第七章 哺乳动物胚胎干细胞技术
哺乳动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展
包头师范学院本科学年论文论文题目：哺乳动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展院系：生物科学与技术学院专业：生物科学学号：0911370087姓名：李巧英指导教师：图雅撰写学年：2009 至2010 学年二零一零年十二月摘要本文主要介绍了哺乳类动物胚胎干细胞的一些生物学特性，并着重介绍了它的多能性和全能性，以及多能性或全能性的检测技术。
利用此技术制作嵌合体及嵌合体动物可以为人类器官移植提供实验材料。
胚胎干细胞有着极广的应用范围，本文综述了它在基因、遗传、克隆、体外细胞分化及哺乳动物的个体发育等方面的研究。
但是，由于哺乳动物错综复杂的基因调控和环境因素的影响，对于胚胎干细胞的研究还存在诸多问题，还需作更深入细致的研究。
关键词：胚胎干细胞；全能性；嵌合；分化2This article mainly introduced the mammalia animal embryonic stem cell's some biology characteristic, and introduced its pluripotent and the totipotency emphatically, as well as pluripotent or totipotency examination technology. May provide the experiment material using this technical manufacture chimaera and the chimaera animal for the humanity organ transplanting. The embryonic stem cell has the extremely broad application scope, this article summarized it in the gene, the heredity, the clone, in vitro cell differentiation and mammal's aspect and so on ontoge- nesis research. But, as a result of the mammal intriguing gene regulation and environmental factor's influence, also has many problems regarding the embryo stem cell's research, but must do more thorough careful research.Key words：Embryonic stem cell; Totipotency;The Qianmatches ;Divide3中文摘要 (2)英文摘要 (3)引言 (4)1 胚胎干细胞的生物学特性 (5)1.1胚胎干细胞的定义 (5)1.2 胚胎干细胞的形态鉴定 (5)1.3 胚胎干细胞的全能性或多能性 (5)1.4胚胎干细胞的体外分化 (6)1.5胚胎干细胞的遗传稳定性 (6)2．细胞全能性或多能性检测的方法 (6)2.1 原核注射技术 (6)2.2 胚胎嵌合技术 (7)2.2.1嵌合体制作技术 (7)2.2.2检测ES细胞在嵌合体表达的方法 (7)2.3 ES细胞的诱导分化检测技术 (8)2.4 胚胎干细胞核移植技术 (9)2.5 免疫学方法鉴定 (9)3．胚胎干细胞应用前景展望 (9)3.1胚胎干细胞在哺乳动物个体发育中的研究 (9)3.2 生产嵌合体动物 (9)3.3 为发育遗传研究提供实验材料 (9)3.4.胚胎干细胞是研究体外细胞分化的理想材料 (10)3.5胚胎干细胞作为外源基因 (10)3.6克隆动物 (10)3.7胚胎干细胞用于治疗疾病 (11)4、胚胎干细胞应用中的争议 (11)结论 (12)参考文献 (13)致谢 (15)胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)是从早期胚胎的内细胞团(Inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞(Primordialgerm cells, PGCs)分离出来的具有发育全能性的一种未分化的细胞,它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。
胚胎干细胞的制备及研究进展
胚胎干细胞的制备及研究进展摘要：胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。
ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面的研究应用中起着重要的作用。
引言近年来，随着科学技术的不断发展，世界各国对胚胎干细胞的研究不断深入，取得了许多突破性的进展[1]。
科学证明小鼠ES细胞可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、黑色素细胞、神经细胞、神经胶质细胞、淋巴细胞、胰岛细胞、滋养层细胞等。
人类ES细胞也可以分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。
ES细胞不仅可以作为体外研究细胞分化和发育调控机制的模型，而且还可以作为一种载体，将通过同源重组产生的基因组的定点突变导入个体[2]。
这意味着ES细胞将在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面发挥重要作用，为人类攻克癌症等疑难杂症开辟新的道路。
