畜牧兽医-病毒各论 南京农业大学
南京农业大学研究生学位论文格式规范(20170510)
附件4农业大学研究生学位论文格式规（2016年12月21日，第十一届校学位评定委员会第八次全会修订）学位论文是研究生从事科研工作成果的主要体现，是研究生申请学位的重要依据。
为了提高研究生学位论文的质量，做到学位论文在容和格式上的规化，特作如下规定：一、论文容要求研究生学位论文应用汉语撰写（特殊学科如外国语言文学、翻译硕士可用本学科语言撰写），国际学生可用英文撰写（必须附中文摘要）。
论文容应层次分明，数据可靠，文字简练，推理严谨，立论正确。
论文容一般应由以下几个主要部分组成：封面、英文封面、原创性声明及授权书（详见附件1）、目录（包括图表目录、符录目录）、中文摘要、英文摘要、符号及缩略语等的说明、论文正文、参考文献、附录、致、攻读学位期间取得的学术成果目录。
具体要求如下：（一）封面采用研究生院印发的统一封面格式，封页上填写分类号、学号、论文题目、作者、指导教师、申请学科门类（学位类别）、一级学科名称、二级学科名称（领域名称，专业学位不设领域可不填写）、研究方向、答辩日期等容。
（二）目录依次列出文的主要章节标题，标题应简明扼要。
（三）中文摘要及关键词容应涉及本项科研工作的目的和意义、研究方法、结论及意义。
注意突出学位论文中具有创新性的成果和新见解的部分。
文字应简短明了。
选择约4—6个关键词。
（四）英文摘要及关键词应与中文摘要及关键词基本相对应，要符合英语语法，语句通顺。
（五）符号说明说明论文中所用符号及缩略语所表示的意义及单位。
未用或所用符号不多的论文可省略此部分。
（六）绪论在论文主体前，容为：该研究工作的实用价值与理论意义；研究背景及国外文献综述；论文所要解决的问题。
通过绪论，读者就能全面了解学位论文的目的、意义和工作容。
切忌将论文目录直接复制作为绪论容。
（七）论文主体论文主体由文献综述与实验两部分组成，也可只含实验部分。
人文学科的论文用实证分析等取代实验部分。
文献综述应将与论文容有关的国外研究进展作回顾与分析，篇幅不宜超过实验部分。
南农畜牧学通论复习资料(DOC)
畜牧学畜牧与兽医的关系畜牧业的作用与地位成就与存在的问题如何教、学好畜牧学现代畜牧业三大矛盾不断增加的对畜产品需求量与自然资源的匮乏之间的矛盾日益明显现代畜牧业生产方式与自然、社会、伦理之间的冲突不断增加畜牧业对人类社会的发展和生存方式产生的影响愈演愈烈畜牧学的专业基础课与专业课✓家畜育种学✓家畜繁殖学✓家畜饲养学✓养猪学✓养禽学✓养牛学畜牧业的作用与地位提供肉、蛋、奶、毛、皮等重要生活资料提供役力伴侣、竞赛动物增加农民收入我国畜牧业发展的成就改革开放30年，畜牧业发展迅速产业规模巨大，基本满足国民消费需求建立了完善的生产技术与疫病防控体系灵活多样的产业运作模式肉类总产量及排名猪肉总产量及排名禽肉生产及排名我国畜牧业存在的问题生产技术水平整体不高市场波动大养殖风险高畜牧业内部结构不合理产品的安全性有待加强疫病防控有待加强服务体系不尽完善出栏率出栏率：衡量养猪效率的指标猪出栏头数：指报告期内已出栏销售和自宰自食的全部肉猪头数，但不包括小猪、乳猪期内出栏头数出栏率= ———————×100%期初存栏头数未掌握生产中的关键环节种源生产方式落后疫苗、兽药与诊断试剂动物营养标准与饲料加工设备屠宰、加工与产品开发瘦肉精、速生鸡事件、马肉风波、假羊肉、黄浦江死猪事件畜禽营养与饲养原理畜禽的消化与吸收特点营养物质的功能与消化代谢各类饲料营养特性饲料配合和加工调制植物与动物体的化学组成动植物化学元素组成饲料的主要营养成分单胃草食家畜消化系统和消化过程的特点：消化系统的组成与单胃杂食动物相似；盲肠和结肠发达，微生物可消化纤维素并合成维生素；草食为生，但对纤维素的消化能力不如反刍动物；马无夜草不肥假反刍动物，兔家禽（poultry）消化系统和消化过程的特点：没有牙齿，无咀嚼功能嗉囊，储藏食物、适宜微生物栖居腺胃，分泌胃蛋白酶原、HCl肌胃，利用沙石子物理消化。
肠道，短，饲料从入口至排出时间短除鹅、火鸡外，粗纤维分解能力弱概略养分国际上通常采用1864年，德国Weende试验站的Hanneberg 提出的常规饲料分析方案，即概略养分分析方案(Feed Proximate Analysis)，将饲料中的养分分为六大类养分的基本功能1.动物体的结构物质2.动物生存和生产的能量来源3.动物机体正常机能活动的调节物质4.形成产品———附属功能国际饲料分类✓粗饲料✓青绿饲料✓青贮饲料✓能量饲料✓蛋白质饲料✓矿物质饲料✓维生素饲料✓添加剂粗饲料：自然含水量<45%，CF≥18 特点：粗纤维含量高、消化率低青绿饲料含水量＞45 % ,植物性饲料特点：1.含水量高、干物质含量低水生植物95%2.粗纤维含量少、无氮浸出物多3.消化率高，反刍动物75-85%4.含有多种维生素青贮饲料是一种利用微生物发酵和化学方法，在密封条件下调制并贮存青绿饲料的方法。
兽医病毒学考点总结
名词解释：病毒：病毒是一类个体微小，无完整细胞结构，含单一核酸（DNA或RNA）型，必须在活细胞内寄生并复制的非细胞型微生物。
病毒学：是一门以地球上最微小的非细胞生物病毒为研究对象的一门科学。
拟病毒：拟病毒也称为类类病毒，它是一种环状单链RNA。
它的侵染对象是植物病毒。
被侵染的植物病毒被称为辅助病毒，拟病毒必须通过辅助病毒才能复制。
单独的辅助病毒或拟病毒都不能使植物受到感染。
类病毒：目前已知最小的可传染的致病因子。
与病毒不同的是，类病毒没有蛋白质外壳，为共价闭合的单链RNA分子，呈棒状结构，这和朊病毒相反，由一些碱基配对的双链区和不配对的单链环状区相间排列而成。
朊病毒：是一类不含核酸而仅由蛋白质构成的可自我复制并具感染性的因子。
缺陷病毒：在病毒增值的过程中，由于病毒基因组发生突变产生装配不全的病毒颗粒，称为缺陷病毒。
假病毒：一种病毒的核酸被以另一病毒编码的外壳包裹，则称为假病毒噬菌斑：是指在宿主细菌的菌苔上，噬菌体使细菌裂解而形成的无色透明的空斑。
空斑：动物细胞被病毒侵染后的死细胞群落。
病斑：动物细胞受肿瘤病毒感染后细胞剧增形成的病灶。
（枯斑：植物）包涵体：在某些感染病毒的寄主细胞内，形成有结构特殊、有一定染色性、在光学显微镜下可见的大小、形态、数量不等的小体，称为包涵体。
传染性核酸：有些病毒去除囊膜和衣壳，裸露的DNA或RNA也能感染细胞，这样的核酸称为传染性核酸。
复制周期：自病毒吸附于细胞开始，到产生成熟子代病毒从感染细胞释放到细胞外的复制过程称为病毒的复制周期。
复制：病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过合成与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。
病毒的这种特殊繁殖方式称做复制。
吸附：指病毒体表面特异性吸附蛋白与宿主细胞表面特异性受体结合的现象。
病毒吸附蛋白(viral attachment protein，V AP)：是能够特异性地识别细胞受体并与之结合的毒粒表面的结构蛋白分子，亦称做反受体(antireceptor)。
N_端B_细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60_蛋白的表达及其免疫原性
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２４ꎬ４０(３):５０８￣５１３ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ刘维龙ꎬ胡㊀波ꎬ范志宇ꎬ等.Ｎ端Ｂ细胞表位缺失的兔出血症病毒ＶＰ６０蛋白的表达及其免疫原性[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２４ꎬ４０(３):５０８￣５１３.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２４.０３.０１３Ｎ端Ｂ细胞表位缺失的兔出血症病毒ＶＰ６０蛋白的表达及其免疫原性刘维龙１ꎬ２ꎬ㊀胡㊀波１ꎬ３ꎬ㊀范志宇１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀魏后军１ꎬ３ꎬ㊀仇汝龙１ꎬ３ꎬ㊀宋艳华１ꎬ３ꎬ㊀陈萌萌１ꎬ３ꎬ㊀葛㊀雷１ꎬ３ꎬ㊀熊富强３ꎬ４ꎬ㊀王㊀芳１ꎬ２ꎬ３ꎬ４(１.江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ２.西藏农牧学院ꎬ西藏林芝８６００００ꎻ３.兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心ꎬ江苏泰州２２５３００ꎻ４.南京农业大学动物医学院ꎬ江苏南京２１００９５)收稿日期:２０２３￣０２￣２２基金项目:现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目(ＣＡＲＳ￣４３￣Ｃ￣１)作者简介:刘维龙(１９９９－)ꎬ男ꎬ新疆奎屯人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事动物疫病防控研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｉｕｗｅｉｌｏｎｇ１９９９＠１２６.ｃｏｍꎮ胡波为共同第一作者ꎮ通讯作者:王㊀芳ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｒｗａｎｇｆａｎｇ＠１２６.