生物素-亲和素反应的放大技术

使用交联臂减少空间阻力
第二节 亲合素、链霉亲合素的理 化性质与标记
亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素
(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合
物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所
有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链
酶亲合素（SA）结合。
一、理 化 特 性
亲合素（AV）
BAB法：
Ag+B· Ab
Ag-Ab· B
A/SA
Ag-Ab· B-A/SA
B· E
Ag-Ab· B-A/SA-B· E
特点：以游离A/SA分别连接B-Ab和B-E
BA法，也称标记亲合素-生物素法: （labeled avidin-biotin,LAB） Ag+B· Ab Ag-Ab· B
A· E/SA· E
BAS用于荧光抗体技术可明显提高方法的灵敏度 和特异性，通常采用BA法，即用荧光素直接标 记亲合素（或链酶亲合素）；也可采用游离亲 合素（或链酶亲合素）搭桥，两端分别连接生 物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法） 或荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素）抗体 的夹心法。
BAS用于时间分辨荧光免疫分析也可以将反应信 号放大。
I 咪唑酮环
羧基:可用于活化为其他
衍生物
Ⅱ
噻吩环
一、活化生物素
生物素侧链的末
端羧基经化学修 饰后制成带各种
活性基团的衍生
物－活化生物素 (生物素化衍生物 ) 为何要活化？
活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记蛋白质醛基的活化生物素
活化生物素易 与抗原、抗体、 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
BA
生物素（biotin）、亲和素（ avidin）是一对具有高度亲和 力的物质，结合迅速、专一、 稳定并具有多级放大效应。 BAB
ABC
第一节
生物素理化性质与标记
I环为咪唑酮环，可与亲合 素结合 Ⅱ环为噻吩环， C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大 分子的唯一结构
生物素（维生素H） 动、植物组织中广泛 分布,卵黄和肝含量高 分子量小，244.31 D

可标记AV/SA的物质：酶、抗原或抗体、铁蛋白、
胶体金、125I、异硫氰酸荧光素（FITC）等。

HRP-AV(SA)（酶标记蛋白的直接标记法）：
过碘酸钠法、戊二醛法。 ABC/SABC ：通过与生物素化酶复合物中的 生物素结合，间接地与酶形成结合物。
AV(SA)+B-HRP/ALP comlplex) /ABAP ABC(avidin-biotin-peroxidase
再与无水肼反应而成。
除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)： 能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
标记核酸的活化生物素

光生物素(photobiotin)光敏物质
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香基硝 基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B-核酸探针，用于 DNA或RNA的标记。
第四节 生物素-亲合素系统的应 用
生物素与亲合素之间结合的亲合 力高、特异性强，各自均可以与各型 大小分子结合，以及二者在结合反应 时具有的多级放大作用等优越性，使 BAS及其相关技术被广泛应用在各种标 记免疫分析技术领域中，尤其为标记 免疫检测自动化分析做出了极大的贡 献。
一、生物素-亲合素系统基本类型 及原理

生物素脱氧核苷三磷酸（如Bio-dUTP）
作为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法（DNase I和DNA 聚合酶I）掺入到双链DNA中。

BNHS和BHZ
可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。
目前常用光生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素。
二、活化生物素标记蛋白质
特性：

活化生物素通过侧链与蛋白分子连接； 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性（是BAS多级放 大作用的物质基础）；
第三节 生物素-亲合素系统(BAS)的特点
适用性广泛：BAS的多级放大作用，以及既可
偶联生物大分子，又可连接标记材料，使BAS不 仅用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测 及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各 类反应体系中反应物的分离、纯化。
其他：可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；
反应试剂可高度稀释，特别是与一抗偶联使用可 大幅减少一抗用量，降低实验成本；实验所需时 间不长。
B· * E A ຫໍສະໝຸດ Baidu-B· E（酶因活性中心受空间位阻作用而失活）
Ag·Ab Ag· A Ag· E A-B· （酶活性降低 反应系统： B· * 、Ag· E A、Ab（限量）、标准Ag/待检Ag Ag· A和待检Ag竞争结合限量Ab，若Ag ） 酶活性变化与待测标本中抗原浓度呈负剂量相关。
三、生物素-亲合素系统在荧光免 疫技术中的应用
小 结

