态和培养特性在厌氧血琼脂培养基上，菌落呈紫红色，菌落边缘圆润光滑、凸起，直径０．５～ｌＩｔｌｍ，专性厌氧液体培养物中细菌以长链为主。由图１可见，目的菌株革兰氏染色为阳性，细菌常以单个或成对存在、短链状。１０℃环境下，６．５％ＮａＣｌ培养液和ｐＨ为９．６或０．１％的美兰牛奶中均不生长；在４０％胆汁培养基中生长；４５℃环境下生长，耐热，６０℃３０ｍｉｎ仍具有活性。

图ｌ链球菌形态学观察结果

２．２细茵的生化鉴定由表１可知，目的菌能发酵葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、柳醇、棉籽糖，但不能发酵鼠李糖、蕈糖和菊糖；能水解淀粉．能发酵甘露醇，不能发酵山梨醇、赤藓醇、肌醇、侧金盏花醇、苦杏ｆ＿：苷、水杨苷、七叶苷、尿素、靛基质，不能液化明胶，能从硝酸盐生成亚硝酸盐，胆

汁能刺激其生长。

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中国畜牧兽医２００９年第３６卷第５期生理生化・４７・结果＋————一—－一

２．３ＰＣＲ扩增结果由图２可知，扩增片段大小在８０５ｂｐ左右，是所需要片段。

２．４１６ＳｒＲＮＡ序列测定结果牛链球菌１６ＳｒＲＮＡ基因的测序结果已提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库，其登录的序列号为曲ＩＡＦｌ０４１０９．１ＡＦｌ０４１０９。本试验得到的序列经ＢＬＡＳＴ对ＧｅｎｅＢａｎｋ数据库进行同源性分析。与已报道的牛链球菌１６ＳｒＲＮＡ基因序列相比，其同源性达９９％，因此可以鉴定为牛链球菌。

图２链球菌的ＰＣＲ扩增结果

注：１为ＤＬ一２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２、３为菌株ＰＣＲ扩增结果。

３讨论

牛链球菌是革兰氏阳性链球菌属的一种，主要存在于反刍动物的瘤胃内，是参与瘤胃发酵的重要瘤胃微生物之一，对反刍动物乳酸的生成起重要作用。它可以将谷类饲料（主要富含碳水化合物）迅速发酵Ｄ－￥Ｌ酸和Ｌ－乳酸。其中不易被代谢的Ｄ乳酸是引发代谢性酸中毒主要物质；而Ｌ－￥Ｌ酸一方面可以很快被代谢不会造成酸中毒，另一方面其及其聚合物还是工业生产重要的原料之一。

随着奶牛业的快速发展，瘤胃酸中毒在奶牛饲养中影响越来越明显，瘤胃酸中毒发生时，导致奶牛生长速度下降和饲料转化率降低，从而引起奶牛产奶量、乳脂率和体重下降等。瘤胃低ｐＨ和较高乳酸浓度持续数月甚至数年，还可导致瘤胃炎、瘤胃角质化、蹄叶炎、腹泻、瘤胃血管血栓、脑灰质软化症、突然死亡综合征等（Ｂｕｃｈａｎａｎ等，１９８４）。此外，由于近年来利用微生物生产高纯度的Ｌ＿乳酸成为国际的研究热点，但是自然界中能生产Ｌ一乳酸的微生物极少。随着基因工程的飞速发展和广泛应用，利用基因工程的方法构建Ｌ厂乳酸高产菌株成为人们研究的焦点。天然的大肠杆菌没有Ｌ一乳酸脱氢酶，没有Ｌ一乳酸产生。许多研究人员将表达牛链球菌Ｌ一乳酸脱氢酶基因的质粒转化到大肠杆菌菌株中，期望在大肠杆菌中建立新的Ｌ－乳酸代谢途径（张黎等，２００５）。为此，分离筛选出对乳酸生成具有重要意义的菌株一牛链球菌，并通过生物化学手段将其改造成Ｄ－￥Ｌ酸生成关键酶基因缺失Ｔ程菌，从而减弱其生成胁乳酸的能力，对纠正或缓解奶牛乳酸酸中毒具有重要意义；并且可以通过基因工程方法将牛链球菌的Ｌ一乳酸脱氢酶基因转入其它菌株中，转化葡萄糖生产Ｌ一乳酸，从而对生产高纯度的Ｌ－￥Ｌ酸产生深远的影响。

本试验在对目的菌进行体外培养过程中，选用了专性厌氧细菌培养基一ＶＳ厌氧血琼脂培养基作为分离和纯培养的特异性固体培养基，并加入了能够刺激目的菌生长的吐温一８０（于鸿玲等。２００６），这些改进增加了培养基对目的菌的选择性。牛链球菌的生物学性状表现为菌落呈紫红色，菌落边缘圆润光滑，凸起，兼性厌氧，再结合生化特性观察结果，可以初步判定牛链球菌。

以往对微生物的认识基于对微生物的培养和纯种分离技术，而在自然环境中的微生物９２％～９８％的种类至今尚是不可培养的，成为正确认识微生物生态系的严重障碍。分子生态技术的应用克服了培养技术的限制，对样品进行客观的分析，更精确地揭示微生物种类和遗传的多样性。随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展．微生物核糖体数据库的日益完善，１６ＳｒＲＮＡ序列分析作为微生物系统分类的主要依据已得到了广泛认同，该技术已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具（周煜，１９９９）。该技术利用微生物遗传信息中小亚基单位核糖体ＲＮＡ的１６ＳｒＲＮＡ的遗传保守性和其大小最适合

进行分析的特点（于鸿玲等，２００６），从微生物样本中万方数据