ｃｏｍꎻ熊富强ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｘｉｏｎｇｆｕｑｉａｎｇ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀本研究将Ａ３Ｃ单抗识别的ＶＰ６０蛋白ＮＴＡ区域作为识别标记ꎬ设计一系列编码ＶＰ６０ＮＴＡ区域重叠多肽的基因序列并连接于ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１载体ꎬ确定Ａ３Ｃ单抗识别的精确表位ꎮ然后构建重组质粒Ｂａｃｍｉｄ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃꎬ将Ｂａｃｍｉｄ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ转染Ｓｆ９昆虫细胞ꎬ得到重组杆状病毒ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３ＣꎮＲＴ￣ＰＣＲ㊁ＨＡ㊁ＩＦＡ和Ｗｅｓｔ￣ｅｒｎＢｌｏｔ鉴定结果表明ꎬ重组蛋白ＶＰ６０әＡ３Ｃ在Ｓｆ９细胞中高效表达ꎬ电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒ＶＰ６０蛋白类似ꎮ将重组蛋白ＶＰ６０әＡ３Ｃ以每只２００μｇ免疫２月龄ＲＨＤＶ血清阴性的新西兰兔ꎬ免疫后１４ｄꎬ以兔出血症病毒ＷＦ株攻毒新西兰兔ꎮ结果表明ꎬ免疫组无死亡ꎬ而对照组全部死亡ꎮ本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础ꎮ关键词:㊀兔出血症病毒ꎻＶＰ６０蛋白ꎻＢ细胞表位ꎻ免疫原性中图分类号:㊀Ｓ８５５.３㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２４)０３￣０５０８￣０６ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓＶＰ６０ｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈＢｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｄｅｌｅｔｉｏｎｉｎＮｔｅｒｍｉｎｕｓａｎｄｉｔｓｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｉｎｒａｂｂｉｔＬＩＵＷｅｉ￣ｌｏｎｇ１ꎬ２ꎬ㊀ＨＵＢｏ１ꎬ３ꎬ㊀ＦＡＮＺｈｉ￣ｙｕ１ꎬ２ꎬ３ꎬ㊀ＷＥＩＨｏｕ￣ｊｕｎ１ꎬ３ꎬ㊀ＱＩＵＲｕ￣ｌｏｎｇ１ꎬ３ꎬ㊀ＳＯＮＧＹａｎ￣ｈｕａ１ꎬ３ꎬ㊀ＣＨＥＮＭｅｎｇ￣ｍｅｎｇ１ꎬ３ꎬ㊀ＧＥＬｅｉ１ꎬ３ꎬ㊀ＸＩＯＮＧＦｕ￣ｑｉａｎｇ３ꎬ４ꎬ㊀ＷＡＮＧＦａｎｇ１ꎬ２ꎬ３ꎬ４(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏ￣ＰｒｏｄｕｃｔＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌ￣ｔｕｒｅꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＸｉｚａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬｉｎｚｈｉ８６００００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＧｕｏＴａｉ(Ｔａｉｚｈｏｕ)ＣｅｎｔｅｒｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏ￣ｇｙＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｆｏｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓꎬＴａｉｚｈｏｕ２２５３００ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００９５ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｕｓｅｄｔｈｅＮＴＡｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＶＰ６０ｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙＡ３Ｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｓａｒｅｃｏｇｎｉ￣ｔｉｏｎｍａｒｋｅｒꎬｄｅｓｉｇｎｅｄａｓｅｒｉｅｓｏｆｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎｔｈｅＶＰ６０ＮＴＡｒｅｇｉｏｎꎬａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｈｅｍｔｏｔｈｅｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１ｖｅｃｔｏｒｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｐｒｅｃｉｓｅｅｐｉｔｏｐｅｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙＡ３Ｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ.ＴｈｅｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄＢａｃｍｉｄ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃｗａｓｃｏｎ￣ｓｔｒｕｃｔｅｄ.Ｂａｃｍｉｄ￣ＶＰ６０әＡ３ＣｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＳｆ９ｉｎ￣ｓｅｃｔｃｅｌｌｓꎬａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ.ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＲＴ￣ＰＣＲꎬＨＡꎬ８０５ＩＦＡꎬａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＶＰ６０әＡ３ＣｗａｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＳｆ９ｃｅｌｌｓ.Ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓ￣ｃｏｐｙｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｔｓｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｗｅｒｅｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｏｓｅｏｆｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓＶＰ６０ｐｒｏｔｅｉｎ.Ｔｈｅ２￣ｍｏｎｔｈ￣ｏｌｄＲＨＤＶｓｅｒｕｍｎｅｇａｔｉｖｅＮｅｗＺｅａｌａｎｄｒａｂｂｉｔｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＶＰ６０әＡ３Ｃａｔａｒａｔｅｏｆ２００μｇｐｅｒｒａｂｂｉｔꎬａｎｄＮｅｗＺｅａｌａｎｄｒａｂｂｉｔｓｗｅｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｗｉｔｈｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓＷＦｓｔｒａｉｎａｆｔｅｒ１４ｄａｙｓ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｄｅａｔｈｓｉｎｔｈｅｉｍｍｕｎｅｇｒｏｕｐꎬｗｈｉｌｅａｌｌｄｅａｔｈｓｏｃｃｕｒｒｅｄｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｌａｙｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｅｐｉｔｏｐｅ￣ｄｅｌｅｔｅｄｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅｏｆｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ(ＲＨＤＶ)ꎻＶＰ６０ｐｒｏｔｅｉｎꎻＢｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅꎻｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ㊀㊀兔出血症(ＲａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅꎬＲＨＤ)是由兔出血症病毒(ＲａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓꎬＲＨＤＶ)引起的高发病率和死亡率的烈性传染病[１]ꎮＲＨＤＶ分为ＧＩ.１(ＲＨＤＶ１)和ＧＩ.２(ＲＨＤＶ２)２种基因型ꎬ分别引起兔出血症１型和兔出血症２型ꎬ２种基因型病毒之间交叉保护性低[２￣４]ꎮ自２０２０年ＧＩ.２型ＲＨＤＶ在中国出现以来[５]ꎬ２种基因型ＲＨＤＶ在中国处于共同流行态势ꎮＧＩ.１型ＲＨＤＶ主要感染２月龄以上兔ꎬ幼兔感染后不发病ꎬ但可带毒ꎬ并在群体传播中发挥重要作用[６]ꎬ表明感染幼兔是该病重要的传染源之一ꎮＲＨＤＶ的衣壳蛋白(ＶＰ６０)可以自组装形成３５~４０ｎｍ的病毒样颗粒(ＶＬＰｓ)ꎮ同时ꎬＶＰ６０可在机体内诱导产生中和抗体ꎬ是ＲＨＤＶ的主要免疫保护性抗原ꎬ也是宿主免疫防御ＲＨＤＶ的主要靶标ꎬ在病毒诊断和国内外疫苗设计中起重要作用[１]ꎬ但现有疫苗和抗体检测方法均无法鉴别疫苗免疫和病毒感染ꎮ鉴于ＧＩ.