PCR技术上岗培训解析幻灯片课件
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在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念— Ct值。C代表cycle，t代表threshold，Ct值的含 义为每个反应管内荧光信号达到设定的域值时 所经历的循环数。个模板的Ct值与该模板的起 始拷贝数的对数存在线性关系，Ct值越小，起 始拷贝数越多，反之亦然。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表 起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此， 只要获得未知样品的Ct值，就可从标准曲线上 算出该样品的起始拷贝数。
标准的PCR过程分为三步
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模 板结合，形成局部双链。 3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的 活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。
短柄圆环探针荧光PCR原理
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷 酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区： 一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎 干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子பைடு நூலகம்合过程中 可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般 连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶 氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论， 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光 基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液 和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物 一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直 接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
PCR反应特点
特异性强 灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待 测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的 检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个 细菌。
简便、快速
PCR诊断试剂生产管理要点
1、应具有阳性血清（或阳性质粒）处理、 分装的隔离实验室
2、PCR试剂的生产区与检定区应严格分开 3、专用原材料
PCR引物的设计要合理、合适，引物的合 成要有固定的地方和设备，纯度能到达 一定标准
荧光定量PCR试剂的质量检查 操作程序
荧光标记
荧光发光是通过激发光激发荧光基团到 达高能量状态,而后产生发射光。常用的 有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白 DsRed 、CY3、CY5、FAM及其它荧光报 告基团
探针荧光标记及
荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5 标记探针
淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯 基）苯甲酸（DABCYL）
PCR技术
PCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的 发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就 因此于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR及其相 关技术于80年代末在国外开始应用：欧共体 （现欧盟）、日本、美国相继把PCR这一基因 诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药 品管理局已批准了60多种基因诊断试剂用于临 床，美国国家疾病控制中心已把PCR技术列入 疾病诊断的常规技术。
PCR技术上岗培训解析
几乎所有的疾病都是基因病
科学研究已证明，基因可以揭示疾病的 本质，人类几乎所有疾病都直接或间接 与基因有关，在某种意义上都是基因病，
PCR技术
1985年美国人莫里斯（Kary Mullis）发明了一 种模拟DNA体内复制过程，在体外复制特定 DNA片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反 应（PolymeraseChain Reaction，PCR）。PCR 可以在短时间内倍增极微量DNA （理论上说, 仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过PCR 可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量 特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性， 可用于微量核酸样品的检测。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增 加一倍。
荧光PCR检测技术简介
荧光PCR检测技术是在传统PCR技术基础上，加入荧光 标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出 荧光信号，再通过专门的仪器（荧光PCR仪）对荧光信 号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出 目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统PCR检测 相比，荧光PCR检测技术不仅实现了PCR检测从定性到 定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决PCR污 染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光PCR检测技 术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成为最具代 表性的PCR检测技术，为PCR检测技术临床应用打开了 方便之门，现已得到广泛应用。
影响分子信标的主要因素
分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响 分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团 与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。
另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较 低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温 度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸 展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而 发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温 度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度
实时荧光PCR结果判读
荧光PCR试剂盒检测结果
荧光域值（threshold）的设定
PCR反应管的前15个循环的荧光信 号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR315个循环荧光信号标准差的10倍，即： threshold=10×sd cycle6-15.荧光域值设 定在PCR扩增的指数期。
Ct值
标准的PCR过程分为三步
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模 板结合，形成局部双链。 3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的 活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。
短柄圆环探针荧光PCR原理
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷 酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区： 一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎 干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子பைடு நூலகம்合过程中 可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般 连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶 氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论， 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光 基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液 和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物 一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直 接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
PCR反应特点
特异性强 灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待 测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的 检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个 细菌。
简便、快速
PCR诊断试剂生产管理要点
1、应具有阳性血清（或阳性质粒）处理、 分装的隔离实验室
2、PCR试剂的生产区与检定区应严格分开 3、专用原材料
PCR引物的设计要合理、合适，引物的合 成要有固定的地方和设备，纯度能到达 一定标准
荧光定量PCR试剂的质量检查 操作程序
荧光标记
荧光发光是通过激发光激发荧光基团到 达高能量状态,而后产生发射光。常用的 有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白 DsRed 、CY3、CY5、FAM及其它荧光报 告基团
探针荧光标记及
荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5 标记探针
淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯 基）苯甲酸（DABCYL）
PCR技术
PCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的 发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就 因此于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR及其相 关技术于80年代末在国外开始应用：欧共体 （现欧盟）、日本、美国相继把PCR这一基因 诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药 品管理局已批准了60多种基因诊断试剂用于临 床，美国国家疾病控制中心已把PCR技术列入 疾病诊断的常规技术。
PCR技术上岗培训解析
几乎所有的疾病都是基因病
科学研究已证明，基因可以揭示疾病的 本质，人类几乎所有疾病都直接或间接 与基因有关，在某种意义上都是基因病，
PCR技术
1985年美国人莫里斯（Kary Mullis）发明了一 种模拟DNA体内复制过程，在体外复制特定 DNA片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反 应（PolymeraseChain Reaction，PCR）。PCR 可以在短时间内倍增极微量DNA （理论上说, 仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过PCR 可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量 特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性， 可用于微量核酸样品的检测。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增 加一倍。
荧光PCR检测技术简介
荧光PCR检测技术是在传统PCR技术基础上，加入荧光 标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出 荧光信号，再通过专门的仪器（荧光PCR仪）对荧光信 号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出 目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统PCR检测 相比，荧光PCR检测技术不仅实现了PCR检测从定性到 定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决PCR污 染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光PCR检测技 术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成为最具代 表性的PCR检测技术，为PCR检测技术临床应用打开了 方便之门，现已得到广泛应用。
影响分子信标的主要因素
分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响 分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团 与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。
另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较 低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温 度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸 展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而 发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温 度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度
实时荧光PCR结果判读
荧光PCR试剂盒检测结果
荧光域值（threshold）的设定
PCR反应管的前15个循环的荧光信 号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR315个循环荧光信号标准差的10倍，即： threshold=10×sd cycle6-15.荧光域值设 定在PCR扩增的指数期。
Ct值