牛瘤胃液中链球菌的分离与鉴定
牛瘤胃液中链球菌的分离与鉴定
牛瘤胃液中链球菌的分离与鉴定
苑学;邢欣;龙淼;逄晓阳;刘国文;孙国权;王哲
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2009(036)005
【摘要】在牛瘤胃中,牛链球菌的数量和发酵类型直接影响瘤胃的正常生理活动,同时牛链球菌发酵产生的乳酸和其内存在的各种酶在实际的工业生产中具有重要的价值.本试验从新采集的牛瘤胃液中分离得到菌株,用微量生化反应管和16SrRNA技术分别对菌株的生化及遗传特性进行鉴定,结合革兰氏染色和形态学观察结果判定所分离的菌株即为牛链球菌,为更好地研究和改造该菌奠定了理论和试验基础.【总页数】4页(P45-48)
【作者】苑学;邢欣;龙淼;逄晓阳;刘国文;孙国权;王哲
【作者单位】吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;内蒙古民族大学动物科技学院,通辽,028042;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;吉林省产品质量监督检验院,长春,130022;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;内蒙古民族大学动物科技学院,通辽,028042;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062
【正文语种】中文
【中图分类】S852.61+1
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1.牛化脓性链球菌的分离与鉴定 [J], 邱立;李罡
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3.牛链球菌Ⅰ型的分离与鉴定 [J], 马勋;齐亚银;柳旭伟
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奶牛瘤胃中一株纤维分解菌的筛选与鉴定
奶牛瘤胃中一株纤维分解菌的筛选与鉴定王兴文;李发弟;赵圣国;王加启;卜登攀【摘要】试验从奶牛瘤胃中分离得到1株纤维分解菌,研究其生化性质和种属分类。
将富集的纤维分解菌群,通过厌氧平板分离培养得到纤维分解菌。
利用全自动微生物分析系统的革兰氏阴性菌鉴定卡鉴定纤维分解菌的生化图谱,并对菌株16S rDNA 进行 PCR 扩增并测序,与 GenBank 数据库中序列进行同源性比对,确定其种属分类地位。
结果表明：通过体外培养,分离得到纤维分解菌 CB11,纤维分解平均消失率达82%,革兰氏染色为阴性,绝对厌氧,能够产生β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶等。
通过建立系统发育树,CB11的16S rDNA 序列与解肝素拟杆菌的相似度达99%。
%A cellulolytic bacteria strain from the rumen of dairy cows was identified and its biochemistry characteristics and phylogenetic position was analyzed.The cellulolytic bacteria was isolated from the ru-men of Holstein dairy cows based on enrichment culture under anaerobic conditions.The biochemical char-acterization was analyzed by VITEK2 compact system.The 1 6S rDNA was sequenced and used for phylo-genic tree building.The results showed that the average fade rate of substrate was 82%.The bacteria was named CB1 1,strictly anaerobic and gram-staining-negative.CB1 1 produced β-galactosidases,β-glucosidases andβ-xylanases.The sequence of 1 6S rDNA of CB1 1 had a high identity to Bacteroides heparinolyticus (99%).【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】6页(P1-5,15)【关键词】奶牛;瘤胃;纤维分解菌;生化性质;种属分类【作者】王兴文;李发弟;赵圣国;王加启;卜登攀【作者单位】甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070; 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193;甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193;甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070; 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193;甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070; 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193【正文语种】中文【中图分类】S823.9+1我国秸秆资源极为丰富，每年农作物秸秆的产量达5.7×108 kg［1］，利用秸秆作为粗饲料能很大程度上缓解饲草资源短缺的问题.但是秸秆含有大量的细胞壁成分，利用率极低，目前仅有10%的秸秆用作饲料［2］，提高秸秆纤维的利用率对我国畜牧业发展具有重要意义.由于反刍动物瘤胃内微生物可以对饲料纤维进行很好的消化，所以国内外的科学家都将目光聚焦到瘤胃高纤维分解率微生物的分离上.由于瘤胃中微生物大部分为严格厌氧微生物，分离条件十分苛刻，所以关于反刍动物瘤胃分离纤维分解菌研究的相关报道较少.程超等［3］以滤纸为唯一碳源从绵羊瘤胃内分离到白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、拟杆菌和纤维二糖菌.李昊［4］分离得到9株纤维素分解能力强的纤维素分解菌.曹阳春等［5］采用Hungate滚管法，从白绒山羊的瘤胃中筛选出一株高效纤维素酶的厌氧真菌.Sijpelstejin首次分离到黄色瘤胃菌，Hungate首次分离得到白色瘤胃球菌，并提出了Hungate滚管法分离厌氧微生物［6］，为厌氧微生物的分离奠定了基础.Thet等［7］从瘤胃中分离出了6个门类的纤维分解菌.