PCR技术上岗培训解析幻灯片课件
合集下载
第二章-PCR技术ppt课件
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
pcr培训ppt课件
实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程 中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
pcr ppt课件教程
引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。
pcr技术课件ppt简短
通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。
PCR技术上岗培训
扩增效率低的问题及解决方案
总结词
扩增效率低可能是由于多种原因， 如引物设计，确保引物特异性； 提高模板浓度；检查酶活性，确保 酶处于有效范围内。
预防措施
在实验前进行充分的引物和酶活性 检查，确保实验条件最佳。
非特异性扩增问题及解决方案
总结词
非特异性扩增是指PCR产物中出 现非特异性条带，可能是由于引 物与模板结合位点增加或减少造
现即时检测和现场应用。
标准化与规范化
03
建立PCR技术的标准化和规范化体系，提高检测结果的可靠性
和可比性，是未来发展的重要方向。
pcr技术在未来的应用前景
临床诊断
随着实时荧光定量PCR和数字PCR技术的不断完善，PCR技术在临 床诊断中的应用将更加广泛，尤其在感染性疾病、肿瘤诊断等方面。
生物安全与疫情防控
预防措施
在实验过程中保持实验室清洁，避免交叉污染， 定期进行环境清洁和消毒。
假阴性问题及解决方案
总结词
假阴性是指PCR结果中未出现预期的阳性条带，可能是由于引物 或探针设计不当、模板浓度过低等原因造成的。
解决方案
优化引物和探针设计，提高特异性；提高模板浓度；增加循环次数。
预防措施
在实验前进行充分的引物和探针特异性检查，确保引物和探针与目 标模板的结合。
3
关键要素
高温变性、低温退火、适温延伸及耐高温的DNA 聚合酶。
pcr技术原理
01
02
03
高温变性
将DNA加热至90-95℃， 使双链DNA解旋成单链。
低温退火
将温度降至50-60℃，使 引物与单链DNA结合。
适温延伸
将温度升至72℃，耐高温 的DNA聚合酶催化脱氧核 糖核苷酸合成新的DNA链。
最新PCR技术教程ppt课件
绝对
处理与对照
定量PCR仪特点
，污染机会少
定量PCR的实验因素
DNA纯度：OD260/OD280=1.8, 1.6-2.0之间 DNA用量：0.05-100ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1μl
样品和标准品都需要重复，重复次数遵循统计学要求。
定量PCR实验要素：
目标基因： 未知样品 生成标准： 曲线标准品梯度 监控系统： 阳性对照 监控污染： 阴性对照 校准生物学误差：管家基因 校准物理误差：参比荧光（ROX） 降低其它误差：重复实验
ABI 7500
96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观。 ABI试剂ROX校正物理方面的误差：
枪的误差（如试剂体积） 耗材质量（如管盖厚度、透光性） 仪器稳定性（如孔间、批间温度波动）
不适合染料法
卤素灯（白光）
定量
线性图与对数图正好相反，基线期在对数图中增高。
基线
荧光阈值
Ct值
［DNA］0
基线：扩增线中的水平部分，由环境的噪音产生。
实验结束软件自动分析数据，基线取默认值3-15 （循环数）。
如果最小的Ct值>18，保持默认； 如果最小的Ct值<18，基线终点改成［最小的Ct值减 3］，重新分析。
5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、
Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl） 8、dNTP浓度 2.5 mM each
PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
PCR技术详解课件PPT
2021/3/10
13
④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增 条带；
⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二 个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；
⑥ 引物的熔解温度（Tm值），指把DNA的双螺旋结构热变性 过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。DNA中G－ C含量越高，Tm值越高，引物对之间的Tm值相差不超过 2~3℃，经验公式Tm=2℃(A+T)+4℃(G+C)，引物的退火 温度通常低于Tm值5~10℃；
单、双链DNA均可
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白类
对于哺乳动物基因组DNA开说，每个反应需要的模 板量是1μg，对于酵母染色体、细菌染色体和质粒 等模板的通常用量分别是10ng、1ng、1pg
2021/3/10
15
4. dNTP
dNTP在温度较高时容易失活, 因此需要-20℃下冰 冻保存,以保证dNTP的质量。
链
DNA单链
与引物复性
22 DNA双螺旋
子链延伸 DNA加倍
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
/v_show/id_XNjc4Mzk2Njg0.html?qq-pf-to=pcqq.c2c#paction
2021/3/10
2021/3/10
18
五、PCR的类型
在PCR反应中, dNTP浓度应为200 ～ 250μmol/L, 尤其重要的是4种dNTP的体积浓度要相等, 否则就 会引起错配
PCR及相关技术PPT课件
DNA是一种非常稳定的分子，其作为模板影响PCR效果 的因素有： 1. 模板的纯度； 2. 模板DNA的量；
2020/7/28
13
3. PCR引物：
PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链 ，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’ 端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片 段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。
核苷酸错误掺入的几率比较高
2020/7/28
9
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
Taq DNA聚合酶的特性
200 150
2
100
100
3
50
1
2020/7/28
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
温度
6 78
9 10
pH
1. 25 mM磷 酸 缓 冲 液 2. 25 mMTris-HCl缓 冲 液
2020/7/28
18
2020/7/28
6. PCR系统中的其他成分：
PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。
2020/7/28
16
PCR仪
2020/7/28
17
（四）PCR反应技术类型
1. 巢式PCR（nested PCR）：
设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物 为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度 ，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加1000倍 。
C.therm.聚合酶
1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。
2020/7/28
13
3. PCR引物：
PCR引物是与模板DNA互补的两条人工合成的寡核苷酸链 ，通常由15-30个核苷酸构成。引物与单链DNA模板的3’ 端互补且具有游离的3’羟基。引物互补于所需扩增DNA片 段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的区段。
核苷酸错误掺入的几率比较高
2020/7/28
9