1胚胎干细胞胚胎干细胞是由哺乳动物附植前早期胚胎的内细胞团细胞或附植后胚胎的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)通过体外分离培养而建立的克隆细胞系。
它具有与早期胚胎细胞相似的形态，即胞体小、核大、胞浆少且具有正常的二倍体核型。
ES细胞最突出的特点是只生长不分化，且保持早期胚胎发育的全能性，在饲养层上或含有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)的培养基中，可稳定传代，长期培养。
体外诱导分化可形成3个胚层的分化细胞。
另外，ES细胞还具有种系传递功能和具有培养细胞所有的特征[3]。
胚胎干细胞不但可用于研究哺乳动物胚胎早期发育和细胞谱系分化，还可对它的基因组进行操作，通过基因打靶、突变和转基因等技术，建立各种实验模型，研究发育、肿瘤、免疫以及人类遗传病等有关问题，大大推动和发展了哺乳动物生物学的研究。
胚胎干细胞的应用
胚胎干细胞的应用
胚胎干细胞是一种多功能干细胞,可以分化成多种组织类型,并
且在许多疾病中具有潜在的治疗效果。
以下是几个胚胎干细胞应用领域:
1. 疾病治疗:胚胎干细胞在再生医学和基因治疗方面的应用正
在迅速发展。
例如,研究人员正在探索用胚胎干细胞治疗多种遗传性
疾病的可能,包括肌营养不良症、先天性视网膜发育不全和脊髓性肌
萎缩症等。
2. 再生医学:胚胎干细胞可以分化成各种组织类型,包括皮肤、
神经、肌肉、骨骼和软骨等,因此被广泛用于再生医学领域,用于治疗肌肉损伤、皮肤疾病和骨骼疾病等。
3. 疾病预防:胚胎干细胞还可以用于预防某些遗传性疾病。
研究人员正在探索将胚胎干细胞注入人体胚胎中,以预防出生缺陷的方法。
4. 生物学研究:胚胎干细胞在生物多样性、基因组学和转录组学等领域具有广泛的应用价值。
通过研究胚胎干细胞的结构和功能,我
们可以更好地了解生命的基本原理和生物多样性。
胚胎干细胞具有广泛的应用前景,未来还有很多挑战和机遇需要
科学家们不断努力探索和研究。
动物细胞工程—干细胞技术
• 全能性或多能性 • 种系传递性 • 体外遗传可操作性 • 无限扩增(自我更新)
干细胞技术
面临问题
扩增变 异
来源问题
（宗教、法律及文 化背景）
技术普 及
干细胞技术
成体干细胞
成体干细胞是指存在于一种已经 分化组织中的未分化细胞，这种细胞 能够自我更新并且能够特化形成组成 该类型组织的细胞。
动物生物技术
干细胞技术
第一章
干细胞技术
干细胞技术
干细胞定义及分类
干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞,能够产生至 少一种类型的、高度分化的子代细胞。
胚胎
干细胞
按来
分
源分 类
成体
干细胞
全能 干细胞
按分化 潜能分
多能 干细胞
单能 干细胞
干细胞技术
胚胎干细胞（ES细胞）
胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESCs， 简称ES、EK或ESC细胞）是早期胚胎（原肠胚期 之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞。
诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs或iPS) 技术是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性 干细胞。
优点分析
分离和培 养宿主细
胞
基因导入 宿主细胞
细胞种植 及重编程
出现及鉴 定ES样
克隆
• 没有伦理学的问题 • 不会有免疫排斥的
➢生物学特性 •多能ห้องสมุดไป่ตู้ •迁移性 •可调控性 •广泛性
优点分析
• 相对容易获取 • 不存在组织相容性 • 致瘤风险很低，伦理学争议
较少 • 多向分化潜能
胚胎干细胞应用
胚胎干细胞应用
如下是有关胚胎干细胞的应用：
1.生产克隆动物
胚胎干细胞从理论上讲可以无限传代和增殖而不失去其正常的二倍体基因型和表现型，以其作为核供体进行核移植后，在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体，胚胎干细胞与胚胎进行嵌合克隆动物，可解决哺乳动物远缘杂交的困难问题，生产珍贵的动物新种。
亦可使用该项技术进行异种动物克隆，对于保护珍稀野生动物有着重要意义。
2.转基因动物
用胚胎干细胞生产转基因动物，可打破物种的界限，突破亲缘关系的限制，加快动物群体遗传变异程度，可以进行定向变异和育种。
利用同源重组技术对胚胎干细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰性动物，有可能创造新的物种;利用胚胎干细胞技术，可在细胞水平上对胚胎进行早期选择，这样可以提高选样的准确性，缩短育种时间。
3.器官组织移植
作为一种被称之为"种子细胞"的胚胎干细胞，为临床的组织器官移植提供大量材料。
人胚胎干细胞经过免疫排斥基因剔除后，再定向诱导终末器官以避免不同个体间的移植排斥。
这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。
4.用于细胞治疗
细胞治疗是指用遗传工程改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到治愈和控制疾病的目的。
胚胎干细胞经遗传操作后仍能稳定地在体外增殖传代。
以胚胎干细胞为载体，经体外定向改造，使基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行，容易获得稳定、满意的转基因胚胎干细胞系，为克服目前基因治疗中导入基因的整合和表达难以控制，以及用作基因操作的细胞在体外不易稳定地被转染和增殖传代开辟了新的途径。
胚胎干细胞的培养原理和方法