１型ＲＨＤＶ感染幼兔的带毒和病毒传播特点ꎬ因此构建一种基于ＶＰ６０蛋白的表位标记疫苗并配套相应的表位抗体检测技术用于感染兔群的检测ꎬ是区分疫苗免疫和病毒感染的可行方案ꎮ前期我们发现Ａ３Ｃ单抗识别的ＶＰ６０蛋白Ｎ端Ｂ细胞表位具有强免疫原性但不具有中和活性ꎬ因此将该表位位点作为一种识别标记ꎬ构建一种Ａ３Ｃ识别表位缺失的ＶＰ６０蛋白ꎬ在昆虫细胞中表达并研究其ＶＬＰｓ形成能力ꎬ可为构建兔出血症表位缺失的标记疫苗奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料１.１.１㊀质粒、菌种和细胞㊀重组质粒ｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０(ＧＩ.１型ＶＰ６０)㊁Ｓｆ９昆虫细胞㊁大肠杆菌ＤＨ１０Ｂａｃ由本实验室保存ꎻＢＬ２１(ＤＥ３)感受态购自北京全式金生物技术有限公司ꎮ１.１.２㊀主要试剂㊀ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００㊁ＣｌｏｎＥｘ￣ｐｒｅｓｓⅡＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ试剂盒㊁ＥＣＬ显色试剂盒㊁１.１ˑＰＣＲｍｉｘ购自南京诺唯赞生物科技有限公司ꎬＦＢＳ购自ＧＩＢＣＯ公司ꎬ山羊抗小鼠ＦＩＴＣ￣ＩｇＧ㊁山羊抗小鼠ＨＲＰ￣ＩｇＧ购自Ｂｉｏｓｈａｒｐ生物科技公司ꎬＶＰ６０单克隆抗体Ａ３Ｃ㊁１Ｄ４由本实验室制备ꎬＴａｑ高保真酶㊁转染试剂Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００和Ｇｒａｃｅ培养基购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ꎬ其他试剂均为国产分析纯ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀表达质粒的合成㊀在前期模糊定位非中和单抗Ａ３Ｃ识别ＶＰ６０ＮＴＡ区域的基础[７]上ꎬ设计一系列ＶＰ６０ＮＴＡ区域重叠多肽的基因序列并连接于ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１载体(表１)ꎮ表１㊀基因序列及对应氨基酸序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅｓ基因名称基因序列(５ᶄң３ᶄ)氨基酸序列ＶＰ６０ＮＴＡ１ＧＧＡＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＴＣ￣ＣＴＧＧＴＧＴＴＴＤＧＭＤＰＧＶＰ６０ＮＴＡ２ＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＴＡＧＴ￣ＧＧＣＣＴＤＧＭＤＰＧＶＶＡＶＰ６０ＮＴＡ３ＧＧＡＡＣＣＡＣＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＴＣ￣ＣＴＧＴＴＴＤＧＭＤＰＶＰ６０ＮＴＡ４ＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＴＡＧＴＧＧＣＣＤＧＭＤＰＧＶＶＡ１.２.２㊀单抗Ａ３Ｃ识别表位的鉴定㊀将合成的重组表达质粒ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１￣ＶＰ６０ＮＴＡ１㊁ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１￣ＶＰ６０ＮＴＡ２㊁ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１￣ＶＰ６０ＮＴＡ３㊁ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１￣ＶＰ６０ＮＴＡ４分别转化大肠杆菌ＢＬ２１(ＤＥ３)感受态ꎬ阳性菌经０.５ｍｍｏｌ/ＬＩＰＴＧ诱导表达后获得重组蛋白ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１￣ＶＰ６０ＮＴＡ１㊁ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１￣ＶＰ６０ＮＴＡ２㊁ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１￣ＶＰ６０ＮＴＡ３㊁ｐＧＥＸ￣４Ｔ￣１￣ＶＰ６０ＮＴＡ４ꎬ经ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳后ꎬ转印至ＰＶＤＦ膜上ꎬ经５％脱脂乳封闭后ꎬ以识别ＶＰ６０ＮＴＡ区的单抗Ａ３Ｃ为一９０５刘维龙等:Ｎ端Ｂ细胞表位缺失的兔出血症病毒ＶＰ６０蛋白的表达及其免疫原性抗ꎬ羊抗鼠ＨＲＰ￣ＩｇＧ(１ʒ１００００)为二抗ꎬ进行ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定ꎬ确定Ａ３Ｃ单抗识别的精确表位ꎮ１.２.３㊀引物合成㊀Ａ３Ｃ识别表位缺失株构建引物及一系列鉴定引物由北京擎科生物科技有限公司合成(表２)ꎮ表２㊀扩增和鉴定的特异性引物Ｔａｂｌｅ２㊀Ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ引物名称㊀㊀引物序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀㊀㊀㊀ＶＰ６０әＡ３Ｃ￣ＦＧＴＡＧＴＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＡＧＴＧＴＧＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＶＰ６０әＡ３Ｃ￣ＲＡＣＴＡＧＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＡＣＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＧＡＡＣＰＦａｓｔＢａｃ￣ＦＴＡＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＣＣＰＦａｓｔＢａｃ￣ＲＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＭ１３￣ＦＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＭ１３￣ＲＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＶＰ６０￣ＦＡＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＶＰ６０￣ＲＴＣＡＧＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴ１.２.４㊀缺失Ａ３Ｃ识别表位的重组转移载体的构建㊀以本实验室保存的重组质粒ｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０为模板ꎬ以ＶＰ６０әＡ３Ｃ￣Ｆ/ＶＰ６０әＡ３Ｃ￣Ｒ引物进行ＰＣＲ反应ꎬ扩增缺失Ａ３Ｃ识别表位的ＶＰ６０基因ꎮＰＣＲ反应程序为:９５ħ３０ｓꎻ９５ħ１５ｓꎬ６５ħ１５ｓꎬ７２ħ７ｍｉｎꎬ３０个循环ꎻ７２ħ５ｍｉｎꎮ将ＰＣＲ反应产物于１.２％琼脂糖凝胶进行鉴定ꎬ１２０Ｖ电泳３０ｍｉｎ后ꎬ回收ＰＣＲ阳性产物ꎬ使用ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓⅡＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ试剂盒对ＰＣＲ产物进行连接㊁转化ꎬ用ｐＦａｓｔＢａｃ￣Ｆ/ｐＦａｓｔＢａｃ￣Ｒ引物进行扩增及测序鉴定ꎬ获得正确缺失Ａ３Ｃ识别表位的杆状病毒重组转移载体ｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０әＡ３Ｃꎮ１.２.５㊀缺失Ａ３Ｃ识别表位的重组穿梭载体的构建㊀将重组转移载体ｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ转化含有穿梭载体的大肠杆菌ＤＨ１０Ｂａｃꎬ使用蓝白斑筛选法ꎬ将大肠杆菌ＤＨ１０Ｂａｃ涂布于含３种抗性的平板上(含５０μｇ/ｍｌＫａｎａｍｙｃｉｎ㊁７μｇ/ｍｌＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ㊁１０μｇ/ｍｌＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ㊁１００μｇ/ｍｌＸ￣ｇａｌ和４０μｇ/ｍｌＩＰＴＧ)ꎬ３７ħ恒温培养２ｄ后ꎬ挑取白色阳性单菌落纯化培养后提取质粒ꎮ以Ｍ１３￣Ｆ/Ｍ１３￣Ｒ进行ＰＣＲ反应ꎬ获得重组穿梭载体Ｂａｃｍｉｄ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃꎮ１.２.６㊀细胞转染㊀使用转染试剂Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００将重组穿梭载体Ｂａｃｍｉｄ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ转染Ｓｆ９昆虫细胞ꎬ结束后每１２ｈ观察细胞状态ꎬ待细胞出现间隙增大㊁折光性增强㊁形态变圆等病变特征时收集细胞及其培养物ꎬ以１０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎ收获上清液即为ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ原液(Ｆ１代病毒)ꎮ１.