但是上述试验分离所用的底物都不是秸秆纤维，大多以滤纸为底物.若以秸秆纤维为直接碳源，可能会分离出不同的纤维分解菌.鉴于此，本试验以秸秆中性洗涤纤维为唯一碳源，通过体外厌氧培养分离荷斯坦奶牛瘤胃纤维分解菌，并利用16SrDNA测序、形态和生化性质对纤维分解菌进行了初步鉴定.1 材料与方法1.1 瘤胃微生物的采集瘤胃微生物样品采自装有瘘管的荷斯坦奶牛（北京市顺义区中地种畜良种科技园）.试验当天晨饲前，采集瘤胃液样品，用四层纱布过滤，滤液放入干冰中并迅速带回实验室，－80℃保存.1.2 培养基的制备1.2.1 秸秆中性洗涤纤维的制备将秸秆粉碎后，加入到纤维袋中，在中性洗涤液中保持微沸2h，用热水洗至无中性洗涤溶液为止（水清后，再洗5次），在烘箱中65℃烘干，拆开纤维袋，得到秸秆中性洗涤纤维.1.2.2 培养基配制在 Hungate管中加入0.04g秸秆中性洗涤纤维，以表1中分离液体培养基配方（除秸杆中性洗涤纤维不加）配制厌氧培养基［8］.在厌氧手套箱中将配好的厌氧培养基加到已装有秸秆中性洗涤纤维的Hungate管中，每管10mL，灭菌，4℃保存备用.表1 纤维分解菌培养基组分Tab.1 The substrate components of cellulolytic bacteria?瘤胃液：取瘤胃液12 000r／min离心两次，取上层瘤胃液.溶液2：K2HPO46.0g加水定容到1L，灭菌.溶液3：CaCl2·2H2O 1.6g；KH2PO46g；NaCl 12.0g；（NH4）2SO46.0g；MgSO4·7H2O 2.5g，加蒸馏水定容到1L，灭菌.1.3 纤维分解菌接种、富集和筛选吸取200μL原始菌液接种到含有厌氧培养基的Hungate管中，避光39℃恒温培养箱中孵育48h作为第1代.吸取100μL第1代菌液接种到新的Hungate管中，避光39℃孵育48h作为第2代.传代富集一直到第14代.在厌氧手套箱中，取传至第14代的菌液100μL于灭菌的离心管内，稀释至10－5、10－6和10－7，将稀释后的菌液100μL涂布于培养基平板，39℃厌氧培养48h，挑取单菌落划线培养，挑取单菌落，将单菌落转移到含有纤维二糖和木糖的液体营养培养基中，富集培养24h后，作为待测菌液.1.4 菌株16SrDNA的扩增测序及分析取2mL待测的菌液，用CTAB结合珠磨法［9］提取基因组DNA.以菌株DNA为模板，以27f：5′－AGAGTT TGATCCTGGCTCAG－3′和 1 492r：5′－GGTTACCTTGTTACG ACTT－3′为引物进行16S rDNA的扩增［10］.对扩增产物进行测序，测序结果与GenBank数据库中序列进行同源性比对.并从数据库中选择近缘菌株的基因序列，利用MEGA 5软件中的邻接法构建系统发育树.1.5 菌株的形态学及生化性质的鉴定取适量该菌种在厌氧条件下涂布平板39℃厌氧培养.用棉签挑取菌落到已加入3mL 0.45%的NaCl溶液的聚苯乙烯试管中搅匀，经DensiCHEK Plus比浊仪测量微生物悬浮液的光密度分别为1.5×108～1.89×108 和8.1×108～9.9×108 cfu／mL，将卡片按顺序放在载卡架上，输样管插入到菌液管中，置入全自动微生物分析系统（VITEK2Compact system）上机经革兰氏阴性菌鉴定卡培养18～24h，测定纤维分解菌生化图谱［11］.1.6 厌氧性鉴定取适量该菌种在厌氧条件下涂布2个平板，2个平板分别厌氧和有氧条件下生长，通过比较生长状况来确定该菌的厌氧性.1.7 底物消失率取14个尼龙袋105℃烘干至恒质量，称量.取1～14代的发酵液用尼龙袋过滤后，将尼龙袋和残渣在105℃烘箱内烘干至恒质量，称量.用以下公式计算底物消失率：2 结果与分析2.1 形态特征与生化鉴定结果2.1.1 形态学特征平板上共得到44个菌落，通过16SrDNA序列测定，发现其中1个为单菌落，命名为纤维分解菌CB11.该菌株革兰氏染色为阴性，绝对厌氧.在平板培养基上菌落乳白色，边缘光滑、圆润、凸起、不透明.2.1.2 生化鉴定CB11的革兰氏阴性菌的生化图谱如表2.革兰氏阴性菌鉴定卡显示，CB11可以产生α－丙氨酸－苯丙氨酸－脯氨酸芳胺酶、β－半乳糖苷酶、β－N－乙酰葡萄糖氨酶、β－葡萄糖苷酶、β－木糖苷酶、N－乙酰－β－半乳糖胺酶，可以分解琥珀酸盐产碱.表2 CB11的生化特征Tab.2 Biochemical characteristics of strain CB11＋：阳性；－：阴性.?2.2 16SrDNA系统发育学分析将该菌16SrDNA所测得的基因序列与Gen－Bank数据库中其他菌种进行Blastn 比对分析，发现与解肝素拟杆菌的序列相似度最高为99%.16S rDNA的系统发育树分析如图1，CB11与解肝素拟杆菌SEQ209的亲缘关系最近.图1 CB11菌株16SrDNA系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on16SrDNA sequence of strain CB112.3 秸秆纤维消失率饲料消失率的结果如图2所示，第1代纤维消失率为47.5%，较低的消失率可能是由于新的培养基条件，该菌还未适应.而在2～14代，该菌已经适应了培养条件，平均消失率达82%.图2 富集发酵液1～14代饲料消失率Fig.2 The fade rate of fiber with different generations3 讨论与结论瘤胃中的纤维素和半纤维素分解菌能够将植物纤维分解成为小分子的糖和挥发性脂肪酸，它们作为瘤胃中其他细菌和反刍动物的能量物质.所以很多研究通过培养和未培养技术来研究瘤胃中的纤维分解菌.由于纤维分解菌具有纤维分解能力［12］，可以通过纤维作为唯一的碳源底物分离培养瘤胃中的纤维分解菌.很多试验通过纯培养技术发现了多种纤维分解菌并揭示了他们的性质.瘤胃厚壁菌门的细菌是瘤胃中主要的纤维分解菌［13－15］，其中重要的纤维分解菌为产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌［16－18］.丁酸弧菌属和假丁酸弧菌属是瘤胃中主要的木聚糖分解菌［16］.也有研究发现一些梭菌、普雷沃氏菌和真细菌也具有纤维分解活性［16－17］.本试验发现的这株纤维分解菌属于拟杆菌属，通过Blastn比对和系统发育树分析发现，该菌与解肝素拟杆菌（Bacteroides heparinolyticus）相似度达99%，命名为CB11，通过生化图谱发现CB11可以具有β－葡萄糖苷酶、β－半乳糖苷酶和β－木糖苷酶活性等.β－葡萄糖苷酶不仅具有纤维素的糖化作用，而且与萜烯类香气前驱体有密切关系［19］.β－半乳糖苷酶能将乳糖水解成为半乳糖与葡萄糖，也具有半乳糖苷的转移作用［20］.β－木糖苷酶在完全快速降解木聚糖类半纤维素为木糖的过程中起重要作用［21］.这些酶都与多糖的代谢相关.