胚胎干细胞的培养原理和方法胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）的培养是一个复杂且精细的过程，涉及到多个步骤和原则。
以下是胚胎干细胞培养的基本原理和方法：一、培养原理1.多能性维持：胚胎干细胞具有高度的多能性，即它们有能力分化成体内任何类型的细胞。
培养过程中的一个关键点是维持这种多能性，防止细胞分化。
2.培养环境： ESCs需要特定的培养环境，包括合适的温度、pH值、湿度和气体组成（如CO₂水平）。
3.营养和生长因子：培养基需要包含必要的营养物质和生长因子，以支持细胞的生长和多能性维持。
这些生长因子通常包括利钠、胰岛素以及特定的细胞因子。
二、培养方法1.获取胚胎干细胞：通常从早期胚胎（如囊胚）的内细胞团中分离得到。
2.培养基准备：培养基通常包含高葡萄糖DMEM （Dulbecco's Modified Eagle Medium）、胎牛血清（FBS）或者定义的血清替代物、L谷氨酸、非必需氨基酸、抗生素等。
3.生长因子添加：例如添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）来维持多能性。
4.共培养系统：有时使用“给养层”（Feeder Layer）的方法，即在胚胎干细胞下方培养一层辐射灭活的成纤维细胞，以提供必要的支持和营养。
5.无给养层培养：也可使用定义清晰的培养基，不依赖给养层，减少异种蛋白的污染。
6.培养条件控制：保持恒温（通常为37°C）和特定的CO₂水平（通常为5%）。
7.细胞传代：由于ESC会不断增长，需要定期进行传代，避免过度生长和分化。
8.观察和评估：定期检查细胞形态和生长情况，评估是否保持了未分化状态。
三、注意事项1.避免分化：细胞培养过程中要特别注意防止胚胎干细胞的非计划性分化。
2.遗传稳定性：长期培养可能会导致遗传改变，因此要定期检查细胞的染色体和遗传稳定性。
3.伦理问题：胚胎干细胞的研究和应用常伴随着伦理争议，特别是关于胚胎的使用。
这些方法和原则是胚胎干细胞培养的基本框架，但实际操作中可能会根据研究目的和具体条件有所调整。
动物干细胞技术简介PPT课件
但是，体细胞与多能性细胞的融合率较低， 融合之后的细胞具有两套染色体，并且在 移植后会发生排斥现象，这就制约了细胞 融合的临床应用。
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类：胚胎干细胞及成体干细胞。
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1.带间充质干细胞：大量存在于脐带组织中，具有胚胎干细胞 类似的增殖能力和多向分化潜能，来源丰富、取材方便、无道 德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，疗效显著，可以 扩增和传代，同时又没有配型、排斥等问题，不但能够成为骨 髓间充质干细胞的理想替代物，也是最具临床应用前景的多能 干细胞。
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特异性标志分子的表达
ES细胞的全能性指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内 的各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的能力，可以为 细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料。
ES细胞发育全能性的标志是ES细胞表面表达时相专一性胚胎抗原（Stage specific embryonicant，SSEA），而且可以检查到OTC4基因的表达，这 两种蛋白是发育全能性的标志。ES细胞中AKP及端粒酶活性较高，可用于 ES细胞分化与否的鉴定。
ES细胞） 一般是指从早期胚胎经体外分化抑 制培养分离出来的具有全能性的细胞。
ES细胞是由Evans和Kauf-man1981年首次从
延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当时 称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。
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人胚胎干细胞分离技术途径
ICM
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PGCs
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动物胚胎工程技术的研究进展及展望
动物胚胎工程技术的研究进展及展望摘要：动物胚胎工程是用人工的方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，在育种中可使优良的种质特性和遗传潜力得到充分的发挥，是家畜繁殖领域的一次技术革命。
本文综述了动物胚胎工程包含的技术及研究进展，并对胚胎工程技术发展前景进行了展望。
关键词：胚胎工程；技术；研究进展动物胚胎工程是用人工的方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，包含胚胎移植、排卵控制、胚胎冷冻保存、体外受精与显微受精、胚胎分割与胚胎嵌合、胚胎性别控制、胚胎干细胞、动物克隆等技术[1]。
这些技术的出现不仅大大扩展胚胎移植的研究领域，而且促进畜牧业、医药卫生行业发展，具有重大理论意义。
1 胚胎移植技术哺乳动物的胚胎移植始于1890年，当时英国剑桥大学Heape首次获得兔受精卵移植的成功。
Heape的成功，第一次证实了受精卵在寄主体内发育的可能性，从而奠定胚胎移植的生理学基础和原则。