２.７㊀ｍＲＮＡ的检测㊀收集接种ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ的Ｓｆ９昆虫细胞样品ꎬ采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取感染细胞内总ＲＮＡꎬ反转录为ｃＤＮＡ后ꎬ以ＶＰ６０￣Ｆ/ＶＰ６０￣Ｒ引物进行ＲＴ￣ＰＣＲ扩增ꎬ鉴定ｍＲＮＡ的存在ꎮＰＣＲ程序为:９５ħ５ｍｉｎꎬ然后进入循环９５ħ３０ｓꎬ５５ħ３０ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ３５个循环ꎻ７２ħ５ｍｉｎꎮ将ＰＣＲ反应产物于１.２％琼脂糖凝胶１２０Ｖ电泳３０ｍｉｎ后ꎬ紫外灯下观察结果并拍照ꎮ１.２.８㊀间接免疫荧光试验(ＩＦＡ)㊀预先将Ｓｆ９细胞在２４孔细胞板上培养至密度为８５％~９０％ꎬ每孔接种等量的重组杆状病毒ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃꎬ同时以野生型毒株感染Ｓｆ９细胞作阴性对照ꎮ在感染Ｓｆ９细胞２４ｈ后ꎬ弃去培养液ꎬＰＢＳ洗涤２次ꎬ加入提前－２０ħ冷藏的甲醇和丙酮混合成的固定液ꎬ４ħ作用１ｈꎻＰＢＳ洗涤３次ꎬ加入ＰＢＳ稀释的１Ｄ４单抗(１ʒ２００)ꎬ３７ħ孵育９０ｍｉｎꎬＰＢＳ洗涤３次后ꎬ加入ＰＢＳ１ʒ５０倍稀释的山羊抗小鼠ＦＩＴＣ￣ＩｇＧꎬ黑暗条件下３７ħ孵育１ｈꎬＰＢＳ洗涤３次ꎬ荧光显微镜观察并拍照ꎮ１.２.９㊀ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测㊀将重组杆状病毒ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ接种Ｓｆ９细胞ꎬ７２ｈ后收获细胞培养物ꎬ反复冻融３次后ꎬ取上清液ꎬ等比例加入Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ处理后进行蛋白质电泳ꎬ结束后将凝胶半干转印至ＰＶＤＦ膜上ꎬ５％脱脂乳３７ħ封闭２ｈꎬＰＢＳＴ洗涤３次后ꎬ以１Ｄ４单抗(１ʒ１０００)为一抗ꎬ羊抗鼠ＨＲＰ￣ＩｇＧ(１ʒ１００００)为二抗ꎬ进行ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定ꎮ１.２.１０㊀血凝效价测定㊀参照中华人民共和国农业行业标准ＮＹ/Ｔ５７２－２０１６兔病毒性出血病血凝与血凝抑制试验方法[８]进行ꎮ１.２.１１㊀电镜观察㊀对获得的重组蛋白表达产物以红细胞吸附释放法[９]进行纯化并超速离心ꎬ蛋白质样品ＶＰ６０әＡ３Ｃ经生理盐水重悬后取少量置于铜网静置２ｍｉｎꎬ加入２％磷钨酸染液ꎬ利用透射电镜观察重组蛋白样品并拍照ꎮ１.２.１２㊀免疫保护性研究㊀将纯化的ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白稀释至２００μｇ/ｍｌꎬ免疫兔出血症病毒抗原和抗体均阴性的２月龄新西兰兔５只ꎬ每只颈部皮下注射１ｍｌꎬ同时以５只接种生理盐水的新西兰兔作为对照组ꎮ免疫后１４ｄꎬ分别颈部皮下注射１００００１５江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第３期ＬＤ５０的兔出血症病毒ꎬ攻毒后７ｄ内每１２ｈ观察试验兔并记录ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀Ａ３Ｃ单抗识别表位的鉴定对ＶＰ６０ＮＴＡ１㊁ＶＰ６０ＮＴＡ２㊁ＶＰ６０ＮＴＡ３㊁ＶＰ６０ＮＴＡ４４个蛋白进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳ꎬ转印ＰＶＤＦ膜后ꎬ以单抗Ａ３Ｃ为一抗ꎬ羊抗鼠ＨＲＰ￣ＩｇＧ为二抗进行ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定ꎬ结果显示ꎬＶＰ６０ＮＴＡ１㊁ＶＰ６０ＮＴＡ２和ＶＰ６０ＮＴＡ４３个蛋白有阳性条带ꎬ而ＶＰ６０ＮＴＡ３无条带(图１)ꎬ由此确定单抗Ａ３Ｃ识别的精确氨基酸位点为ＤＧＭＤＰＧꎬ对应的核苷酸序列为ＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴꎮＭ:蛋白质Ｍａｒｋｅｒꎻ１~４:ＶＰ６０ＮＴＡ１㊁ＶＰ６０ＮＴＡ２㊁ＶＰ６０ＮＴＡ３㊁ＶＰ６０ＮＴＡ４ꎻ５~８:ＶＰ６０ＮＴＡ１㊁ＶＰ６０ＮＴＡ２㊁ＶＰ６０ＮＴＡ３㊁ＶＰ６０ＮＴＡ４ꎮ图１㊀ＶＰ６０ＮＴＡ１㊁ＶＰ６０ＮＴＡ２㊁ＶＰ６０ＮＴＡ３㊁ＶＰ６０ＮＴＡ４蛋白的ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳及ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定Ｆｉｇ.１㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＶＰ６０ＮＴＡ１ꎬＶＰ６０ＮＴＡ２ꎬＶＰ６０ＮＴＡ３ꎬＶＰ６０ＮＴＡ４ｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙＳＤＳ￣ＰＡＧＥａｎｄＷｅｓｔ￣ｅｒｎｂｌｏｔ２.２㊀重组转移载体和重组穿梭载体的鉴定以重组质粒ｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０为模板扩增得到缺失Ａ３Ｃ识别表位的杆状病毒重组转移载体ｐＦａｓｔ￣ｂａｃ１￣ＶＰ６０әＡ３Ｃꎬ大小约６０００ｂｐ(图２Ａ)ꎮ经测序验证后将ｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ转化大肠杆菌ＤＨ１０Ｂａｃꎬ提取阳性质粒用引物Ｍ１３￣Ｆ/Ｍ１３￣Ｒ进行ＰＣＲ鉴定ꎬ扩增产物大小约为４０００ｂｐꎬ而阴性对照扩增产物大小约为３００ｂｐꎬ表明成功获得重组穿梭载体Ｂａｃｍｉｄ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ(图２Ｂ)ꎮ２.３㊀ＲＴ￣ＰＣＲ鉴定重组病毒的表达按Ｔｒｉｚｏｌ法提取接种ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ的Ｓｆ９细胞总ＲＮＡꎬ以ＶＰ６０￣Ｆ/ＶＰ６０￣Ｒ为引物进行ＲＴ￣ＰＣＲ扩增ꎬ鉴定ｍＲＮＡꎮ结果显示ꎬ出现大小约为１８００Ｍ１和Ｍ２:ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:ｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０ꎻ２:ｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０әＡ３Ｃꎻ３~６:ｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０әＡ３Ｃꎻ７:阴性对照ꎮ图２㊀杆状病毒重组质粒ｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ和Ｂａｃｍｉｄ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ的鉴定Ｆｉｇ.２㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＦａｓｔｂａｃ１￣ＶＰ６０әＡ３ＣａｎｄＢａｃｍｉｄ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃｂｐ的电泳条带(图３)ꎬ大小与目的基因近似ꎬ表明ＶＰ６０әＡ３Ｃ基因得到表达ꎮＭ:ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞ꎮ图３㊀ＶＰ６０әＡ３Ｃ基因在Ｓｆ９细胞中的表达Ｆｉｇ.３㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＰ６０әＡ３ＣｇｅｎｅｉｎＳｆ９ｃｅｌｌｓ２.４㊀间接免疫荧光检测(ＩＦＡ)将ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ感染Ｓｆ９细胞２４ｈ后ꎬ以１Ｄ４单抗(１ʒ２００)为一抗ꎬ羊抗鼠ＦＩＴＣ￣ＩｇＧ(１ʒ５０)为二抗进行ＩＦＡ检测ꎮ结果显示ꎬ感染ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ的Ｓｆ９细胞可见很强的特异性荧光ꎬ而阴性对照无特异性荧光出现(图４)ꎬ说明ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白有效表达ꎮ２.５㊀ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ￣Ｂｌｏｔ鉴定将ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ感染Ｓｆ９细胞７２ｈ后ꎬ以１Ｄ４单抗(１ʒ１０００)为一抗ꎬ羊抗鼠ＨＲＰ￣ＩｇＧ(１ʒ１００００)为二抗ꎬ进行ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定ꎮＰＶＤＦ膜经显色后出现相对分子质量为６ˑ１０４的条带(图５)ꎬ与预期一致ꎬ结果表明ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白有效表达ꎮ１１５刘维龙等:Ｎ端Ｂ细胞表位缺失的兔出血症病毒ＶＰ６０蛋白的表达及其免疫原性Ａ:感染ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ的Ｓｆ９细胞ꎻＢ:感染野生型毒株的Ｓｆ９细胞ꎮ图４㊀间接免疫荧光检测ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白的表达Ｆｉｇ.４㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＰ６０әＡ３Ｃｐｒｏｔｅｉｎｂｙｉｎ￣ｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎＭ:蛋白质Ｍａｒｋｅｒꎻ１:感染野生型毒株的Ｓｆ９细胞ꎻ２:感染ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ的Ｓｆ９细胞ꎮ图５㊀ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白的表达Ｆｉｇ.５㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＰ６０әＡ３ＣｐｒｏｔｅｉｎｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ２.６㊀表达蛋白的血凝效价测定将ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃ感染Ｓｆ９细胞４ｄ后ꎬ以９６孔 Ｕ 形血凝板对表达产物进行血凝效价测定ꎮ结果表明ꎬＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白能凝集人１％Ｏ型红细胞悬液ꎬ血凝效价为１ʒ４０９６ꎬ表明ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白高效表达ꎮ２.７㊀电镜观察电镜观察结果表明ꎬＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白可形成大小为３５~４０ｎｍ㊁形态和结构与兔出血症病毒ＶＰ６０蛋白类似的ＶＬＰｓꎬ说明缺失Ａ３Ｃ识别表位不影响ＶＰ６０蛋白病毒样颗粒的组装(图６)ꎮ２.８㊀免疫原性检测将ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白进行纯化后免疫ＲＨＤＶ血Ａ:ＲＨＤＶＶＰ６０病毒样颗粒ꎻＢ:ＶＰ６０әＡ３Ｃ病毒样颗粒ꎮ图６㊀ＲＨＤＶＶＰ６０蛋白和ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白病毒样颗粒的电镜观察Ｆｉｇ.６㊀ＲＨＤＶＶＰ６０ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＶＰ６０әＡ３Ｃｐｒｏｔｅｉｎｖｉｒｕｓ￣ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｕｎｄｅｒｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ清阴性的新西兰兔ꎬ１４ｄ后进行攻毒ꎬ检验重组蛋白对家兔的免疫保护作用ꎮ结果显示ꎬ以红细胞吸附释放法获得纯化的ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白ꎬ经蛋白质定量后以每只２００μｇ的剂量免疫新西兰兔ꎬ然后以ＲＨＤＶＷＦ株攻毒ꎬ免疫组家兔获得１００％保护ꎬ而注射生理盐水的对照组家兔全部死亡(表３)ꎬ表明ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白具有良好的免疫原性ꎮ表３㊀ＶＰ６０әＡ３Ｃ蛋白的免疫原性Ｔａｂｌｅ３㊀ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅＶＰ６０әＡ３Ｃｐｒｏｔｅｉｎ项目存活数/攻毒数保护率(％)免疫组５/５１００对照组０/５０３㊀讨论目前尚未建立天然ＲＨＤＶ的体外培养系统ꎬ病毒难以在体外稳定增殖ꎬ因此国内外新型疫苗的研究主要将ＶＰ６０蛋白作为ＲＨＤＶ的免疫保护性抗原分子ꎮ目前ＶＰ６０已在杆状病毒㊁酵母㊁大肠杆菌㊁乳酸杆菌㊁痘病毒等多种系统中表达并开展免疫原性研究[１０￣１５]ꎬ且以杆状病毒表达系统研究较多ꎮ另外也有利用杆状病毒表达系统进行以ＶＰ６０为载体研究外源表位免疫原性的报道[１６]ꎮ该系统表达效率较高ꎬ可以实现外源蛋白的全悬浮细胞培养表达ꎬ且已有商品化疫苗产品上市ꎮ现有研究结果表明ＶＰ６０蛋白可分为ＮＴＡ区㊁Ｓ区和Ｐ区ꎬＮＴＡ区位于ＶＰ６０蛋白的Ｎ端[１７]ꎮＶＰ６０蛋白形成的ＶＬＰｓ结构中ꎬＮ端位于ＶＬＰｓ内２１５江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第３期部ꎬ而Ｃ端位于外表面ꎬ是受体结合区域和中和表位所在区域[１７]ꎬ且ＶＰ６０氨基酸的一些改变并不影响ＶＬＰｓ的形成[１６ꎬ１８]ꎮ本实验室在前期研究中发现了ＶＰ６０Ｎ端存在一个免疫原性强但不具有中和活性的Ｂ细胞表位ꎬ由单抗Ａ３Ｃ识别ꎬ并已进行了模糊定位[７]ꎮ本研究在此基础上首先精确定位了单抗Ａ３Ｃ识别的Ｂ细胞表位ꎬ构建了该表位缺失的重组杆状病毒ｒＢａｃ￣ＶＰ６０әＡ３Ｃꎬ其感染Ｓｆ９细胞后表达的缺失Ａ３Ｃ识别表位的ＶＰ６０蛋白可自组装成ＶＬＰｓꎬ表明该表位的缺失不影响病毒样颗粒的形成ꎮ将表达蛋白纯化后免疫新西兰兔ꎬ可以完全保护家兔免受ＧＩ.１型强毒株的感染ꎬ表明表位缺失的ＶＰ６０蛋白依然具有良好的免疫原性ꎬ是一种优良的兔出血症候选疫苗分子ꎮ感染幼兔是ＧＩ.１型兔出血症重要的传染源之一ꎬ由于目前无法区分ＧＩ.１型疫苗免疫和病毒感染ꎬ因此难以在养殖兔群中完全清除被ＲＨＤＶ感染的幼兔ꎮ本研究构建了基于表位缺失的ＶＰ６０蛋白ꎬ可用于制备一种基于表位缺失的兔出血症标记疫苗ꎬ后续建立检测该表位抗体的ＥＬＩＳＡ检测技术ꎬ有望实现ＧＩ.１型兔出血症疫苗免疫和病毒感染的鉴别ꎬ为兔出血症的防控提供新的技术产品ꎮ参考文献:[１]㊀ＡＢＲＡＮＴＥＳＪꎬＶＡＮ￣ＤＥＲ￣ＬＯＯＷꎬＬＥ￣ＰＥＮＤＵＪꎬｅｔａｌ.Ｒａｂｂｉｔｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅ(ＲＨＤ)ａｎｄｒａｂｂｉｔｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉ￣ｒｕｓ(ＲＨＤＶ):ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１２ꎬ４３(１):１２.[２]㊀ＰＡＴＥＬＫＫꎬＳＴＲＩＶＥＴꎬＨＡＬＬＲＮꎬｅｔａｌ.Ｃｒｏｓｓ￣ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬｉｎ￣ｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｃａｓｅｆａｔａｌｉｔｙｒａｔｅｓｉｎｗｉｌｄＥｕｒｏｐｅａｎｒａｂｂｉｔｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎ￣ｔａｌｌｙｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｂｂｉｔｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].ＴｒａｎｓｂｏｕｎｄａｒｙａｎｄＥｍｅｒｇｉｎｇＤｉｓｅａｓｅｓꎬ２０２２ꎬ６９(５):ｅ１９５９￣ｅ１９７１.[３]㊀ＯᶄＣＯＮＮＯＲＴＷꎬＲＥＡＤＡＪꎬＨＡＬＬＲＮꎬｅｔａｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｃｒｏｓｓ￣ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕ￣ｓｅｓ￣ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｒａｂｂｉｔｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓ(Ｂａｓｅｌ)ꎬ２０２２ꎬ１０(５):６６６.[４]㊀宋艳华ꎬ胡㊀波ꎬ范志宇ꎬ等.兔出血症病毒２型ＳＣ株ＶＰ６０基因工程疫苗研制及其与传统兔出血症病毒疫苗的交叉保护作用[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０２２ꎬ５０(１６):５０￣５４.[５]㊀ＨＵＢꎬＷＥＩＨꎬＦＡＮＺꎬｅｔａｌ.Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆｒａｂｂｉｔｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ２ｉｎＣｈｉｎａｉｎ２０２０[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ７(１):２３６￣２３９.[６]㊀ＭＡＴＴＨＡＥＩＭꎬＫＥＲＲＰＪꎬＲＥＡＤＡＪꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｑｕａｎ￣ｔｉｔａｔｉｖｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｒａｂｂｉｔｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓｅｓｉｎｒａｂｂｉｔｋｉｔｔｅｎｓ[Ｊ].ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１４ꎬ１１:１０９.[７]㊀杨廷亚ꎬ王㊀芳ꎬ姜㊀平ꎬ等.应用噬菌体展示技术筛选兔出血症病毒抗原模拟表位[Ｊ].畜牧兽医学报ꎬ２０１２ꎬ４３(８):１２８１￣１２８６.[８]㊀中华人民共和国农业部.兔病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法:ＮＹ/Ｔ５７２－２０１６[Ｓ].北京:中国农业出版社ꎬ２０１６. [９]㊀左园园.