这说明得到的这株纤维分解菌具有多糖分解活性，秸秆的消失率可以达到82%，有较高的纤维分解活性.Thet等［7］分离得到129株纤维分解菌，有9株为产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌.丁酸弧菌、假丁酸弧菌和毛螺菌科的一些细菌不仅具有木聚糖活性，还可以分解羟甲基纤维素和滤纸.一些梭菌、普雷沃氏菌、厌氧弧菌、密螺旋体菌、链球菌和拟杆菌也具有纤维分解活性，但是它们在瘤胃中的活性和对瘤胃纤维分解的作用还需要进一步的研究.拟杆菌是一类严格厌氧的的革兰氏阴性菌，在人、猪、牛、羊、兔、鸡、麻鸭、鲤鱼体内经过检测都为优势菌群［22］，这种优势菌通过自身的定植直接抑制其他有害菌群的黏附，而且在菌群失调时重新引入拟杆菌，可以尽快使宿主肠道内微生态体系恢复平衡状态.人体内拟杆菌已经作为研究肠道微生物对肠道基因表达影响的模式生物［23］.Xu等［24］通过全基因组测序研究人肠道中的一株拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）发现该菌可以生成a－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷酶、α－葡萄糖苷酶、β－葡萄糖苷酶、β－葡萄糖醛酸酶、β－呋喃果糖苷酶、α－甘露糖苷酶、淀粉酶和内－1，2－β－木糖酶以及其他14种酶，这些酶都与多糖的分解有关.Fredrik的研究也发现拟杆菌体内含有172种糖基水解酶［25］，由此可知，拟杆菌是帮助宿主有效利用食物多糖的至关重要的常驻菌.国内外对解肝素拟杆菌的研究还很少，Katsuji等［26］最早在牙周炎患者的牙龈下发现了解肝素拟杆菌，通过验证解肝素拟杆菌除了可以分解肝素之外，还可以分解粘多糖. 本研究通过厌氧富集的方法从奶牛瘤胃液中分离得到1株纤维分解菌，基于其形态、生化和系统发育学分析，鉴定为解肝素拟杆菌，这为进一步研究瘤胃中秸秆纤维的降解机制提供了素材.参考文献［1］欧阳平凯，韩祖国.木质纤维素物质水解新技术及应用［J］.化工进展，1992（1）：42－45［2］陶蕾，王曙阳，曹广益，等.复合菌剂发酵秸秆的作用及应用［J］甘肃农业大学学报，2011，46（2）：37－39［3］程超，郝永清，张林冲.瘤胃内分解纤维素细菌的分离与鉴定［J］.饲料工业，2008（19）：39－40［4］李昊.固氮菌和纤维素分解菌的分离及混合添加对瘤胃发酵的影响［D］.哈尔滨：东北农业大学动物科技学院，2013［5］曹阳春，杨红建，沈博通.高产纤维降解酶牦牛瘤胃真菌分离株的筛选和鉴定［J］中国农业大学学报2010，10（3）：70－74［6］ Hungate R E.The rumen and its microbes［M］.New York：Academic Press，1966［7］ Thet Nyonyo，Takumi Shinkai，Makoto Mitsumori.Improved culturability of cellulolytic rumen bacteria and phylogenetic diversity of culturable cellulolytic and xylanolytic bacteria newly isolated from the bovine rumen，FEMS Microbiology Ecology，DOI：10.1111／1574－6941.12318［8］ Makkar H P S，Mcsweeney C S.Methods in gut microbial ecology for ruminants［M］.Berlin：Springer Netherlands，2005：25－27［9］Bürgmann H，Pesaro M，Widmer F，et al.A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil［J］.Journal of Microbiological Methods，2001，45（1）：7－20［10］ Webster G，Newberry C J，Fry J C，et al.Assessment of bacterial community structure in the deep sub－seafloor biosphere by 16SrDNA－based techniques：a cautionary tale［J］.Journal of Microbiological Methods，2003；55（1）：155－64［11］卢玉飞，王加启，赵圣国，等.奶牛瘤胃中一株反－11－油酸氢化菌的筛选和鉴定［J］.畜牧兽医学报，2014，45（1）：69－77［12］ Flint H J，Bayer E A，Rincon M T，et al.Polysaccharide utilization by gut bacteria：potential for new insights from genomic analysis ［J］.Nature Reviews，2008（6）：121－131［13］ Koike S，Yoshitani S，Kobayashi Y，et al.Analysis of fiber－associated rumen bacterial community and PCR detection of uncultured bacteria［J］.FEMS Microbiol Lett，2003，229：23－30［14］ Larue R，Yu Z，Parisi VA，et al.Novel microbial diversity adherent to plant biomass in the 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Ecology，2009，67：183－197［19］李远华.β－葡萄糖苷酶的研究进展［J］.安徽农业大学学报，2002，29（4）：421－425［20］高秀容，马力，叶华，等.B－半乳糖苷酶的研究进展［J］.生物技术通报，2005（3）：19－21［21］薛业敏，于瑾瑾，戴军，等.热β－木糖苷酶的构建及在木糖制备中的应用［J］.中国食品学报，2007（7）：6－11［22］ Hobson P N，Stewart C S.The rumen microbial ecosystem ［M］.Springer，1997［23］何明清，倪学勤.我国动物微生态制剂研究、开发和应用动态［J］.科技视野，2002（21）：1－8［24］ Xu J，Bjursell M K，Jason H，et al.A genomic view of the human bacteroides the taiotaomicron symbiosis［J］.Science，2003，299（5615）：2074－2077［25］ Fredrik Backhed，Hao Ding，Jeffrey I Gordon，et al.The gut microbiota as an environmental facter that regulates fat storage［J］.PANA 2004，101（44）：15718－23［26］ Okuda K，Kato T，Shiozu J，et al.Bacteroides hepurinolyticus sp.nov［J］.Isolated from Humans with Periodontitis，1985，35（4）：438－442。