2 排卵控制排卵控制分为排卵时间控制和排卵数量的控制。
控制排卵时间的目的是得到特定发育阶段卵母细胞，如做微注射转基因使用的原核胚。
排卵数量的控制又称为超数排卵，是为了获得更多的卵子。
目前在控制排卵中常用的激素有FSH、LH、PMSG、HCG等[3]。
3 胚胎冷冻保存胚胎冷冻是对胚胎采取一定保护措施和降温程序，使之在-196℃条件下细胞内一切新陈代谢过程中的化学反应被抑制从而处于一种“停滞”状态，但又不失去升温后恢复代谢的能力，从而能够得到长期保存的一种生物技术[4]。
玻璃化冷冻技术作为一种新发展起来的生物技术，具有许多潜在的应用价值。
而应用此项技术进行卵母细胞冷冻保存，可将优良品种动物废弃卵巢中的大量卵母细胞保存起来，向建立“精子库”和“胚胎库”那样建立“卵子库”，为体外受精、核移植、转基因等各种胚胎生物技术的开展提供充足的材料，并解除了时间和空间上的限制；而且可以为珍稀动物、濒危动物的遗传资源的保存提供可能。
5 胚胎分割和嵌合5.1 胚胎分割胚胎分割是采用显微手术的方法，将早期胚胎一分为二，一分为四或更多次的分割，再（或经过体外培养后）移回受体妊娠产仔，是动物克隆的一种[8]。
生物高二选修二知识点总结
生物高二选修二知识点总结1.生物高二选修二知识点总结篇一胚胎干细胞1、哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。
2、具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显;在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。
另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
3、胚胎干细胞的主要用途是：①可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律;②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段;③可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖尿病等;④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能;⑤随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题2.生物高二选修二知识点总结篇二动物体细胞克隆动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术、不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆、干细胞的研究进展和应用1）干细胞的概念：动物和人体内保留着少量具有和分化能力的细胞。
2）干细胞的分类：①全能干细胞：具有形成完整个体的分化潜能②多能干细胞：具有分化出多种细胞组织的潜能③专能干细胞：只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化、如神经干细胞可分化为各类神经细胞，造血干细胞可分化为红细胞、白细胞等各类血细胞3.生物高二选修二知识点总结篇三1、发酵:通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。
2、有氧发酵:醋酸发酵谷氨酸发酵无氧发酵:酒精发酵乳酸发酵3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌酵母菌的生殖方式:出芽生殖(主要)XX 生殖孢子生殖4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。
胚胎干细胞培养操作规程
胚胎干细胞培养操作规程胚胎干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有无限的增殖能力和多能性分化潜能，对于组织再生和疾病治疗具有重要的应用价值。
为了进行胚胎干细胞的培养和扩增，下面给出一份胚胎干细胞培养操作规程。
1. 实验前准备：a. 清洗培养器具：用无菌水洗净培养皿、玻璃器皿和刷子。
b. 预热培养液：根据实验需要预热胚胎干细胞培养基和所需的其他培养液，以确保适宜的温度。
2. 细胞除菌：a. 必要时，用无菌棉签将细胞悬液接种到新的培养皿中。
b. 将枪头含有70％乙醇的吸管对准培养皿，喷洒乙醇并晾干。
c. 将培养皿放置在超净工作台内，进行进一步的消毒和清洁操作。
3. 细胞接种：a. 取出细胞悬液，并与培养基按照比例混合。
b. 将胚胎干细胞悬液均匀地接种到预先涂覆有明胶或者植物凝胶的培养皿上。
c. 确保培养皿中的细胞接种均匀且不过于密集，以便细胞能够自由生长。
4. 细胞培养：a. 将被接种的培养皿置于培养箱中，在37℃和5% CO2的条件下培养。
b. 每天检查和观察细胞的状态和生长情况，观察细胞的形态和数量。
c. 根据需要，定期更换新鲜的培养基。
5. 细胞分离：a. 当细胞达到足够密度时，可使用胰蛋白酶等酶来进行细胞的分离。
b. 向培养皿中加入足够的酶液，并将其均匀地涂抹在细胞上。
c. 在温度适宜的条件下，观察细胞的分离情况，并在适当的时间停止酶的作用。
6. 细胞传代：a. 轻轻将细胞悬液转移到新的培养皿中，避免细胞团的形成。
b. 加入新的培养基，使细胞能够继续生长和分化。
c. 定期观察和记录细胞的生长情况，监测细胞的纯度和分化状态。
7. 储存和保存：a. 使用液氮分装装置将细胞悬液分装到液氮管中。
b. 储存液氮管在液氮罐中，确保细胞的存活和完整性。
c. 定期检查和更新细胞的库存记录，确保细胞的有效使用和管理。
通过以上的操作规程，可以进行有效的胚胎干细胞的培养和扩增工作，为进一步的研究和应用奠定基础。