生物素—亲合素（链霉亲合素）系统具有的 多级放大独特效应，可极大地提高分析测定 的灵敏度；二者之间的高亲和、高特异结合 以及既可偶联生物大分子，又可连接标记材 料的特性，使该系统在标记免疫分析技术领 域中的应用具有很强的稳定性和适用性。该 系统有二种基本类型：以游离亲合素为中间 物，分别连接包含生物素化大分子的待检反 应体系和标记生物素的BAB法或ABC技术；另 一类是直接用标记亲合素连接生物素化大分 子反应体系进行检测的BA法或LAB。此外， 按生物素化第一抗体或生物素化第二抗体， 又分为直接法或间接法BAS系统。
生物素-亲合素放大技 术
第一节 生物素的理化性质与标记 一、活化生物素 二、活化生物素标记蛋白质
第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记 一、理化特性 二、亲合素（或链酶亲合素）的标记
第三节 生物素-亲合素系统的特点 一、灵敏度 二、特异性 三、稳定性 四、适用性 五、其他 第四节 生物素-亲合素系统的应用 一、生物素-亲合素系统基本类型及原理 二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用 三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用 四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用 五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用 思考题 小结
度显著提高。
BA
BAB
BAB与ABC成员相 同，反应顺序不同
ABC
此外，按待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体 ，BAS分为直接法和间接法。
BAS实验方法及反应层次
直接法
方 法 BA BAB ABC BA BAB ABC
反应层次 Ag-(Ab-B)-A* Ag-(Ab-B)-A-B* Ag-(Ab-B)-A-B*C Ag-Ab1-(Ab2-B)-A* Ag-Ab1-(Ab2-B)- A-B* Ag-Ab1-(Ab2-B)- A-B*C
思考题
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
9. 10.
生物素的分子结构特点是什么？ 生物素通过什么结构、形式与生物大分子相连结？ 亲合素或链霉亲合素的分子结构、理化性质有何特点？ 为什么亲合素、链霉亲合素具有“桥联”作用？ 亲合素、链霉亲合素可以被哪些示踪剂标记？ 为什么生物素－亲合素系统具有放大作用？ 生物素与亲合素或链霉亲合素的结合是否与抗原抗体结合相同？ 生物素－亲合素系统放大的是反应过程还是单一检测信号？ 生物素、亲合素或链霉亲合素如何与标记免疫技术联接？ 如何将生物素－链霉亲合素放大系统用于所有双位点ELISA?
间接法
二、生物素-亲合素系统在酶免疫 测定中的应用
BAS在ELISA中的应用 ：
BAS用于固相化抗原/抗体的制备
先与生物素结合 AV/SA先包被固相载体、抗原/抗体 AV/SA-B反应而使抗原/抗体固相化。
BAS用于ELISA的终反应放大
BA-ELISA、BAB-ELISA、ABC-ELISA
BAS在均相酶免疫测定中的应用：
第三节 生物素-亲合素系统(BAS)的特点 灵敏度高:生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原/
抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同 时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，因此 ，BAS具有多级放大作用，反应的灵敏度高。
稳定性高和特异性强：AV/SA与生物素结合的亲
和常数比抗原-抗体反应至少高1万倍，二者的结合呈高度专一 性和不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂以 及反应试剂的高度稀释均不影响其结合。因此，BAS稳定性高 ，特异性强。
Ag-Ab· B-A/SA· E
特点：以A· · E/SA E代替BAB法中的A/SA，省却了加B· E的步骤
3.
ABC法
⑴ ⑵ A+B· E Ag+B· Ab A- B· E----ABC Ag-Ab· B
ABC
Ag-Ab· B-ABC
特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物 ABC,网络了大量酶分子，使该法的检测灵敏

在生物素—亲合素（链霉亲合素）放大系统应 用中，无论采用酶、荧光素或发光物作为检测 示踪剂，均是待测抗原与生物素化抗体反应形 成复合物后，再利用生物素与亲合素间的多价 放大结合特性，或直接与标有示踪剂的生物素 结合（BA、LAB法），或依次与亲合素（链霉 亲合素）、生物素示踪标记物反应连接成聚合 物（BAB、ABC法），最终使待测反应信号被放 大，提高检测方法的灵敏度。
结构 PI 结合位 生物素 Ka 活性 四亚基糖蛋白 10.5 色氨酸 4 1015 13～15U
链霉亲合素(SA)
四肽链蛋白 无糖基 6 色氨酸 4 1015 15～18U
SA表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合
远低于AV，因此目前以SA标记的酶结合物更为常用 。
二、亲合素/链霉亲合素的标记

BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质, BHZ则多标记微 酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；

可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，活性降低；
注意事项：

选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；

控制生物素：蛋白质比例
生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；
四、生物素-亲合素系统在放射免 疫测定中的应用
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
五、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用

以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化
如何减小空间位阻
长臂活化生物素（BCNHS）：
生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个 6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素 与大分子基团的距离增加，更易发挥生物素 的活性作用。
标记蛋白质醛基的活化生物素
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后，
标记蛋白质巯基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
生物素 N-羟基丁二酰胺
碳二亚胺 生物素羟 基琥珀酰 亚胺酯 (BNHS)
BNHS分子可与蛋白质 赖氨酸（碱性AA）的氨基形成肽键
BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质
生物素分子量小，当与抗体或酶形成 生物素标记结合物后，由于大分子蛋白 的空间位阻效应，可对生物素与亲和素 的结合以及BAS的应用效果造成干扰。

将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR (immuno-PCR)用于抗原的检测
如DNA· B-SA· ProA-IgG-Ag, Ag和DNA间建立对应关系，从而将对蛋白质的检 测转化为对核酸的检测，抗原抗体反应的特异性与PCR技术的高度敏感性 相结合，其检测灵敏度可达10-21mol水平，是迄今最敏感的分析方法。