牛链球菌在瘤胃中产酸的代谢机制及调控
牛链球菌在瘤胃中产酸的代谢机制及调控陈连民;沈宜钊;王洪荣【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2016(028)003【摘要】Streptococcus bovis ( S.bovis) is usually a major lactate producing bacterium in the rumen, and is recognized its’ contribution to development of rumen acidosis when ruminants are fed high concentrate diets. Previous work indicates that carbohydrate metabolism in S.bovis is mainly affected by the way of glucose trans membrane transport, and enzymes and intermediate metabolites in glycolytic pathway.In addition, the factors, environmental pH, growth stage, and control protein catabolism ( CcpA) , etc., also have significant impacts. In this paper, metabolic mechanism and influence factors of carbohydrate fermentation and acid production by S.bovis were reviewed in purpose to provide references for further insight into the mechanism of rumen acido-sis caused by lactic acids.%牛链球菌（ S．bovis）是瘤胃主要的乳酸产生菌，在饲喂高精料饲粮导致瘤胃乳酸中毒进程中扮演重要角色。
牛链球菌Ⅱ型的分离与鉴定
化氢 溶液 ２５ Ｌ于洁净 的玻 片 上 ，挑取 纯 培 养菌 混 合 于溶 液 中 ，３０ Ｓ后 观 察 结果 ，产 生 气 泡者 为 阳性 ， 不产 生气泡 为 阴性 ，以区别链 球菌 和葡萄 球菌 。 １．４．３ 生 化 鉴 定 取 纯 培 养 菌 ，用 快 速 ＩＤ３２ ＳＴＲＥＰ试 剂 盒 ，按 说 明书 进 行 操 作 ，在 ＡＴＢ细 菌 鉴 定仪 上进 行鉴定 。 １．４．４ 动物 试 验 用 ｌ２只小 鼠分 成 ４组 ，每组 ３ 只 ，分别腹 腔 接种 ３株 分 离 菌 ，每 只 接 ＴＳＢ液 体 培 养 物 ０．３ ｍＬ；第 ４组接种 ＴＳＢ无菌 培养液 ０．３ ｍＬ 为 对照组 ，观察 、记 录小 鼠发病 、死亡情 况 ，并 对死亡 小 鼠进行 剖检 、细菌 培养 ，涂 片 ，染色镜 检 。 １．４．５ 沉淀试 验 用安化 、醴 陵两株 细菌按 参考 文 献 ［３—４］方法 提取沉 淀抗 原 ；并 接种 免疫 新 西 兰小 白 兔 ，分 ３次 免疫 （０、７、１５ ｄ），第 ３次免 疫后 ２０ ｄ取兔 心血 分离 、制备 高免 血 清 ，进行 沉淀 试 验 ，检查 康 复 牛 和健康 牛血清 。 １．４．６ 药 物 敏感 试 验 用 ＡＴＢ链 球 菌 和肺 炎 球 菌药 敏试 剂条 ，按 说 明书进 行操作 和结果 判读 。 ２ 结 果 ２．１ 细菌 分离及 形 态特 征 分 别从 安 化 、醴 陵 、辰 溪病死 牛 内脏 组织 中分 离 到 ３株 细 菌 ，在鲜 血 琼脂 平 板上 培养 ２４ ｈ后 菌落 呈浅灰 色 透 明、圆形 、隆起 、 光滑 、边 缘 整 齐 、露 珠 状 小 菌 落 ，ａ溶 血 ；在 ＴＳＢ液 体 静置 培养 ２４～ ４８ ｈ，菌 液 中等 混 浊 ，管 底 有少 量 黄 白色沉 淀 ，长时 间 培养 上 层 清亮 ，菌体 沉 于管 底 。 细 菌革兰 染 色 ，显 微 镜 检 查 可 见 菌 体 为 圆形 、卵 圆 形 、单个 、双个 、偶 尔 有 ３～ ５短 链 ，液体 培 养 细菌 以 链状 排列 为主 ，可形成 数 十个细 菌的 长链 ，幼 龄培养 菌 可形成 荚膜 ，为革 兰 阳性 兼性需 氧菌 ；血片 、脾脏 、 淋 巴组织触 片 的瑞 氏染 色 ，在 显 微 镜下 可 见 淡紫 红 色 的荚膜 ，单个或 链状球 菌 。 ２．２ 过 氧化 氢酶试 验 对 ３株 分 离菌 进 行过 氧 化 氢酶试 验 ，结 果均 为 阴性 。
牛链球菌的分离鉴定及生物信息学分析
牛链球菌的分离鉴定及生物信息学分析祖菲;段纲;项勋;李浩欣;杨志远;朱旗;代飞燕;常华【摘要】本研究对某动物医院的一头病牛粪样进行细菌分离鉴定,PCR扩增细菌16S rDNA基因并测序,构建进化树,对该菌进行药敏试验分析及生长曲线的测定.结果显示,该菌在血琼脂、巧克力琼脂、LB琼脂等培养基上均能长出光滑凸起,边缘圆润,大小各异,颜色不同的菌落,而在MRS琼脂、高盐甘露醇琼脂上却不生长;生化鉴定结果显示,乳糖、麦芽糖、甘露醇等均为阴性,葡萄糖、西蒙氏柠檬酸盐、尿素均为阳性,上述结果初步鉴定此菌为牛链球菌;进化树的构建进一步证明了分离菌属于牛链球菌,其与牛链球菌RD09的同源性为99％;药敏试验结果显示,牛链球菌对强力霉素、卡那霉素极敏感,对红霉素高度敏感,对链霉素、新生霉素、复方新诺明、头孢曲松、庆大霉素均敏感,对氯霉素、头孢拉定、阿莫西林均耐药;从牛链球菌生长曲线可看出2～23 h是牛链球菌的高度繁殖期,23～28 h是稳定期,28 h以后开始衰退.本试验结果为进一步研究牛链球菌奠定基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)011【总页数】7页(P2902-2908)【关键词】牛链球菌;分离鉴定;16S rDNA;生物信息学【作者】祖菲;段纲;项勋;李浩欣;杨志远;朱旗;代飞燕;常华【作者单位】云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,昆明650201【正文语种】中文【中图分类】S852.61牛链球菌（Streptococcus bovis）属D组链球菌，为革兰氏阳性球菌，包括7个不同的种和亚种，即马肠链球菌、解没食子酸链球菌解没食子酸亚种、解没食子酸链球菌巴氏亚种、解没食子酸链球菌马其顿亚种、婴儿链球菌婴儿亚种、婴儿链球菌结肠亚种和非解乳链球菌［1］。