胚胎干细胞培养流程
胚胎干细胞培养流程
胚胎干细胞培养流程主要分为以下几个步骤：
1. 胚胎获取：从受精卵或早期胚胎中获取胚胎干细胞。
这一过程通常在体外受精（IVF）过程中进行，通过收集多余的受精卵或选择性将早期胚胎分离出来。
2. 胚胎培养：将获取的胚胎放置在含有营养物质和适当环境条件的培养皿中，以促进其细胞分裂和生长。
培养基通常包括必需的营养物质、生长因子和激素等。
通过优化培养条件，可以促进胚胎细胞的增殖。
3. 胚胎分离：在细胞分裂的早期阶段，胚胎细胞开始形成不同的细胞群，包括内胚层、外胚层和滋养层。
通过机械或酶法等方法，将这些不同细胞群分离开来。
其中，内胚层细胞具有胚胎干细胞的潜能。
4. 胚胎干细胞扩增：将分离得到的内胚层细胞培养在含有适当营养物质和生长因子的培养基中，促进其进一步增殖。
这个过程可以通过细胞培养技术，如经典的细胞培养方法或新兴的三维培养技术（如胶体微珠培养）来实现。
5. 胚胎干细胞鉴定：通过特定标记和检测方法，确认扩增的细胞群中是否存在胚胎干细胞。
常用的鉴定标志包括OCT4、SOX2和NANOG等胚胎干细胞特异性标记物。
6. 胚胎干细胞应用：胚胎干细胞可用于医学研究，如疾病机制研究、药物筛选和组织工程等领域。
此外，它们还
可以用于再生医学的临床应用，如组织修复和再生等。
需要注意的是，胚胎干细胞的研究和应用涉及伦理和法律等多个方面的问题，在进行相关研究和应用时应遵守相关规定和伦理原则。
关于胚胎干细胞的发育与分化
关于胚胎干细胞的发育与分化胚胎干细胞是一类特殊的细胞，具有自我更新和分化为各种细胞类型的能力。
它们通常发现于发育早期胚胎中，可以通过一系列的体外培养技术得到和扩增。
利用胚胎干细胞技术可以为许多疾病的治疗提供希望，因此在科学界备受关注。
一、胚胎干细胞发育的阶段胚胎干细胞是来源于胚胎发育的早期阶段。
在人类胚胎发育过程中，受精卵发生分割形成的几个细胞会逐渐分化成一些早期干细胞，也就是称为内细胞团的细胞。
胚胎发育到第五天左右，内细胞团开始向外突出，并随着发育形成了胚胎原基。
此时，胚胎原基中的一些细胞具有了分化成各种细胞类型的能力，这些细胞就是我们所说的胚胎干细胞。
在早期胚胎发育的阶段，胚胎干细胞还没有开始分化，因此它们具有多能性或未分化的状态。
二、胚胎干细胞分化的途径在胚胎干细胞逐渐分化成各种细胞类型的过程中，会遵循一定的分化途径。
根据分化途径的不同，胚胎干细胞主要分为三种类型：外胚层干细胞（Ectoderm）、中胚层干细胞（Mesoderm）和内胚层干细胞（Endoderm）。
这三种类型的干细胞在发育过程中，会分化为不同的细胞类型，例如：1. 外胚层干细胞分化为神经元、胶质细胞和皮肤细胞等。
2. 中胚层干细胞分化为心脏细胞、降钙素细胞、骨骼肌细胞和卫星细胞等。
3. 内胚层干细胞分化为肺泡细胞、胰腺细胞、肝细胞和肠上皮细胞等。
分化过程中，干细胞逐渐失去未定向和多能性，变得更加专一和特化。
这一过程是受到一系列信号通路的调控的。
三、胚胎干细胞的应用目前，胚胎干细胞技术被广泛用于研究和治疗皮肤、心脏、肝脏、神经系统和其他疾病。
在研究方面，胚胎干细胞可以用于探索细胞分化和发育的机制，以及医学研究的基础知识。
在治疗方面，胚胎干细胞可以通过移植和分化为需要的细胞类型来治疗一些疾病，例如：1. 神经系统疾病：包括帕金森症、阿尔茨海默病和脊髓损伤等。
2. 心脏疾病：包括心肌梗塞、心肌病和冠状动脉疾病等。
3. 器官损伤：包括肝脏、肾脏和胰腺等。
拓展阅读：哺乳动物胚胎工程及其进展简介
哺乳动物胚胎工程及其进展简介随着科学技术的高度发展，建立在生命科学理论基础上的生物技术在人类生产生活中的作用越来越大。
生物技术主要包括四个方面：基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程。
而动物胚胎工程就是细胞工程的重要组成部分，是动物育种、品种改良的有效途径，是细胞生物学和发育生物学研究生命本质的有效方式。
在这里，我想简单地介绍一下哺乳动物胚胎工程及其进展情况。
1.胚胎体外培养这是胚胎工程的基础。
体外培养要求获得较多的受精卵或胚胎作供体。
学者运用促性腺激素对卵巢发育作用的原理，在母畜发情周期的适当时期注入适量的促性腺激素，可以诱发母畜卵巢内较多的卵泡同时发育、成熟、排卵，这种技术称超数排卵技术，可使动物提供较多的胚胎以供实验。
日本花田章等以培养基加胎儿血浆的方法做出了体外培育卵子成熟的实验，扩大了超数排卵境界，使人们可以利用屠宰场母畜的卵巢，在体外培育得到成熟卵。
2.胚胎移植胚胎体外培养到一定发育阶段，必须移植到同步发情的母畜子宫内。
解决同步发情的方法有两种：一是利用自然同期发情的母畜，此法在实践上较难办到；二是诱发同期发情，就是掌握发情规律，通过注射某些药物（如孕激素、雌激素等）诱发同期发情，这样可减少母畜的数量又能保证每天有一定数量的同期发情母畜作宿主。
在我国、胚胎移植成功率达50％，国外可达70％。
3.胚胎保存一种方法是低温保存在37℃以下，0℃以上使胚胎细胞分裂暂停，新陈代谢降低，但并未停止，保存时不必加入抗冻剂及一系列冷冻和解冻处理，适于短期保存和近距离运输。
再一种方法是超低温保存，利用液氮（-196℃）、液氦（-269℃）保存，胚胎新陈代谢完全停止。
该方法较复杂，有一系列冷冻和解冻过程，而且抗冻剂处理不当就会造成胚胎损伤和死亡。
解冻后经检查鉴定正常的胚胎须立即放在37℃的磷酸盐缓冲液内等待移植。
该法可长期保存及做远距离运输。
对于保存的胚胎，可以鉴别死活，还可对其做出性别判断，准确度达60％4.胚胎分割胚胎发育到囊胚期以前没分化的细胞具有全能性。
哺乳动物胚胎干细胞的分离和培养
哺乳动物胚胎干细胞的分离和培养随着科技的发展，胚胎干细胞已经成为了诸多领域中相当受重视和关注的一种细胞，其独特的生物学特性在组织再生、细胞治疗、疾病研究等方面得到了广泛的应用。