兔出血症病毒衣壳蛋白与组织血型抗原结合域的筛选与鉴定[Ｄ].南京:南京农业大学ꎬ２０１７.[１０]ＧＵＯＨꎬＺＨＵＪꎬＴＡＮＹꎬｅｔａｌ.Ｓｅｌｆ￣ａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｖｉｒｕｓ￣ｌｉｋｅｐａｒｔｉ￣ｃｌｅｓｏｆｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｔｈｅｉｒｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｉｎｒａｂｂｉｔｓ[Ｊ].ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１６ꎬ１３１:８５￣９１.[１１]ＷＡＮＧＬꎬＸＩＡＴꎬＧＵＯＴꎬｅｔａｌ.ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎＶＰ６０ｃａｎｓｅｒｖｅａｓｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓｉｎｒａｂｂｉｔｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓ(Ｂａｓｅｌ)ꎬ２０１９ꎬ７(４):１７２.[１２]ＬＩＵＣꎬＬＩＮＭꎬＨＵＨꎬｅｔａｌ.ＲａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓＶＰ６０ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｗｉｎｅｐｏｘｖｉｒｕｓｓｅｌｆ￣ａｓｓｅｍ￣ｂｌｅｓｉｎｔｏｖｉｒｕｓ￣ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｉｔｈｓｔｒｏｎｇｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｉｎｒａｂｂｉｔｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０２２ꎬ１３:９６０３７４.[１３]ＤＡＬＴＯＮＫＰꎬＡＬＶＡＲＡＤＯＣꎬＲＥＹＴＯＲＥꎬｅｔａｌ.ＣｈｉｍｅｒｉｃＶＬＰｓｂｅａｒｉｎｇＶＰ６０ｆｒｏｍｔｗｏｓｅｒｏｔｙｐｅｓｏｆｒａｂｂｉｔｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓ￣ｅａｓｅｖｉｒｕｓａｒｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇａｉｎｓｔｂｏｔｈｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓ(Ｂａ￣ｓｅｌ)ꎬ２０２１ꎬ９(９):１００５.[１４]ＭＵＬＬＥＲＣꎬＵＬＲＩＣＨＲꎬＳＣＨＩＮＫＯＴＨＥＪꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ￣ｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｈｕｍｏｒａｌａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｇａｉｎｓｔＲＨＤＶ２ｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｎｅｗｖａｃｃｉｎｅｂａｓｅｄｏｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｕｌｏｖ￣ｉｒｕｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅꎬ２０１９ꎬ３７(３０):４１９５￣４２０３.[１５]ＱＩＲꎬＭＩＡＯＱꎬＺＨＵＪꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｎｏｖｅｌｂｉｖａｌｅｎｔｖｉｒｕｓ￣ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｂｅａｒｉｎｇＶＰ６０ｇｅｎｅｓｏｆｃｌａｓｓｉｃＲＨＤＶ(ＧＩ.１)ａｎｄＲＨＤＶ２(ＧＩ.２)[Ｊ].ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ２４０:１０８５２９.[１６]ＺＡＭＯＲＡ￣ＣＥＢＡＬＬＯＳＭꎬＭＯＲＥＮＯＮꎬＧＩＬ￣ＣＡＮＴＥＲＯＤꎬｅｔａｌ.Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｍｕｌｔｉ￣ｔａｒｇｅｔｃｈｉｍｅｒｉｃＲＨＤＶｖｉｒｕｓ￣ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇｆｏｒｅｉｇｎＢ￣ｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓ(Ｂａｓｅｌ)ꎬ２０２２ꎬ１０(２):２２９.[１７]ＷＡＮＧＸꎬＸＵＦꎬＬＩＵＪꎬｅｔａｌ.Ａｔｏｍｉｃｍｏｄｅｌｏｆｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇ￣ｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓｂｙｃｒｙｏ￣ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０１３ꎬ９(１):ｅ１００３１３２.[１８]ＣＨＥＮＭꎬＳＯＮＧＹꎬＦＡＮＺꎬｅｔａｌ.Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅ￣ｃｏｍｂｉｎａｎｔｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ￣ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｃａｒｒｙｉｎｇＣＤ８＋Ｔｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｏｖａｌｂｕｍｉｎ(ＯＶＡ)[Ｊ].ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１４ꎬ１８３:１５￣２２.(责任编辑:成纾寒)３１５刘维龙等:Ｎ端Ｂ细胞表位缺失的兔出血症病毒ＶＰ６０蛋白的表达及其免疫原性。
执业兽医资格考试免疫学8病毒各论
五、鸭瘟病毒（Duck plague virus）
形态 分子特征 抗原特性：病毒只有一个血清型，但毒力有差异 致病特性 肠炎、脉管炎及广泛的局灶性坏死。 诊断 荧光抗体，分离病毒等；特征性症状:食道黏膜上 有呈条纹纵向排列的黄色假膜
第4节 腺病毒科 （Adenoviridae）
痘病毒科 非洲猪瘟病毒科 疱疹病毒科 腺病毒科 细小病毒科 圆环病毒科 反转录病毒 科呼肠孤病毒科 双RNA病毒
副黏病毒科 弹状病毒科 正黏病毒科 冠状病毒科 动脉炎病毒科 微RNA病毒科 嵌杯病毒科 黄病毒科 朊病毒
非洲猪瘟病毒科
痘病毒科
虹彩病毒科
细小病毒科
多瘤病毒科科
基因组为线状双股DNA 痘病毒科 非洲猪瘟病毒科 疱疹病毒科 腺病毒科 虹彩病毒科
环状双股DNA病毒 线头病毒科 杆状病毒科 多瘤病毒科 乳头瘤病毒科
痘病毒科 绵羊痘病毒与山羊痘病毒 黏液瘤病毒 非洲猪瘟病毒科 非洲猪瘟病毒
疱疹病毒科 伪狂犬病毒 牛传染性鼻气管炎病毒 马立克氏病病毒 禽传染性喉气管炎病毒 鸭瘟病毒
自然感染仅感染山羊， 形态： 分子特征：单股RNA 抗原特性 致病特性 诊断：琼扩
三、马传染性贫血病毒
形态：有囊膜 分子特征：单股RNA 抗原特性：8个血清型 致病特性： 诊断：补体结合试验，琼扩
第8节
呼肠孤病毒科ຫໍສະໝຸດ 禽正呼肠孤病毒 蓝舌病毒 质型多角体病毒
一、禽正呼肠孤病毒
第1节
痘病毒科（Poxviridae）
绵羊痘病毒与山羊痘病毒 黏液瘤病毒
一、绵羊痘病毒与山羊痘病毒
兽医微生物学教学课件-12.病毒总论2014
（3）分子量小，基因组结构简单，所含基因组数目少。
（4）病毒基因组核酸复制和转录多样化
（5） 病毒核酸更易受宿主细胞的影响而发生基 因突变和重组
（6）有些病毒去除囊膜和衣壳，裸露的DNA或 RNA也能感染细胞，这样的核酸称为传染性核酸。
具备条件：
➢ 病毒核酸能作为mRNA或者能利用宿主细胞的 RNA聚合酶转录病毒的mRNA
2. 结构蛋白：系指构成一个形态成熟的有感染性 的病毒颗粒所必需的蛋白质。是构成病毒衣壳 的全部成分和囊膜的主要成分。
蛋白质功能：
➢ 保护病毒核酸，使其免受核酸酶或其它理化因 素的破坏。
➢ 参与病毒感染细胞的过程，决定病毒对宿主细 胞的亲嗜性。
➢ 抗原性：诱导特异性抗体、致敏淋巴细胞。
（三）脂类、糖类
从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制和病毒蛋白合成， 至释放出子代病毒的全过程，称为一个复制周期。
病毒的复制周期主要包括吸附和穿入、脱壳、生物合成、组 装和释放四个连续步骤。
复制周期
病毒的一步生长曲线
感染比（multiplicity of infection,MOI）：指一个系统中感染病 毒的细胞数与细胞总数之比。
➢主要存在于囊膜中，脂溶剂可去除囊膜，使病毒 丧失活性(有些病毒可能仍具感染活性)。
➢来自宿主细胞，与囊膜病毒的吸附和穿入宿主细 胞的作用有关。
第二节 病毒的分类
国际 病 毒 分 类 委员会 (International Committee on Taxonmy of Viruses,ICTV)是国际公认的病 毒分类与命名的权威机构。
腺病毒 乳头瘤病毒
乙肝病毒 细小病毒
正链RNA病毒的大小与形态
冠状病毒
砂粒病毒
兽医病毒学课件：病毒学各论