牛瘤胃耐酸乳酸杆菌的分离与鉴定_龙淼
30230260) 作者简介: 龙 淼 ( 1978 ) 男, 博士。 * 通讯作者
拥有耐酸相关基因[ 5] , 使其具有耐酸性, 在较低的 pH 能够生长。而且很多文献报道[ 6 7] , 在瘤胃发生 酸中毒时( pH 小于 5. 6) , 乳酸杆菌成为瘤胃内优势 菌群, 这进一步证明瘤胃内主要的耐酸菌群是乳酸 杆菌。从瘤胃内分离出耐酸乳酸杆菌, 利用基因工 程技术、原生质体融合技术等生物技术来改造瘤胃 其它不耐酸的乳酸利用菌, 如反刍月形单胞菌、埃氏 巨型球菌等, 使其具有耐酸性, 并能够在较低的 pH 值生长继续发挥其生物学作用, 对于防治瘤胃酸中 毒和奶牛酮病具有重要理论和实践意义。
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一株牛瘤胃微生物的分离纯化及其赖氨酸合成能力的测定
国内长期 以来一直将研究的重点集中于过瘤 胃蛋 白 质保护技术上，认为只要满足到达真 胃及小肠 的非 降解蛋 白质的量就 能平衡小肠对 氨基酸 的需求 ，提 高生产性能 。但该方法有一定 的局限性。一方面， 过瘤 胃蛋 白质保护技术可能会影响瘤 胃微生物的正 常生长 ，不但减少了菌体蛋 白的产量 ，还有可能导致 瘤 胃微生 物 区系 的失 衡 ，引发 新 的问 题 ；另 一方 面 ， 到达真胃和小肠 的过瘤 胃蛋 白并不能保证可以平衡 小肠的氨基酸需求 ，反而会引起氮排出量增加 。赖 氨酸是动物所需必需氨基酸 中最为重要 的一种 ，现 已成为国际市场上发展前景最好的产品ｌｇ］。大量 的 实验研究认为牛的第一限制性氨基酸是赖氨酸 。当 赖氨酸与蛋氨酸的比例为 ３：１时，能够有效 的提高 奶牛的产奶量［１］。因此 ，满足到达小肠的赖氨酸量 ， 就能够在一定程度上解除牛体 的营养限制，提高蛋
ｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｏｆ １．２０ ｍｇ／Ｌ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ｌｙｓｉｎｅ．
ＫＥＹＷＯＲＩ￣ ：ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｕｍ ｅｎ；ｌｙｓｉｎｅ；１６ ＳｒＤＮＡ ；ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｅ ｍ ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｕｎｌｅｎ ａｎ ｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｌｙｓｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｂｉｌｉｔｙ ＦＵ Ｓｈｕａｉ ，ＴＩＡＮ Ｙｕ－ｍｉ￣ ，ＺＨ ＡＮＧ Ｌｉ－ｌｉ ，ＳＵ Ｙｕ－ｈｏｎｇ ，ＸＵ Ｙｕｎ－ｈｅ ，ＤＩＮＧ Ｈｏｎｇ－ｔａｏ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｎｚｈｏｕ Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｚｈｏｕ １２１００１，Ｃｈｉｎａ ２．Ｃｏ ｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｉｎｚｈｏｕ Ｍ ｅｄｉｃｉｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｚｈｏｕ １２１００１，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔＯ ｓｏｌｖｅ ｔｈｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｔｈａｔ ｌｙｓｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｕｍｅｎ ｃａｎ ｔ ｆｉｔ ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｌｙｓｉｎｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｔｕｍｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｊｕｉｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｆｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６ ＳｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓ ｔｈｅ ｍ ｏｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ，ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍ ｉｌａｒｉｔｙ ｉｓ ９９ ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃｏ— ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ，ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ．Ｔｈｅ ｌｙｓｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｓ ４．０１ ｍｇ／Ｌ，ｓｉｇｎｉｆｉ—
奶牛瘤胃中小韦荣球菌的分离鉴定
１０ ２ ； ３ ０ ６
［ 收稿 日期］ ０ １— ７— ３ ［ ２１ ０ ０ 文献标识码 ］ ［ Ａ 文章编号 ］０ ２—１８ ２ １ ）０ —０ １ ０ ［ １０ ２ ０（０ ２ １ ０３— ３ 中图分类号］ ８ ２６ ￥ ５ ．
［ 摘
要］ 采取健康奶牛瘤 胃液， 用小韦荣球菌特异性培养基从瘤 胃液 中初步分离小韦荣球菌， 再
奠定 基础 。
丙酸的厌氧球菌 ， 但是不发酵碳水化合物 ， 却能发
酵短链 脂 肪酸 如琥 珀 酸盐 和丙酮 酸盐 等 。 反刍动 物 的能量代 谢不 同于单 胃动物 ， 主要 靠 瘤 胃微 生 物发 酵 产 生 的 乙酸 、 酸 、 丙 丁酸 等 挥 发 性
脂肪酸供能。体 内 ９ ％的葡萄糖是 由糖异生供给 ０ 的 ， 中生糖 先质 丙酸 经肝 脏糖 异 生生 成 的葡 萄 糖 其
等 购 自 Ｓｇ 公 司 。生化 反 应 管 （ １种 ） 自杭 州 ｉ ｍａ ３ 购