而胚胎干细胞的获取途径，主要有胚胎干细胞的分离和培养，后来又发展了生殖细胞干细胞和诱导多能干细胞等变体。
其中，胚胎干细胞的分离和培养是获取胚胎干细胞的最主要方式之一。
实现胚胎干细胞的分离和培养，需要克服很多技术难题，因此需要结合内分泌学、遗传学、细胞学等许多知识和方法。
一、哺乳动物胚胎干细胞的来源和种类体内的胚胎其实是非常珍贵的资源，而哺乳动物胚胎是分离并培养胚胎干细胞的最主要来源之一。
而胚胎干细胞又分为内胚层干细胞和外胚层干细胞两种。
内胚层干细胞发源于极早期的胚胎，负责形成所有的胚胎层组织和器官。
而外胚层干细胞则起源于滋养层，是胚胎和胎儿的外层，主要分化为胎盘和涵盖胚胎的腔囊。
二、胚胎的提取和悬浮培养胚胎干细胞的提取是分离和培养胚胎干细胞的最基本步骤。
其实胚胎的提取有很多种方法，如体外受精、腹腔注射、放置细胞培养皿等。
其中，放置细胞培养皿的方法成本较低且技术难度较低，成为了主要的选项之一。
在胚胎提取之后，需要进行悬浮培养。
悬浮培养的目的是维持胚胎在一定的温度和湿度下进行生长和发育，同时也为胚胎干细胞的分离、培养提供了条件。
悬浮培养要注意的是，其浓度和成分的选择应当因胚胎发育的不同阶段而有所不同。
三、哺乳动物胚胎干细胞的分离哺乳动物胚胎干细胞的分离是胚胎干细胞的获取的最关键的步骤之一，也是技术难度最大的步骤。
目前主要有三种方法来从胚胎中分离胚胎干细胞，即机械分离法、酶消化分离法和选择性黏附法。
相比于其他两种方法，机械分离法是分离胚胎干细胞的常用方法。
首先，需要用小胚胎钳和针管将胚胎的外壳和滋养层取出，释放出内部的细胞块。
然后用切割或挤压的方式分离胚胎内部的细胞并编集成单个细胞，萃取出胚胎干细胞。
四、哺乳动物胚胎干细胞的培养哺乳动物胚胎干细胞的培养在细胞注重环境及其能力与组合方面具有极高的要求。
胚胎移植技术
考向一 以非选择题的形式考查胚胎移植的过程 1.下图为培育“转基因试管牛”的基本过程示意图,请据图回答下列问 题:
(1)A过程一般用 激素处理供体母牛,使其超数排卵,此前需用激 处理。 处理,采集的卵母 素对供体母牛和代孕母牛进行 (2)采集到的精子在进行体外受精前必须进行 细胞也需要培养至 期才能受精。
成熟后,才能与获能精子受精。
(5)体外受精:获能的精子和培养成熟的卵子可以在专用的
受精溶液
中完成受精过程。
2.胚胎移植技术 (1)概念:胚胎移植技术是指将良种母畜配种后,从其生殖道取出
早期胚胎
或通过体外受精及其他方式(如转基因、核移植)得到的胚胎
,再移植到 同种 的、生理状态相同的其他雌性动物体内,使它们进一 步发育为新个体的技术。 (2)应用:提高优良品种家畜的
2.胚胎干细胞的来源:胚胎干细胞是一类未分化细胞,可从早期胚胎 的囊胚期分离获取或从胎儿的原始性腺中分离获取。 3.干细胞的种类:
类别 全能干细胞 来源或举例 胚胎干细胞(囊胚期之前的细胞及内 细胞团细胞) 特点 能发育成完整个体
多能干能,
但无发育成完整个体的能力
(2)该过程中两次检查:第一次对收集的胚胎进行检查;第二次对受
体母牛是否妊娠进行检查。 (3)产下的犊牛性状取决于所用公牛和供体牛,性别取决于公牛提 供何种类型的精子,二者与受体牛没有关系,受体牛提供营养和胚 胎发育的场所。
2.胚胎移植和胚胎分割移植的比较
胚胎移植 概念 将胚胎移植到同种的、生理状态相同 的其他雌性动物的体内,使之继续发 育为新个体的技术 移植前 的处理 生殖方式 用促性腺激素对供体和受体进行同期 发情处理;对供体进行超数排卵处理 通过核移植技术获得胚胎,属于无性 生殖;通过体、内外受精获得胚胎,则 属于有性生殖 操作对象 作用及 意义 早期胚胎 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力,大大缩短了供体本身的繁殖周期,提高了 繁殖率 胚胎分割移植 采用机械方法将早期胚胎切割成2等 份、4等份或8等份,经移植获得同卵 双胎或多胎的技术 对囊胚阶段的胚胎分割时,要将内细 胞团均等分割 分割后的胚胎具有相同的遗传物质, 可看作是无性生殖
哺乳动物细胞培养技术
哺乳动物细胞培养技术介绍哺乳动物细胞培养技术是一种在实验室环境中培养和繁殖哺乳动物细胞的技术。
它为研究哺乳动物细胞的生理机制、疾病发生机制以及开发新药提供了重要的工具和平台。
本文将从细胞培养的基本原理、培养条件的优化以及应用领域等方面对哺乳动物细胞培养技术进行全面、详细、完整且深入地探讨。
细胞培养的基本原理细胞培养是将细胞从生物体中取出，将其放置于合适的培养基中，提供适当的营养物质和环境条件以促进细胞的生长和复制。
细胞培养的基本原理包括以下几个方面：细胞来源哺乳动物细胞可以从多种来源获取，如人体组织、动物胚胎、肿瘤组织等。
不同来源细胞的特性和用途各不相同，研究者需要根据具体需求选择合适的细胞来源。
细胞培养基细胞培养基是指培养细胞所需的营养物质、激素、生长因子和缓冲剂等组成的培养液。
常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640等。
培养基的组成和浓度需要根据细胞类型和需求进行优化。
培养皿和培养条件细胞的生长需要合适的培养皿和培养条件。
培养皿可以是培养瓶、培养皿等，而培养条件包括温度、湿度、CO2浓度等。
不同细胞对于培养条件的要求各不相同，研究者需要根据细胞类型和实验需求进行调整。
培养条件的优化为了获得高质量的细胞和稳定的培养结果，培养条件的优化是非常重要的。
下面将从培养基、培养条件和质量控制等方面探讨培养条件的优化。
培养基的优化培养基的优化包括确定最适合细胞类型的基础培养基配方、添加辅助因子和调整培养基的pH值等。
细胞对于培养基的营养物质需求各不相同，因此需要根据细胞类型和实验需求进行优化选择。
培养条件的优化培养条件的优化包括温度、湿度和CO2浓度等。
不同细胞对于培养条件的要求各不相同，研究者需要根据细胞类型和实验需求进行调整。
例如，体温下的细胞生长需要将培养皿放置在恒温箱中，保持适宜的温度和湿度。