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
Taq DNA聚合酶的特性
200 150
2
100
100
3
50
1
2020/7/28
3
掺入的 H-dNTTP微克分子数
温度
6 78
9 10
pH
1. 25 mM磷 酸 缓 冲 液 2. 25 mMTris-HCl缓 冲 液
2020/7/28
18
2020/7/28
6. PCR系统中的其他成分：
PCR反应缓冲液通常用10mMTris-HCl(pH8.3)；50mMKCl；明胶或 血清白蛋白（100ug/ml）及非离子去污剂等。
2020/7/28
16
PCR仪
2020/7/28
17
（四）PCR反应技术类型
1. 巢式PCR（nested PCR）：
设计两对引物，先用第一对引物扩增，然后以此扩增产物 为模板，再用第二对引物继续扩增。可增加扩增的灵敏度 ，比单一的一对引物PCR扩增灵敏度特异性增加1000倍 。
C.therm.聚合酶
1) 是一种以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度在60-70度之间。在 RT-PCR系统中催化逆转录反应。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
标准的PCR过程分为三步
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模 板结合，形成局部双链。 3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的 活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板发光激发荧光基团到 达高能量状态,而后产生发射光。常用的 有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白 DsRed 、CY3、CY5、FAM及其它荧光报 告基团
探针荧光标记及
荧光基团：如红色荧光Cy3和绿色荧光Cy5 标记探针
淬灭基团常：用4-（4-二甲基氨基偶氮苯 基）苯甲酸（DABCYL）
PCR反应特点
特异性强 灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待 测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的 检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个 细菌。
简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液 和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物 一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直 接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
短柄圆环探针荧光PCR原理
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷 酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区： 一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎 干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中 可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般 连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶 氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论， 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光 基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增 加一倍。
荧光PCR检测技术简介
荧光PCR检测技术是在传统PCR技术基础上，加入荧光 标记的基因探针，通过探针与扩增产物的结合释放出 荧光信号，再通过专门的仪器（荧光PCR仪）对荧光信 号的实时检测，经过电脑分析以后，可以准确计算出 目的基因的初始数量，实现定量检测。与传统PCR检测 相比，荧光PCR检测技术不仅实现了PCR检测从定性到 定量的飞跃，而且它具有特异性更强、有效解决PCR污 染问题、自动化程度高等特点。因此，荧光PCR检测技 术自二十世纪九十年代中期出现以来，已成为最具代 表性的PCR检测技术，为PCR检测技术临床应用打开了 方便之门，现已得到广泛应用。
PCR技术
PCR技术被科学界誉为生物技术领域最伟大的 发明之一，美国人莫里斯在发明该技术不久就 因此于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR及其相 关技术于80年代末在国外开始应用：欧共体 （现欧盟）、日本、美国相继把PCR这一基因 诊断核心技术列入献血员筛查，美国食物与药 品管理局已批准了60多种基因诊断试剂用于临 床，美国国家疾病控制中心已把PCR技术列入 疾病诊断的常规技术。
实时荧光PCR结果判读
荧光PCR试剂盒检测结果
荧光域值（threshold）的设定
PCR反应管的前15个循环的荧光信 号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR315个循环荧光信号标准差的10倍，即： threshold=10×sd cycle6-15.荧光域值设 定在PCR扩增的指数期。
Ct值
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念— Ct值。C代表cycle，t代表threshold，Ct值的含 义为每个反应管内荧光信号达到设定的域值时 所经历的循环数。个模板的Ct值与该模板的起 始拷贝数的对数存在线性关系，Ct值越小，起 始拷贝数越多，反之亦然。利用已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表 起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此， 只要获得未知样品的Ct值，就可从标准曲线上 算出该样品的起始拷贝数。
PCR诊断试剂生产管理要点
1、应具有阳性血清（或阳性质粒）处理、 分装的隔离实验室
2、PCR试剂的生产区与检定区应严格分开 3、专用原材料
PCR引物的设计要合理、合适，引物的合 成要有固定的地方和设备，纯度能到达 一定标准
荧光定量PCR试剂的质量检查 操作程序
PCR技术上岗培训解析
几乎所有的疾病都是基因病
科学研究已证明，基因可以揭示疾病的 本质，人类几乎所有疾病都直接或间接 与基因有关，在某种意义上都是基因病，
PCR技术
1985年美国人莫里斯（Kary Mullis）发明了一 种模拟DNA体内复制过程，在体外复制特定 DNA片段的方法，并将其命名为聚合酶链式反 应（PolymeraseChain Reaction，PCR）。PCR 可以在短时间内倍增极微量DNA （理论上说, 仅有一个足够了）至百万或十亿倍，通过PCR 可以简便、快速地从微量生物材料中获得大量 特定的核酸，并具有很高的灵敏度和特异性， 可用于微量核酸样品的检测。
影响分子信标的主要因素
分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响 分子信标的最主要因素。根据Foerster理论，荧光基团 与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。
另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较 低温度下，分子信标才可以保持发卡结构。在较高温 度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸 展为随机线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，从而 发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温 度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度