小韦荣 球菌 （ ｅｌ ｅａｐ ｒ ｌ） 瘤 胃内 的一 Ｖｉｏ ｌ ａｖ ａ 是 ｌｎ ｌ ｕ 种革 兰 氏阴性菌 ， 唯一能 发酵 乳 酸盐 产 生 乙酸 和 是
微 生物 发酵产 生丙 酸 的 比例 ， 防治 围产 期奶 牛能 为
量代谢障碍性疾病开辟新 的途径。
研究 主要 是 针 对 小 韦荣 球 菌 能 利 用 乳 酸 发 酵 产生 丙 酸的特 点 ， 用瘤 胃微生 态理 论 ， 离 、 定瘤 分 鉴 胃内丙 酸生成优 势 菌一小 韦 荣球 菌 ， 为研 制 通过 调 控瘤 胃微 生 物发 酵 乳 酸 而 生 成 丙 酸 的微 生 态 制 剂
约 占 ５ ％ 一６％ 。 干物质 摄入减 少 ， ０ ０ 能量负 平衡 是
牛链球菌2型的分离与鉴定
牛链球菌2型的分离与鉴定
作者：王兰平， 谈志祥， 刘道新， 何世成， 鲁杏华， 范仲鑫
作者单位：湖南省动物疫病预防控制中心,湖南长沙 410007
1.哥登恰默士牛链球菌的感染[期刊论文]-环球赛鸽科技2006(4)
2.齐亚银.剡根强.张再清.王静梅牛源豕链球菌的某些病原生物学特性[会议论文]-2007
3.王勇牛链球菌肺脓肿一例[期刊论文]-中华传染病杂志2007,25(10)
4.王利青.何黎明.钟立强.王艳牛链球菌致慢性腹泻1例[期刊论文]-临床军医杂志2002,30(1)
5.王彩敏.李彦芬.刘星.梁庆周巴氏杆菌病原分离鉴定及诊治[期刊论文]-河南畜牧兽医2006,27(11)
6.包守秦猪链球菌病研究进展[期刊论文]-中国畜禽种业2009,5(6)
7.张黎.韦宇拓.黄彦.杜丽琴.黄日波.Zhang Li.Wei Yutuo.Huang Yan.Du Liqin.Huang Ribo牛链球菌L-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达[期刊论文]-食品与发酵工业2005,31(9)
8.李仲兴.张新华猪链球菌及其感染的研究进展[期刊论文]-临床荟萃2006,21(5)
9.王琼秋.陈云明.张锦华.陈丽春.肖映红雏鸡脑炎型链球菌的分离与鉴定[期刊论文]-中国畜禽种业2010,6(1)
10.邓洁汝.王欢.邓治邦C型链球菌人工感染猪的临床与病理学观察[期刊论文]-上海畜牧兽医通讯2011(2)
本文链接：/Conference_7153718.aspx。
牦牛瘤胃产纤维素酶兼性厌氧细菌的筛选、鉴定及发酵研究
牦牛瘤胃产纤维素酶兼性厌氧细菌的筛选、鉴定及发酵研究牦牛瘤胃产纤维素酶兼性厌氧细菌的筛选、鉴定及发酵研究摘要：纤维素酶是一类能够分解纤维素的重要酶类，在生物质资源的利用过程中具有广泛的应用价值。
本研究利用牦牛瘤胃样品作为原料，通过筛选和鉴定，成功分离出一株纤维素酶兼性厌氧细菌，并进行了相关的发酵研究。
结果表明该细菌的纤维素酶活性较高，具有潜在的应用价值。
1. 引言纤维素是植物细胞壁的主要组成成分之一，具有丰富的资源和潜在的应用价值。
目前，纤维素酶的研究与应用得到了广泛关注。
牦牛瘤胃具有高效降解纤维素的能力，成为利用纤维素资源的潜在来源。
本研究旨在筛选、鉴定并进一步研究牦牛瘤胃产纤维素酶兼性厌氧细菌。
2. 材料与方法2.1 样品收集从5只健康的牦牛中分别收集瘤胃液样品，将样品立即置于液氮中，并转运至实验室进行后续处理。
2.2 筛选和鉴定出纤维素酶兼性厌氧细菌将瘤胃液样品进行稀释和接种处理，将接种样品在固体基质上进行平板培养。
通过观察培养基上有无形成透明圈或溶解带，筛选出纤维素酶产生菌株。
然后进行生理生化性状检测、形态特征观察、16S rRNA基因测序等鉴定方法，确认所得细菌的种类。
2.3 纤维素酶发酵研究将筛选得到的纤维素酶兼性厌氧细菌进行大规模培养和酶制剂发酵研究。
选定合适的发酵培养基组成和条件，设置不同的培养参数，如温度、初始pH值、发酵时间等。
通过酶活性测定和相关参数的变化监测，评估纤维素酶的产量和酶活性。
3. 结果与讨论3.1 筛选出纤维素酶兼性厌氧细菌经过培养和筛选，成功分离出一株产纤维素酶的兼性厌氧细菌，并命名为XX菌株。
经过生理生化性状检测和形态特征观察，确认该菌为一株新的细菌种类。
3.2 纤维素酶发酵研究在选定的发酵培养基组成和条件下，经过72小时的发酵，纤维素酶的酶活性显著提高。
温度、初始pH值和发酵时间对纤维素酶的产量和酶活性都有一定的影响。
最佳发酵条件为温度37℃、初始pH值6.5和48小时的发酵时间，此条件下纤维素酶的活性最高。
牛瘤胃乳酸菌的分离与鉴定
牛瘤胃乳酸菌的分离与鉴定杨龙龙;蒋建军;剡根强;王静梅;高家登;王超丽;杨铭伟【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(41)8【摘要】为分离筛选用于牛活菌制剂的乳酸菌菌株,试验采用API 50CHL对从牛瘤胃中分离的60株乳酸菌进行生化鉴定,对鉴定出的菌株进行耐酸耐碱、生长温度、耐氧、耐药和抑菌性测定.结果显示,经生化鉴定出的3株菌分别为嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、发酵乳杆菌(L.ermentum)和乳明串珠菌(L.holzapfelii),分别命名为L1、L2和L3.其中,L1耐酸性最强,L2耐碱性最强,L1在37～40℃之间均生长良好且兼性厌氧;L1、L2、L3耐药率为60％～100％;3株乳酸菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用,其中L1抑菌效果最好,抑菌圈直径分别为18.30和16.40 mm.提示,L1、L2可作为抗性乳酸菌活菌制剂的候选菌株.【总页数】4页(P145-148)【作者】杨龙龙;蒋建军;剡根强;王静梅;高家登;王超丽;杨铭伟【作者单位】石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003;石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003【正文语种】中文【中图分类】S823【相关文献】1.健康牛瘤胃内容物治疗牛药源性瘤胃消化紊乱病例报告 [J], 赖人杰2.牛瘤胃乳酸菌的分离与鉴定 [J], 杨龙龙;蒋建军;剡根强;王静梅;王超丽;高家登;杨铭伟3.牛瘤胃液中链球菌的分离与鉴定 [J], 苑学;邢欣;龙淼;逄晓阳;刘国文;孙国权;王哲4.牛瘤胃耐酸乳酸杆菌的分离与鉴定 [J], 龙淼;逄晓阳;朱连勤;邢欣;刘国文;王哲5.牛瘤胃纤维素酶eg基因在乳酸菌中的克隆表达及酶学性质分析 [J], 邹爱爱;魏亚琴;杨宇泽;曹磊;孙康永杰;万学瑞;王川因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
瘤胃积液分析报告
瘤胃积液分析报告1. 背景介绍瘤胃积液是指动物胃中积聚的液体，其成分通常包括胃酸、酶、盐和其他消化液。
瘤胃积液的分析可以提供关于动物消化系统健康状况的重要信息。
本文将介绍瘤胃积液分析的步骤和方法。
2. 样品收集收集瘤胃积液样品是进行分析的第一步。
通常可以通过胃管或切开动物的胃来获取样品。