质量控制在细胞培养过程中，质量控制是非常重要的。
它包括消除细胞污染、控制细胞的鼓泡程度和精确计数细胞数等。
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注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合获得嵌合 体后代，用转染的ES细胞分化为生殖干 细胞，生产转基因阳性动物。 也可把转化后的ES细胞作为供体核，用 细胞核移植技术直接获得转基因动物。
5.ES细胞治疗技术将引起一场医学革命
新药开发与药效、毒性评估等
组织工程学、功能基因组学和 蛋白质组学、发育生物学
小鼠多用3－4天的胚泡或2－3天的桑椹胚， 猪取8－10天的胚泡，
绵羊取8－9天的胚泡，
人和牛取7－8天的胚泡。
原始生 殖细胞
从胚泡中分离出细胞团的方法主要免疫外
科学方法，显微外科学方法和组织培养法 等。 其中组织培养法是将胚泡接种在饲养层上 ，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育 过程，较易获得胚胎干细胞集落。
3.研究基因功能的首选细胞 由于ES细胞具有稳定的核型，并易于诱
捕外源基因，因此进行基因敲除或定向插 入外源基因的理想细胞。 用遗传修饰的ES细胞生产嵌合体或用细 胞核移植技术获得的克隆后代，通过观察 后代的表型变化，可探明未知基因的生物 学功能和表达调控规律。
4.是生产转基因动物的主要方法之一 用外源基因转染后，筛选阳性细胞，然后
四 .胚胎干细胞的分离培养基本程序
1.胚胎干细胞的分离 目前ES细胞主要有两个来源，即胚泡内细胞
团和生殖嵴中的原始生殖细胞，前者更为常 用。 囊胚：尽量选择体内受精的胚胎分离ES细胞； 对于相同来源的胚胎选择色泽透亮，ICM明 显的胚胎。 胎儿性腺脊：经酶消化后，可直接培养在分 化抑制培养体系中，一般7d传代一次，直至 出现细胞形态均一的克隆细胞团，挑选后进 行扩大培养。
（2）转录调控因子oct-4： oct-4是ES细
胞维持多能性和进入分化的开关，是 DNA特异结合蛋白，通过激活或者移植 靶基因的转录活性，维持ES细胞的自我 更新。在ES细胞中始终保持一定的水平， 表达量在50~150%，才能实现自我更新 和维持多能性。 Ni Wa等（2000）研究表明：STAT3和 oct-4可能作用于相同的靶基因而相互协 调维持ES细胞的功能。
多能干细胞
功 能
全能干细胞 专能干细胞
干细胞
胚胎干细胞
组织发生
组织干细胞
全能干细胞
Totipotent stem cells
具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各 种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官，如胚胎
干细胞。
八细胞阶段
多能干细胞
Multipotent stem cells
具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞， 即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有 自我增殖和分化两种功能。 骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，移植造血
（3）通过移植酪氨酸磷酸酶SHP-2和细
胞外调节激酶ERK，维持ES的正常功能： SHP-2能除去酪氨酸上磷酸基团，作用 于gp130受体的胞内区，使gp130和其他 的膜受体收到刺激后ERK被激活。 SHP-2和ERK对STAT3功能有负调控作 用，抑制其信号传导。
二、胚胎干细胞研究的意义
育。通过交配可以分离出带有 ES细胞遗传性状 的个体，这是ES细胞具有种系传递能力的一种 证明。
5、ES细胞自我更新的分
子机理 1、LIF（白血病抑制因 子）:ES细胞表面的有一 复合受体，由低亲和性 的LIF受体和普通亚基 gp130构成异源二聚体， LIF与受体结合后激活 Jak酶，通过对STAT3的 磷酸化激活维持细胞自 我更新的基因。
2.来源：
囊胚的内细胞团（ICM）
早期胚胎的种细胞或胎儿的原始生殖细胞。
ICM在胚胎着床前：分化出原始内胚层，紧贴着囊胚
腔的内层生长，最后发育为卵黄膜；
ICM在胚胎着床后：分化为原始外胚层，进一步分化
为胚胎的3个种细胞层，进一步发育为胎儿。
肝脏，胰脏）
内消呼肝胰（内胚层发育为消化系统，呼吸系统，
三、胚胎干细胞研究的历史与进展
干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后 最具活力、最有影响和最有应用前景的生命科 学科研究领域； 1999年干细胞研究被美国《SCIENCE》杂志评 为1999年度世界十大科学之冠； 2000年干细胞研究再次被《SCIENCE》杂志评 为该年度世界十大科学成就之一。
• 1998 年 11 月 ， 美 国 威 斯 康 星 大 学 的 科 学 家 James Thomson 等从人囊胚的内层细胞团中取 得胚胎干细胞。 • 他们把胚胎干细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行 了共培养。结果表明胚胎干细胞可以进行长达 5 个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋 养层组织及三种胚层组织的能力。这为胚胎干 细胞的临床应用奠定了基础。
ES 细胞具有种系传递（ germline transmission ）
能 力 ， 能 够 形 成 嵌 合 体 动 物 （ chimeric animal）。 若在体外把ES细胞注射至另一胚泡 内，使之与受体胚胎细胞混合，再移植入假孕 受体子宫，可发育获得嵌合体（chimeric）。