也可采用鸡胚成纤维细胞分离。 血清学试验 HA-HI、ELISA等
血凝试验 血凝抑制试验
（3）防制
弱毒苗：Ⅰ（中等毒力）；
Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ系（低毒力）。
油佐剂灭活苗
7.禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）
（1）主要特性
副粘病毒科，腮腺炎病毒属，单负股RNA，不分节段。有 囊膜，表面有纤突，纤突有两种糖蛋白：血凝素神经氨酸 酶（HN）及融合蛋白（F）。HN介导病毒的细胞吸附；F 蛋白与病毒的感染性有关，活化后可导致病毒与细胞融合。
可在鸡胚上生长，能凝集鸡的红细 胞，并被相应的抗血清所抑制。
（2）实验室诊断
引起“猪蓝耳病”，危害种猪、繁殖母猪和仔猪 动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，单正股RNA，有囊膜 诊断：
（1）分离培养：较困难，仅在猪肺巨噬细胞和Vero细胞生长 （2）血清学试验：ELISA 防制：灭活苗、基因缺失苗进行预防接种
5.猪细小病毒（ Porcine parvovirus,PPV)
SAT2、SAT3及亚洲1型，各型间 无交叉免疫性。 口蹄疫病毒对酸敏感
（2）实验室诊断
⒈ 病毒分离 采集病舌面或蹄部水泡皮或水泡液。 ⑴ 实验动物：乳鼠敏感。 ⑵ 细胞培养：BHK-21高度敏感。
⒉ 血清学试验 ELISA、中和试验等。
（3）防制
1. 严格检疫，上报疫情； 2. 疫区周边畜群采取免疫接种措施。
主要侵害鸡，是最常见的鸡或火 鸡淋巴组织增生性疾病以外周神 经、虹膜、各种脏器、肌肉和皮 肤的单核细胞浸润为特征。
（1）主要特性
疱疹病毒科，甲亚科基因组为dsDNA，在鸡胚和鸭胚 成纤维细胞中均能生长。
南农大动物医学院基础兽医专题科目 考试资料
1、陈秋生生殖干细胞（PGCs）的迁移：生殖干细胞的功能是不断分化产生配子细胞。
生殖干细胞的决定都发生在胚胎发育早期的特定部位，而且这些干细胞普遍存在向生殖腺发生部位（原基）迁移的现象。
对于两栖动物：生殖干细胞的发生部位定位于卵细胞的植物极胚胎发生后，PGCs首先在幼体胚胎的后肠中集中；腹腔形成时，沿肠系膜经间质组织向腹壁迁移（分裂3次）；大约有30个PGCs到达生殖嵴，并开始诱发生殖腺的发育。
PGCs的迁移与间质组织中的纤连蛋白的导向作用有关。
对于鸟类和爬行类：PGCs的发生定位在胚体与胚外器官交界的生殖新月区。
PGCs的迁移通过血液运输方式进行。
可能有两种因素决定PGCs对生殖嵴的特异识别：（1）生殖嵴释放某种成分吸引PGCs；（2）两者之间存在特异的表面识别机制。
对于哺乳动物：以团聚方式通过非循环途径迁移。
间质对迁移具有导向作用。
鼠胚7 d 时8 个嗜碱性细胞出现在原条后端的胚外间质组织；7.5 d 时PGCs集聚于尿囊，并开始迁移到邻近卵黄囊中；分成左、右两组，从尾部沿后肠穿过背部间质，11 d 时分别进入左、右生殖嵴，2500－5000个PGCs。
细胞周期的调控：CDK激酶对细胞周期起着核心调控作用。
不同CDK 在细胞周期的不同时期表现出活性，从而对细胞周期的不同时期进行调节。
1、G2—M期转化的调控：CDK1激酶的调控作用是关键。
P34cdc2（或p34cdc28）在细胞周期中的含量相对稳定，而周期蛋白B的含量呈周期性变化，所以，CDK1激酶活性依赖于周期蛋白B含量的积累。
CDK1激酶可使某些蛋白底物磷酸化，进而改变这些蛋白质的结构，启动或关闭其功能，实现CDK调控细胞周期的目的。
2、分裂中期-后期转化：细胞周期运转到分裂中期后，M期周期蛋白B通过泛素化途径迅速降解，CDK1激酶活性丧失，被CDK1激酶磷酸化的蛋白去磷酸化,细胞周期便从M期中期向后期转化.3 G1—S期转化的调控到达S期的一定时期，G1期周期蛋白也是通过泛素化途径降解，但与M期周期蛋白的降解有所不同：无破坏框，但PEST序列促进cyclin 的降解。
猪蓝耳病与圆环病毒病免疫防控中存在的问题与对策
猪蓝耳病与圆环病毒病免疫防控中存在的问题与对策
姜平
南京农业大学动物医学院／农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京２１００９５
１ 蓝耳病和圆环病毒病的危害
１．１ 国内外蓝耳病和圆环病毒病的危害
在美国、欧洲等地几乎没有猪瘟和口蹄疫，蓝耳
病和圆环病毒病是困扰这些地区的两大重要疾病。
据
美国相关部门的统计，２００５年美国因为蓝耳病造成
的损失在５．６亿美元，２０１１年损失６．６４亿美元，这
个数字很明显在增加。
为了控制这２个病的发生和流
行，投入的生物安全成本高达４．７亿美元。
１９９６年，
我国北京地区第１次流行猪蓝耳病；２００１－２００３年，
蓝耳病在我国第２次广泛流行；２００６年，蓝耳病在
华东地区（湖南、江西一带）开始第３次流行。
这３
次流行都有共同的发病特点，即临床表现复杂、病毒
基因变异明显、流行中疫病呈周期性发展等。
南农415兽医基础参考书
南农415兽医基础参考书
南农415兽医基础参考书是一部关于兽医领域的专业教材，为广大兽医工作者和动物医学专业学生提供了宝贵的参考资料。
本书详细阐述了兽医基础理论、实用技能和方法，旨在提高兽医从业者的业务水平和服务质量。
书籍目录结构清晰，主要包括以下章节：
1.兽医微生物学：介绍兽医微生物的分类、形态、生长繁殖、病原性、抵抗力及消毒灭菌方法等。
2.兽医寄生虫学：涵盖寄生虫的分类、生活史、病原性、感染途径、诊断和防治方法等。
3.兽医病理学：阐述疾病的发生、发展和转归，以及病理变化和病变的诊断方法。
4.兽医临床学：介绍兽医临床检查、诊断、治疗和护理的基本方法和技术。
5.兽医流行病学：讨论兽医流行病学的调查方法、监测系统和疫情控制策略。
6.兽医公共卫生：阐述兽医公共卫生政策、法律法规、食品安全和环境保护等方面的知识。
书中所涉及的知识点具有很强的实用性，如微生物学和寄生虫学的诊断方法、病理学的病变诊断、临床学的治疗技术等，均为兽医从业者必备技能。
此外，本书还介绍了众多实际案例，有助于读者更好地理解和运用所学知识。
以书中的兽医临床学为例，通过详细讲解各种检查方法、治疗技术和护理
措施，读者可以掌握兽医临床的基本操作，提高诊疗水平。
再如，兽医流行病学章节，可以帮助读者了解疫情监测和控制的重要性，为预防和控制动物疫病提供科学依据。
总之，南农415兽医基础参考书是一部极具价值的兽医专业教材，适用于兽医工作者、动物医学专业学生及对该领域感兴趣的读者。
＊＊农业大学动物医学兽医传染病总论讲义
＊＊农业大学动物医学兽医传染病总论讲义绪论一、动物传染病学概念〔5分钟〕动物传染病学是研究畜禽传染病发生和开展的规律及其防制措施的科学。
研究内容动物传染病的发生和开展规律以及预防和消灭传染病的一般性措施；各种动物传染病的分布、病原、流行病学、发病机理、病理变化、临诊病症、诊断和防治措施等。
二、动物传染病的危害〔5分钟〕〔一〕影响人身健康〔90年代英国疯牛病，FMD）〔二〕经济损失1.大批畜禽爆发传染病死亡，直接损失沉重；2.生产性能严重下降〔如产蛋量、产乳量、产毛量、膘情、产仔数等〕；3.影响外贸出口〔97年台湾FMD，98年香港禽流感〕；4.防治、检疫、封锁工作要消耗大量的人力和物力及财力。
三、开展史〔10分钟〕1．早期观察、探索病因和防治方法。
2．实验、创立时期：〔以Pasteur和Koch为代表〕。
3．现代成熟快速开展时期：20世纪以来，由于电子显微镜、病毒培养、无特定病原动物、抗菌药物、生物制品在兽医工作中的应用，使动物传染病学无论在理论研究或实际应用方面都获得了很大进展。
四、我国的学科成果〔10分钟〕1．马牛羊传染病牛瘟陈凌风、袁庆志等研制了牛瘟兔化弱毒、山羊化兔化弱毒、绵羊化兔化弱毒等疫苗，1956年消灭牛瘟。
牛肺疫吴庭训等1958年研制成牛肺疫兔化弱毒菌苗，1959年又研制成牛肺疫兔化绵羊适应菌苗。
马传染性贫血沈荣显等1967年研制的马传染性贫血活毒疫苗是国际上唯一的活疫苗，该成果到达国际先进水平。
其它布鲁氏菌羊种5号菌苗，猪种2号菌苗，羊痘鸡胚化弱毒疫苗、蓝舌病鸡胚化弱毒疫苗和羟胺灭活疫苗，牛流行热灭活疫苗和亚单位疫苗。
2．猪传染病猪瘟结晶紫疫苗何正礼、方时杰等选用抗原性优良的石门系毒株研究改良制成，效果明显。
中国系猪瘟兔化弱毒疫苗1955-1956年周泰冲等研制而成。
已推广到欧亚很多国家，被公认为目前世界上比拟理想的猪瘟疫苗。
3．家禽传染病方定一等于1956-1963年首次发现小鹅瘟，此为我国科学家在国际上首先发现的家禽传染病。
拒绝买卖野物——南京农大采样2000只动物，找到102种病毒
拒绝买卖野物——南京农大采样2000只动物，找到102种病毒南京农业大学动物医学院/前沿交叉研究院联合中山大学医学院等国内外单位近期发表于《细胞》杂志的一项研究发现，野生动物携带一系列令人眼花缭乱的病毒，包括许多可能感染人类的新型病毒。
科学家说，虽然没有一种病毒与引起COVID-19大流行的冠状病毒密切相关，但这项研究发出一个警告——动物界中潜伏着其他病毒的威胁。
“动物界中存在大量未经取样的病毒，极具多样性。
”哈佛大学进化生物学家William Hanage说，“我们要明白，对于一种病毒，不同的哺乳动物都差不多，只要它们的细胞有合适的受体。
”众所周知，活体动物交易市场会引发疫情，比如20年前的严重急性呼吸综合征（SARS）。
SARS暴发以后，我国一直禁止出售多种动物，但其他很多国家却并没有这么做。
由南京农业大学粟硕教授领导的研究团队从中国毛皮农场、动物园和自然栖息地的近2000只动物（涵盖18个物种）身上采集了样本，包括果子狸、貉、獾、竹鼠和豪猪等。
研究人员利用“宏基因组”（metagenomics）技术，探测病毒自我复制时产生的RNA转录本，在动物的鼻子、粪便和组织中鉴定出了来自102种病毒，分属13个病毒家族。