收集样品时应注意避免污染和氧化，以确保结果的准确性。
3. 样品处理在分析之前，需要对瘤胃积液样品进行处理。
首先，将样品转移到干燥无菌容器中，并进行离心以去除固体颗粒和杂质。
接下来，可以将样品分成多个小样品，以便进行不同的分析。
4. pH值测定pH值是瘤胃积液酸碱度的指标，对于动物的消化功能非常重要。
可以使用pH 试纸或pH计来测定样品的pH值。
正常情况下，瘤胃积液的pH值通常在酸性范围内，适应动物的消化需求。
5. 酶活性测定瘤胃积液中的酶活性是评估消化功能的重要指标之一。
常见的酶活性测定包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性测定。
这些酶的活性水平反映了瘤胃积液中消化物质的降解能力。
6. 盐和电解质测定瘤胃积液中的盐和电解质含量也是评估消化系统健康状况的重要指标。
可以通过离子电极测定钠、钾、氯等离子的浓度。
正常情况下，积液中的盐和电解质浓度应该维持在一定的范围内，以满足动物的生理需求。
7. 瘤胃菌群分析瘤胃积液中的菌群分析可以提供关于动物消化道微生物组成的信息。
可以通过16S rRNA测序等方法，对样品中的细菌和古菌进行鉴定和定量分析。
不同菌群的丰度变化可能与动物的健康状况相关。
8. 结果解读根据上述分析结果，结合动物的生理状况和饲养管理情况，可以对瘤胃积液的分析结果进行解读。
分析结果可能显示消化功能异常、酶活性低下、盐和电解质失衡或菌群失调等问题。
根据解读结果，可以采取相应的措施来改善动物的消化系统健康。
9. 结论瘤胃积液分析是评估动物消化系统健康的重要工具。
通过对瘤胃积液中pH值、酶活性、盐和电解质浓度以及菌群组成的分析，可以获得动物消化系统的详细信息，帮助饲养者改善动物的消化功能，并提高动物的饲养效益。
一种产乳酸牛链球菌及其分离方法[发明专利]
![一种产乳酸牛链球菌及其分离方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/df32862d77c66137ee06eff9aef8941ea76e4bb2.png)
专利名称：一种产乳酸牛链球菌及其分离方法专利类型：发明专利
发明人：吴静,齐萌,陈荣
申请号：CN202111533186.3
申请日：20211215
公开号：CN114045245A
公开日：
20220215
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种产乳酸牛链球菌及其分离方法，涉及牛链球菌分离技术领域。
该产乳酸牛链球菌的分离方法，包括以下步骤：S1：原料制取：取正常牛的粪便100克，对其进行稀释，过滤杂质，留下滤液，装入无菌厌氧密封袋中并密封，S2：制备培养基：以水为溶质，向其中加入以下质量份数：可溶性淀粉2.0‑4.0克、葡萄糖10‑30克、磷酸氢二钾0.5‑1.5克、碳酸钙3‑5克、硫酸镁0.2‑0.4克、酵母粉0.4‑0.6克、琼脂20‑40克、1％结晶紫溶液1毫升。
通过在常用的培养基组分中加入淀粉和琼脂，可加快牛链球菌高于其它细菌的生长速率，迅速增殖，形成优势菌群，更易后续分离，且通过在常用的培养基组分中加入结晶紫溶液，易于对颜色进行区分，可快速将牛链球菌从其它细菌中挑选出来。
申请人：塔里木大学
地址：843300 新疆维吾尔自治区阿克苏地区阿拉尔市幸福路街道虹桥南路705号
国籍：CN
代理机构：北京卓胜佰达知识产权代理有限公司
代理人：张串串
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牛瘤胃的实验报告
一、实验目的1. 了解牛瘤胃的结构与功能；2. 探讨牛瘤胃消化饲料的能力；3. 分析牛瘤胃消化饲料的效率。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）牛瘤胃：选取一头健康成年牛，屠宰后取出瘤胃；（2）饲料：选取小麦、玉米、豆粕、稻草等常见饲料；（3）实验仪器：显微镜、电子天平、烘箱、培养箱等。
2. 实验方法（1）牛瘤胃解剖：将牛瘤胃展开，观察其结构，记录瘤胃壁、瘤胃乳头等特征；（2）瘤胃消化功能实验：将不同饲料分别置于牛瘤胃内，在适宜条件下培养一段时间，观察瘤胃对饲料的消化情况；（3）消化效率分析：通过比较不同饲料在瘤胃内的消化情况，分析牛瘤胃对不同饲料的消化效率。
三、实验结果1. 牛瘤胃结构牛瘤胃由瘤胃壁、瘤胃乳头、瘤胃腔等组成。
瘤胃壁分为黏膜层、肌层和浆膜层，瘤胃乳头呈指状，有利于饲料的混合和消化。
2. 瘤胃消化功能（1）小麦：在瘤胃内培养24小时后，小麦的消化率为30%；（2）玉米：在瘤胃内培养24小时后，玉米的消化率为40%；（3）豆粕：在瘤胃内培养24小时后，豆粕的消化率为50%；（4）稻草：在瘤胃内培养24小时后，稻草的消化率为20%。
3. 消化效率分析通过比较不同饲料在瘤胃内的消化情况，发现牛瘤胃对精饲料（如小麦、玉米、豆粕）的消化效率较高，而对粗饲料（如稻草）的消化效率较低。
四、实验讨论1. 牛瘤胃的结构与功能：瘤胃壁的肌肉层有利于瘤胃的收缩与扩张，瘤胃乳头有助于饲料的混合和消化。
此外，瘤胃内含有大量的微生物，如细菌、真菌等，这些微生物能够分解饲料中的纤维素、半纤维素等难以消化的物质。
2. 瘤胃消化功能：牛瘤胃对精饲料的消化效率较高，这可能是因为精饲料中富含易消化的碳水化合物、蛋白质等物质。
而粗饲料中纤维素含量较高，瘤胃内的微生物难以分解，导致消化效率较低。
3. 消化效率分析：本实验结果表明，牛瘤胃对不同饲料的消化效率存在差异。
在饲养过程中，应根据牛的消化特点，合理搭配饲料，以提高饲料利用率。
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万方数据
・４６・生理生化中国畜牧兽医２００９年第３６卷第５期
１．３．１瘤胃液的采集用导胃管从健康奶牛导出瘤胃液，装入无菌烧瓶中，密封，３７℃保温，立即送入实验室。
用４层滤网（１８０目）过滤后通５ｍｉｎＣＯ：，使之饱和，４℃３００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去除饲料颗粒、纤毛虫等。
吸取上清用埃氏巨型球菌营养液冲洗２次，每次４℃，２３００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。
将瘤胃菌液收集入１５０ｍＩ。
营养液的三角烧瓶中，于３７℃的温箱内厌氧环境培养４８ｈ进行增菌（李涤生等，１９８３）。
１．３．２细菌的分离培养和形态学及生化反应鉴定将配制好的厌氧血琼脂放置在无菌操作台上，用无菌枪头吸取摇匀的瘤胃液５０肛Ｌ，用涂布棒涂匀，放人厌氧培养罐内，加入厌氧产气袋，密闭，置于３７℃进行厌氧培养，经过反复分离纯培养从培养基上得到单菌落接种于专性厌氧液体培养基内，同样培养４８ｈ，根据其生物学性状、染色特点、生化反应进行初步鉴定（Ｂｕｃｈａｎａｎ等，１９８４）。
１．３．３细菌的分子生物学鉴定
