生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用共112页文档
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Part of ThermoFisher Scientific
▪ Hyclone: Cell culture Technology ▪ Pierce: Protein Chemistry ▪ Dharmacon: RNAi Technology ▪ ABgene: PCR Technology
1
PIERCE:
4. 加入10ul N4-dCTP与5XdNTP的混合物，5ul 反应缓冲液，1ul Klenow酶片断，混匀
▪ 而2mM生物素即可将单体亲和素与生物 素标记的生物大分子置换解离。
Biotin: Avidin 体系的优点：
▪ 稳定 ▪ 信号放大 ▪ 用途广泛
5
生物素/亲和素应用
Affinity Chromatography
Cross-linking Agents
Isolation/Purification
▪ 优化杂交液和封闭液保证了探针与靶DNA的完美结合 ▪ Dura （10-14克）底物保证了保证了高于地高辛（DIG）-AP标记系统，等
同于或者超过同位素的检测灵敏度
13
方便快速
▪ 0.5－10分钟即可检测到特异性信号 ▪ 6小时的超长发光时间允许多次曝光 ▪ 可以使用冷光CCD成像仪扫描成像
14
2
The world leader in serving science
1. 生物素标记和化学发光检测技 术在核酸杂交和EMSA中的应用
关于生物素
O
HN NH H
H
S
O OH
▪ 别名： Vitamin B ▪ 分子量： 244.31 ▪ 水溶性好 结合对象： ▪ 亲和素Avidin ▪ 链亲和素Streptavidin ▪ 中性亲和素NeutrAvidin ▪ 单体亲和素Mono Avidin
Affinity targeting
Biotin
Flow cytometry
Protein Interaction
Avidin
Immobilizing Agents
Cytological probes Blotting Bioaffinity sensors EpitBaidu Nhomakorabeape Mapping
Technology
4
关于生物素/亲和素复合物
亲和素 ▪ 亲和素Avidin ▪ 链亲和素Streptavidin ▪ 中性亲和素NeutrAvidin ▪ 单体亲和素Mono Avidin
生物素/亲和素复合物
▪ 其中与前三者的结合解离系数为 Ka = 1015 M-1.具有极高的结合能力，只有 8M的盐酸胍在PH1.5的极端条件下或在 SDS煮沸才可以将其破坏解离，
Technical Focus:
有机合成，化学耦联，表面化学和分析化学
Product Focus：
分子生物学：各种化学发光Blotting, EMSA,RPA 蛋白质组学：蛋白抽提, 蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色
试剂和预染Markers 免疫学 ：抗体制备, 纯化，片断化, 分型和修饰 交联化学：交联剂，修饰试剂，生物素化试剂…
操作流程与时间
1. 探针标记与纯化（1小时） 2. 预杂交（0.1mL/cm2 ,55或者65°, 0.5小时） 3. 杂交（8－12小时） 4. 严谨洗膜（3X15分钟,提高温度,降低离子强度） 5. 封闭（ 0.25mL/cm2 , 轻柔振荡15分钟） 6. SA-HRP孵育（,1:300稀释度,轻柔振荡15分钟） 7. 洗膜（ 4X5分钟） 8. 平衡（5分钟） 9. 底物孵育(0.125mL/cm2 , 5分钟) 10. 曝光检测（0.5－ 10分钟）
8
North2South 杂交原理和操作流程
5、SuperSignal® Dura 底物在 HRP的催化下反应发光，检测
3、杂交：生物素标记的 探针与靶DNA结合
底物
HRP
SA
│B
B
│
1、DNA电泳，转膜，紫外交联固定
9
4、HRP标记的链亲和素与 探针上的生物素结合
2、洗膜封闭
Kit组成
▪ 该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成 ▪ North2South™生物素随机引物Kit(该试剂盒含有足以完成10次标记反应的试
剂，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) ▪ 化学发光检测Kit 89880可检测1080cm2的杂交膜.