研究人员认为其中21种病毒对人类有“高风险”，因为它们过去曾感染过人类，或者有在物种间跳跃的历史，包括豪猪丁型冠状病毒（Deltacoronavirus HKU17），牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus 3）、哺乳动物正腮腺炎病毒5型（Mammalian orthorubulavirus 5）、H9N2亚型流感病毒(Influenza A virus H9N2)。
而其中65种病毒此前从未被描述过，为首次发现于哺乳动物中，例如：海狸鼠轮状病毒（Coypu rotavirus）、穿山甲瘟病毒（Pangolin pestivirus）、竹鼠札幌病毒（Bamboo rat sapovirus）等。
南农415兽医基础参考书
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【原创实用版】
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包含了兽医专业的基础知识，为学生提供了全面而详细的学习资料。
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新城疫病毒 犬瘟热病毒 牛瘟病毒
禽流感病毒 裂谷热病毒 克里米亚/刚果出血热病毒 汉坦病毒
布尼病毒科
弹状病毒科
狂犬病毒
丝状病毒科
砂粒病毒科
马堡病毒 埃波拉病毒属
波纳病毒科
第10节 副黏病毒科
新城疫病毒 小反刍兽疫 犬瘟热病毒
一、新城疫病毒
形态：多形性，有囊膜 分子特征：单负股RNA，纤突具有两种糖蛋白：血凝素神 经氨酸酶（HN）及融合蛋白（F）。NDV的毒力主要取决 于HN及F的裂解及活化。根据毒力可以分为：根据毒力的 差异可将NDV分成3个类型： 强毒型 中毒型 弱毒型 区分的依据病毒对一日龄雏鸡脑内接种的致病指数 （ICPI）、42日龄鸡静脉接种的致病指数（IVPI）、最小 致死量致死鸡胚的平均死亡时间（MDT）。 一般认为，MDT在68h以上、ICPI≤0.25者为弱毒株； MDT在44~70h之间、ICPI=0.6~1.8为中毒株； MDT在40~70h之间、ICPI>2.0者为强毒株。IVPI作为参考， 强毒株IVPI常大于2.0。
第八单元 主要的动物病毒
南京农业大学
张
炜
核 酸
病毒核酸分两类 DNA或RNA
二者不同时存在
注意：决定核酸是RNA还是DNA的是核苷酸的
组成，而不是一条链还是两条链
核酸分子数和股数可分
单股 或双股:
线状或环状
分节段 或不分节 段
即核酸是一个分子或 多个分子
单双股DNA或RNA
致病特性： 4种病型：内脏型；神经型；皮肤型；眼型 诊断 免疫荧光检测病毒。病毒分离
型为非致瘤毒株；3型为火鸡疱疹病毒（HVT）
肿瘤
脾脏病变，肿大
Left - normal chicken eye. Right - Eye of a chicken
四、禽传染性喉气管炎病毒
形态：有囊膜 分子特征：线状双股DNA 抗原特性：各地分离株具有广泛抗原性相似性。 致病特性 所有日龄均易感，咳嗽、气喘及流涕等。 诊断 荧光抗体；PCR
二、牛传染性鼻气管炎ຫໍສະໝຸດ 毒IBRV
形态：20面体对称，有囊膜。 分子特征：线状双链DNA 抗原特性：只有一个血清型。 致病特性：主要有呼吸道和生殖道两种表现。 诊断：测抗体或PCR检测病原，也可病毒分离
三、马立克病病毒（Marek’s disease virus）
形态：20面体对称，有囊膜。 分子特征：线状双链DNA 抗原特性：3个血清型。1型为致肿瘤毒株；2
第1节
痘病毒科（Poxviridae）
绵羊痘病毒与山羊痘病毒 黏液瘤病毒
一、绵羊痘病毒与山羊痘病毒
形态:有囊膜。 分子特征：双股DNA 抗原特性：两者之间有共同抗原 致病特性:自然情况下绵羊痘病毒只感染绵羊，山 羊痘病毒只感染山羊 诊断：可根据临床诊断
二、黏液瘤病毒
第9节
双RNA病毒
传染性法氏囊病病毒
传染性法氏囊病病毒
形态：无囊膜，二十面体对称。 分子特征：双股双节RNA病毒 抗原特性：两个血清型。 致病特性： 幼龄鸡多发，侵害法氏囊，可致免疫抑制。 诊断：免疫荧光抗体，病毒分离
单负股病毒目
分节段的负股RNA病毒
副黏病毒科
正黏病毒科
自然感染仅感染山羊， 形态： 分子特征：单股RNA 抗原特性 致病特性 诊断：琼扩
三、马传染性贫血病毒
形态：有囊膜 分子特征：单股RNA 抗原特性：8个血清型 致病特性： 诊断：补体结合试验，琼扩
第8节
呼肠孤病毒科
禽正呼肠孤病毒 蓝舌病毒 质型多角体病毒
一、禽正呼肠孤病毒
一、猪细小病毒（Porcine parvovirus）
形态：无囊膜，20面体对称 分子特征：单股线状DNA 抗原特性：只有一个血清型 致病特性 初产母猪流产、死产，胚胎死亡和病毒血症，母 猪本身无症状。易引致慢性排毒的持续性感染 诊断 荧光抗体，PCR；抗体诊断价值不大。
二、犬细小病毒（Canine parvovirus）
第13节 冠状病毒科 （Coronaviridae）
禽传染性支气管炎病毒 猪传染性胃肠炎病毒
100nm
一、禽传染性支气管炎病毒
形态：有囊膜，多形性，面有松散、均匀排列呈皇冠状。 分子特征：冠状病毒属，单分子线状正链单股RNA 抗原特性：复制中易发生突变和高频重组，血清型众多。 致病特性：主要感染鸡。可急性暴发，1~4周龄雏鸡最易 感，表现为气喘、咳嗽及呼吸抑制，并可突然死亡。青年 鸡的感染率通常为25%~30%，高者可达75%。 诊断：免疫荧光，RT-PCR
抗原特性:只有一个血清型 致病特性：主要通过气雾、食物和饮水传播。 诊断：RT-PCR,分离病毒，HI，分离株要进行毒 力试验
新城疫后期出现神经症状,且并发鼻炎
发病后出现大量白皮蛋
新城疫病鸡喉头和气管粘膜充血、出血
病鸡腺胃乳头出血
二、小反刍兽疫（Peste des petits ruminants virus, PPRV）
圆环病毒科
嗜肝病毒科
疱疹病毒科
乳头瘤病毒科
腺病毒科
正粘病毒科
砂粒病毒科
布尼病毒科
反录病毒科
呼肠孤病毒科
副粘病毒科
弹状病毒科
波纳病毒科
丝状病毒科 双RNA病毒科
嵌杯病毒科
星状病毒科
微RNA病毒科
冠状病毒科
动脉炎病毒科
披膜病毒科
黄病毒科
图21-7 脊椎 病毒分类图解（据ICTV第8次分类报告修改）
双股DNA病毒
犬传染性肝炎病毒 减蛋综合征病毒
一、犬传染性肝炎病毒（Infectious canine hepatitis virus，ICHV）
形态：无囊膜，20面体对称 分子特征：线状双股DNA 抗原特性：2种血清型，之间有高度交叉 致病特性： 通过尿、粪吸唾液排毒，感染内皮及实质细胞 诊断 ELISA， HA-HI、中和试验及PCR
50nm
图31-1 狂犬病毒的电镜图片（据Murphy）
二、牛暂时热病毒
病毒以库蠓等节肢动物传播媒介。
第12节 正黏病毒科
禽流感病毒
禽流感病毒（Avian influenzavirus,AIV）
形态：AIV具有多种形态。 分子特征：AIV为甲型流感病毒属，负股RNA，分8个节 段。表面有两种纤突，血凝素（HA）和神经氨酸酶 （NA）。 抗原特性：两类重要的抗原，表面抗原：血凝素（HA） 和神经氨酸酶（NA）。为主要的分型依具。型特异性抗 原：由核蛋白和基质蛋白构成，它是所有的亚型和禽流感 病毒所共有。 致病特性：高致病力毒株一低致病力毒株的H裂解位点的 氨基酸序列有关。 诊断：HA-HI, ELISA,RT-PCR
第11节 弹状病毒科 （Rhabdoviridae）
狂犬病病毒
狂犬病毒（Rabies virus）
形态：成熟的病毒粒子呈子弹状。有囊膜。 分子特征：单负股RNA 抗原特性：4个血清型和3个待定型的病毒株。 致病特性：主要传播途径为带毒动物咬伤。 诊断：Negri小体，RT-PCR。
五、鸭瘟病毒（Duck plague virus）
形态 分子特征 抗原特性：病毒只有一个血清型，但毒力有差异 致病特性 肠炎、脉管炎及广泛的局灶性坏死。 诊断 荧光抗体，分离病毒等；特征性症状:食道黏膜上 有呈条纹纵向排列的黄色假膜
第4节 腺病毒科 （Adenoviridae）
形态： 分子特征： 抗原特性 致病特性 诊断：病毒分离，琼扩
二、蓝舌病毒
是绵羊的主要传染病之一 形态：无囊膜 分子特征：双股RNA，10个节段 抗原特性：25个血清型 致病特性：由库蠓传播。绵羊感染后，高热，充 血。 诊断：临诊结合病毒分离。
三、质型多角体病毒
是家蚕的病原 形态： 分子特征 抗原特性 致病特性 诊断
形态:无囊膜，直径17nm，是目前发现的最小的 动物病毒。 分子特征:双义单链环状DNA 抗原特性：分为PCV1型和PCV2型两个血清型。 致病特性：PCV2为主要致病型，PCV2感染所致 疾病称为断奶猪多系统衰竭综合征，还可致繁殖 障碍、皮炎与肾病综合征、呼吸道疾病等 诊断： 临床症状，PCR，病毒分离（无细胞病变）
ASFV是唯一已知的核酸为DNA的虫媒病毒， 由软蜱（Ornithodoros）传递，
第3节 疱疹病毒科
伪狂犬病毒 牛传染性鼻气管炎病毒 马立克病病毒 禽传染性喉气管炎病毒 鸭瘟病毒
一、伪狂犬病毒（Pseudorabies virus）
猪为原始宿主，可感染马、牛、绵羊等 形态：有囊膜 分子特征：线状双股DNA 抗原特性：只有一个血清型 致病特性：可引起流产 诊断：ELISA测抗体，区分感染与免疫；PCR检 测病原
四、猫泛白细胞减少症病毒
旧名猫瘟热病毒，又称猫全白细胞减少症病毒。 猫科动物对本病毒均易感，分布遍及全世界，是 感染猫科动物的最重要的病毒。
五、貂肠炎病毒 六、貂阿留申病毒
第6节 圆环病毒科 （Circoviridae）
猪圆环病毒
猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）
形态： 分子特征 抗原特性： 致病特性： 野兔和家兔易感 诊断： 接种鸡胚绒毛尿囊膜，可产生园形痘疱。