ES细胞可参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发
• 2001年1月，英国议会上院通过法案，允许科 学家克隆人类早期胚胎，并பைடு நூலகம்用它进行医疗研 究。 • 2001年4月，美国科学家发现，从病人臀部和 大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的 细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉 等。
2003年，美国卫生独立研究院（National
Institutes of Health，NIH）华裔科学家施松涛 等人首次发现牙齿间质存在干细胞。
ES 细胞全能性体现在：
1 ）形成畸胎瘤：将 ES 细胞接种同源动物皮下
可形成内、中、外三种胚层细胞。
2 ）形成类胚体：将 ES 细胞在非黏附底物中悬
浮培养生长，或控制增殖细胞数目，形成多种 系混杂的集合体
3 ）直系分化：通过控制 ES 细胞生长环境或遗
传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化为某 特定种系细胞。新的ES细胞建系后在体外生长 时间越短，产生所有类型组织的可能性就越大。 或两个以上基因型构建而成的完整个体，称为 基因嵌合体或嵌合体动物。将ES细胞注射到同 种动物囊胚腔中，可形成嵌合体。 ES 细胞或 EG 细胞一旦分化即丧失全能性，难以参与胚 胎发育，形成嵌合体。
2009年3月，美国白头研究所（Whitehead Institute）
科学家在成功诱导iPS细胞后，巧妙的将诱导iPS时 带入细胞的基因去除，大大降低了细胞癌变风险。
2009年3月，汤姆森和俞君英带领的研究小组在iPS
研究方面又迈进一大步，他们利用质粒作为诱导iPS 基因的载体进行诱导iPS细胞后，随着细胞分裂丢失 质粒，可以得到纯净无外源DNA的iPS细胞，在iPS 细胞应用安全性方面又进一步。
组织干细胞 Tissue-specific stem cell
指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某 种组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞 (Adult stem cells)。
一、胚胎干细胞的生物学特点
1.定义 哺乳动物胚胎干细胞（Embryo Derived
Stem Cells）又称ES或EK细胞，是从早期胚 胎或胎儿中分离出来的具有发育全能性的细 胞系。一方面具有自我更新能力，另一方面 具有分化潜能。
哺乳动物胚胎干细胞技术
韩 雪 蕾
主要内容
一、胚胎干细胞的生物学特点 二、胚胎干细胞研究的意义 三、胚胎干细胞研究的历史与进展
四 .胚胎干细胞的分离培养基本程序
五.ES细胞的保存 六.ES细胞的鉴定 七.ES细胞技术目前存在的问题 八.ES细胞技术的发展方向
干细胞分类
• 1981 年英国剑桥大学的 Evans 和 Kaufman 用延 缓 着 床 的 胚 泡 的 胚 胎 内 细 胞 团 ICM （ inner cells mass)获得鼠的ES细胞；
• 同年美国的Maryin用条件培养基获得鼠的ES细 胞。Roberston用不同品系的鼠胚和具有不同遗 传疾病的胚胎建立了细胞系并进行了多能性和 嵌合特性的分析。
人类面临的大多数医学难题,如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松、 癌症、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等疾病
6.可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选
细胞癌变主要是由于正常的细胞周期发生紊
乱，细胞无序增殖所致。ES细胞在正常的 培养环境中能维持稳定的核型，是研究致癌 物质诱发细胞癌变机理的理想材料； 在研究新药过程中，需要对药物的作用机理 和药效进行研究，ES细胞在体外能分化多 种体细胞，可以直接作为实验材料来筛选新 药，可缩短新药开发周期，且治疗的针对性 强。
• 1999年12月，美国科学家在《美国科学院院刊》 报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横 向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学 家相继证实，成体干细胞包括人类的成体干细 胞具有可塑性。 • 2000年5月，日本启动“千年世纪工程”，以 干细胞工程为核心技术的再生医疗成为这项工 程的四大重点之一，第一年度投资金额达108 亿日元。
1.ES细胞是研究哺乳动物个体发生发育规
律极有价值的工具
2.是研究细胞分化的理想手段
ES 细胞仅在饲养层细胞上或添加白血病
抑制因子或白细胞介素-6家族的培养液中 维持不分化状态，当培养液中添加分化诱 导剂时可以出现定向分化，如视黄酸诱导 分化为神经元和神经胶质细胞，DMSO诱 导分化为平滑肌细胞等。 通过研究 ES 细胞的分化特点，可揭示细 胞内信号转导的路径，发现新的信号受体， 揭示细胞分化和调亡的机理。
（1）免疫外科学方法：该法的原理是利用
囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体 结合对细胞的作用，去除滋养层细胞，保留 ICM细胞进行培养。 以小鼠为例，将体外培养的小鼠胚泡去除透 明带后，经抗小鼠脾细胞抗血清作用一定时 间后再移入含新鲜豚鼠血清的培养液中处理， 这样滋养层细胞即被破坏，去除死去的滋养 层细胞即得ICM，将ICM离散成卵裂球即可 接种培养。 此法较为简单，且去除滋养层细胞较彻底， 最为常用。