10
探针得率高
▪ 高产率 ：模板DNA可以少至100ng，Klenow聚合酶无核酸外切酶活 ，产率提高，每次标记至少产生1-2 ug的生物素标记的探针。
▪ 使用方便：标记好的探针可以在冰箱里保存一年。
7
原理
▪ 标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板， 在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP掺入到合 成的DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性 生物素标记的DNA探针
▪ 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP上的链亲和 素结合，HRP与Pierce 的Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测
15
1. 探针制备一之探针标记
1. 将20ul生物素标记的N4-dCTP与80ul的5XdNTP混合物充分混合备 用（总量100ul）
2. 稀释约100ng线性探针模板至24ul于离心管中(模板DNA要定量和纯 化)
3. 加入10ul随机引物（Heptanucleotide mix）于上述离心管中，煮沸 变性5分钟，迅速在冰水混合物退火5分钟
Affinity cytochemistry
Localization studies Signal Amplification
Diagnostics Histochemistry
6
1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应用
“Everything is possible - with the right tools”
11
检测安全
▪ 采用非同位素的化学发光系统，免除放射性的危险与处理同位素废物 的麻烦，减少环境污染；无须专门的同位素操作室，易于使用推广
▪ anyone,anywhere and anytime
12
高灵敏度与高信噪比
▪ 生物素标记的dUTP保证了与HRP标记的链亲和素（Kd=10-15M； 抗体10-5～ 8M ）最大结合，经受最严谨的洗膜条件
▪ Hyclone: Cell culture Technology ▪ Pierce: Protein Chemistry ▪ Dharmacon: RNAi Technology ▪ ABgene: PCR Technology
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PIERCE:
4. 加入10ul N4-dCTP与5XdNTP的混合物，5ul 反应缓冲液，1ul Klenow酶片断，混匀
▪ 而2mM生物素即可将单体亲和素与生物 素标记的生物大分子置换解离。
Biotin: Avidin 体系的优点：
▪ 稳定 ▪ 信号放大 ▪ 用途广泛
5
生物素/亲和素应用
Affinity Chromatography
Cross-linking Agents
Isolation/Purification
▪ 优化杂交液和封闭液保证了探针与靶DNA的完美结合 ▪ Dura （10-14克）底物保证了保证了高于地高辛（DIG）-AP标记系统，等
同于或者超过同位素的检测灵敏度
13
方便快速
▪ 0.5－10分钟即可检测到特异性信号 ▪ 6小时的超长发光时间允许多次曝光 ▪ 可以使用冷光CCD成像仪扫描成像
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The world leader in serving science
1. 生物素标记和化学发光检测技 术在核酸杂交和EMSA中的应用
关于生物素
O
HN NH H
H
S
O OH
▪ 别名： Vitamin B ▪ 分子量： 244.31 ▪ 水溶性好 结合对象： ▪ 亲和素Avidin ▪ 链亲和素Streptavidin ▪ 中性亲和素NeutrAvidin ▪ 单体亲和素Mono Avidin
Affinity targeting
Biotin
Flow cytometry
Protein Interaction
Avidin
Immobilizing Agents
Cytological probes Blotting Bioaffinity sensors EpitBaidu Nhomakorabeape Mapping
Technology
4
关于生物素/亲和素复合物
亲和素 ▪ 亲和素Avidin ▪ 链亲和素Streptavidin ▪ 中性亲和素NeutrAvidin ▪ 单体亲和素Mono Avidin
生物素/亲和素复合物
▪ 其中与前三者的结合解离系数为 Ka = 1015 M-1.具有极高的结合能力，只有 8M的盐酸胍在PH1.5的极端条件下或在 SDS煮沸才可以将其破坏解离，
Technical Focus:
有机合成，化学耦联，表面化学和分析化学
Product Focus：
分子生物学：各种化学发光Blotting, EMSA,RPA 蛋白质组学：蛋白抽提, 蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色
试剂和预染Markers 免疫学 ：抗体制备, 纯化，片断化, 分型和修饰 交联化学：交联剂，修饰试剂，生物素化试剂…
操作流程与时间
1. 探针标记与纯化（1小时） 2. 预杂交（0.1mL/cm2 ,55或者65°, 0.5小时） 3. 杂交（8－12小时） 4. 严谨洗膜（3X15分钟,提高温度,降低离子强度） 5. 封闭（ 0.25mL/cm2 , 轻柔振荡15分钟） 6. SA-HRP孵育（,1:300稀释度,轻柔振荡15分钟） 7. 洗膜（ 4X5分钟） 8. 平衡（5分钟） 9. 底物孵育(0.125mL/cm2 , 5分钟) 10. 曝光检测（0.5－ 10分钟）
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North2South 杂交原理和操作流程
5、SuperSignal® Dura 底物在 HRP的催化下反应发光，检测
3、杂交：生物素标记的 探针与靶DNA结合
底物
HRP
SA
│B
B
│
1、DNA电泳，转膜，紫外交联固定
9
4、HRP标记的链亲和素与 探针上的生物素结合
2、洗膜封闭
Kit组成
▪ 该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成 ▪ North2South™生物素随机引物Kit(该试剂盒含有足以完成10次标记反应的试
剂，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) ▪ 化学发光检测Kit 89880可检测1080cm2的杂交膜.
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探针得率高
▪ 高产率 ：模板DNA可以少至100ng，Klenow聚合酶无核酸外切酶活 ，产率提高，每次标记至少产生1-2 ug的生物素标记的探针。
▪ 使用方便：标记好的探针可以在冰箱里保存一年。
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原理
▪ 标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板， 在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP掺入到合 成的DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性 生物素标记的DNA探针
▪ 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP上的链亲和 素结合，HRP与Pierce 的Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测
15
1. 探针制备一之探针标记
1. 将20ul生物素标记的N4-dCTP与80ul的5XdNTP混合物充分混合备 用（总量100ul）
2. 稀释约100ng线性探针模板至24ul于离心管中(模板DNA要定量和纯 化)
3. 加入10ul随机引物（Heptanucleotide mix）于上述离心管中，煮沸 变性5分钟，迅速在冰水混合物退火5分钟
Affinity cytochemistry
Localization studies Signal Amplification
Diagnostics Histochemistry
6
1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应用
“Everything is possible - with the right tools”
11
检测安全
▪ 采用非同位素的化学发光系统，免除放射性的危险与处理同位素废物 的麻烦，减少环境污染；无须专门的同位素操作室，易于使用推广
▪ anyone,anywhere and anytime
12
高灵敏度与高信噪比
▪ 生物素标记的dUTP保证了与HRP标记的链亲和素（Kd=10-15M； 抗体10-5～ 8M ）最大结合，经受最严谨的洗膜条件