１．３．３．１染色体基因组ＤＮＡ提取取对数生长的液体培养基内的菌液２ｍＬ，用细菌基因组ＤＮＡ小量制备试剂盒提取细菌ＤＮＡ。
操作按照小量细菌基因组ＤＮＡ制备试剂盒操作说明书进行（奥斯伯等，１９９８；萨姆布鲁克等，２００２）。
１．３．３．２ＰＣＲ扩增以提取的细菌染色体基因组为模板，根据ＧｅｎＢａｎｋ中埃氏巨型球菌（ＡＹｌ９６９１９）的１６ＳｒＲＮＡ序列，设计、合成如下的引物序列：上游引物Ｐ１：５’一ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴ—ＧＧ一３’；下游引物Ｐ２：５’一ＧＧＡＣＴＡＣＴＡＧＧＧ—ＴＡＴＣＴＡＡＴ一３７，ＰＣＲ预计扩增目的片段大小为８０５ｂｐ。
ＰＣＲ反应体系为２５弘Ｌ，灭菌三蒸水１７．３ｐＬ，Ｐ１、Ｐ２引物各１弘Ｌ，基因组模板１耻Ｌ，１０×Ｔａｑ—ｂｕｆｆｅｒ２．５肛Ｌ，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２／－ｔＬ，ＥｘＴａｑ酶０．２弘Ｌ。
扩增条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ，３３℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０次循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。
１．３．３．３扩增产物电泳分析、回收取ＰＣＲ扩增产物在１％琼脂糖凝胶用６０Ｖ电泳１５ｍｉｎ，紫外灯下观察电泳结果，对于目的片段用凝胶回收试剂盒回收。
１．３．３．４ＰＣＲ产物的连接和转化将回收的ＰＣＲ产物与ｐＭＤｌ８一Ｔ载体连接，１６℃连接过夜。
将连接产物与大肠杆菌ＤＨ５ａ感受态细胞轻轻混匀，在冰水中放置４５ｍｉｎ后，４２℃热激２ｍｉｎ，冰浴５ｍｉｎ，加入２００ｌｕＬ无菌ＬＢ培养基，混匀后３７℃摇床培养１ｈ．然后将菌液均匀涂布在含Ａｍｐ的ＬＢ琼脂平板上，３７℃倒置培养１２～１６ｈ。
在含Ａｍｐ的ＬＢ平板上挑取单个菌落接种到５ｍＬ的ＬＢ液体培养基（含Ａｍｐ的量）上，在３７℃恒温震荡培养１２～１６ｈ。
１．３．３．５重组质粒的扩增与测序用质粒ＤＮＡ小剂量纯化试剂盒提取重组质粒，电泳观察提取结果。
ＰＣＲ扩增重组质粒，电泳观察并送到ＴａＫａＰａ公司测序，由ＤＮＡｓｉｓ软件分析测序结果。
根据测序结果在ＧｅｎＢａｎｋ上利用ＢＬＡＳＴ进行序列的同源性分析。
２试验结果
２．１细菌的形态和培养特性在厌氧血琼脂培养基上，菌落呈紫红色，菌落边缘圆润光滑、凸起，直径０．５～ｌＩｔｌｍ，专性厌氧液体培养物中细菌以长链为主。
由图１可见，目的菌株革兰氏染色为阳性，细菌常以单个或成对存在、短链状。
１０℃环境下，６．５％ＮａＣｌ培养液和ｐＨ为９．６或０．１％的美兰牛奶中均不生长；在４０％胆汁培养基中生长；４５℃环境下生长，耐热，６０℃３０ｍｉｎ仍具有活性。
图ｌ链球菌形态学观察结果
２．２细茵的生化鉴定由表１可知，目的菌能发酵葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、柳醇、棉籽糖，但不能发酵鼠李糖、蕈糖和菊糖；能水解淀粉．能发酵甘露醇，不能发酵山梨醇、赤藓醇、肌醇、侧金盏花醇、苦杏ｆ＿：苷、水杨苷、七叶苷、尿素、靛基质，不能液化明胶，能从硝酸盐生成亚硝酸盐，胆
汁能刺激其生长。
万方数据
中国畜牧兽医２００９年第３６卷第５期生理生化・４７・结果＋————一—－一
２．３ＰＣＲ扩增结果由图２可知，扩增片段大小在８０５ｂｐ左右，是所需要片段。
２．４１６ＳｒＲＮＡ序列测定结果牛链球菌１６ＳｒＲＮＡ基因的测序结果已提交ＧｅｎＢａｎｋ数据库，其登录的序列号为曲ＩＡＦｌ０４１０９．１ＡＦｌ０４１０９。
本试验得到的序列经ＢＬＡＳＴ对ＧｅｎｅＢａｎｋ数据库进行同源性分析。
与已报道的牛链球菌１６ＳｒＲＮＡ基因序列相比，其同源性达９９％，因此可以鉴定为牛链球菌。
图２链球菌的ＰＣＲ扩增结果
注：１为ＤＬ一２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２、３为菌株ＰＣＲ扩增结果。
３讨论
牛链球菌是革兰氏阳性链球菌属的一种，主要存在于反刍动物的瘤胃内，是参与瘤胃发酵的重要瘤胃微生物之一，对反刍动物乳酸的生成起重要作用。
它可以将谷类饲料（主要富含碳水化合物）迅速发酵Ｄ－￥Ｌ酸和Ｌ－乳酸。
其中不易被代谢的Ｄ乳酸是引发代谢性酸中毒主要物质；而Ｌ－￥Ｌ酸一方面可以很快被代谢不会造成酸中毒，另一方面其及其聚合物还是工业生产重要的原料之一。
随着奶牛业的快速发展，瘤胃酸中毒在奶牛饲养中影响越来越明显，瘤胃酸中毒发生时，导致奶牛生长速度下降和饲料转化率降低，从而引起奶牛产奶量、乳脂率和体重下降等。
瘤胃低ｐＨ和较高乳酸浓度持续数月甚至数年，还可导致瘤胃炎、瘤胃角质化、蹄叶炎、腹泻、瘤胃血管血栓、脑灰质软化症、突然死亡综合征等（Ｂｕｃｈａｎａｎ等，１９８４）。
此外，由于近年来利用微生物生产高纯度的Ｌ＿乳酸成为国际的研究热点，但是自然界中能生产Ｌ一乳酸的微生物极少。
随着基因工程的飞速发展和广泛应用，利用基因工程的方法构建Ｌ厂乳酸高产菌株成为人们研究的焦点。
天然的大肠杆菌没有Ｌ一乳酸脱氢酶，没有Ｌ一乳酸产生。
许多研究人员将表达牛链球菌Ｌ一乳酸脱氢酶基因的质粒转化到大肠杆菌菌株中，期望在大肠杆菌中建立新的Ｌ－乳酸代谢途径（张黎等，２００５）。
为此，分离筛选出对乳酸生成具有重要意义的菌株一牛链球菌，并通过生物化学手段将其改造成Ｄ－￥Ｌ酸生成关键酶基因缺失Ｔ程菌，从而减弱其生成胁乳酸的能力，对纠正或缓解奶牛乳酸酸中毒具有重要意义；并且可以通过基因工程方法将牛链球菌的Ｌ一乳酸脱氢酶基因转入其它菌株中，转化葡萄糖生产Ｌ一乳酸，从而对生产高纯度的Ｌ－￥Ｌ酸产生深远的影响。
本试验在对目的菌进行体外培养过程中，选用了专性厌氧细菌培养基一ＶＳ厌氧血琼脂培养基作为分离和纯培养的特异性固体培养基，并加入了能够刺激目的菌生长的吐温一８０（于鸿玲等。
２００６），这些改进增加了培养基对目的菌的选择性。
牛链球菌的生物学性状表现为菌落呈紫红色，菌落边缘圆润光滑，凸起，兼性厌氧，再结合生化特性观察结果，可以初步判定牛链球菌。
以往对微生物的认识基于对微生物的培养和纯种分离技术，而在自然环境中的微生物９２％～９８％的种类至今尚是不可培养的，成为正确认识微生物生态系的严重障碍。
分子生态技术的应用克服了培养技术的限制，对样品进行客观的分析，更精确地揭示微生物种类和遗传的多样性。
随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展．微生物核糖体数据库的日益完善，１６ＳｒＲＮＡ序列分析作为微生物系统分类的主要依据已得到了广泛认同，该技术已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具（周煜，１９９９）。
该技术利用微生物遗传信息中小亚基单位核糖体ＲＮＡ的１６ＳｒＲＮＡ的遗传保守性和其大小最适合
进行分析的特点（于鸿玲等，２００６），从微生物样本中万方数据
万方数据。