生物素-亲合素放大技术
临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
3、按BNHS：抗体1：8 ～1：15（体积比）混合， 室温搅拌下反应2 ～4小时；
4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 ℃ 透析过夜；
5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻 存备用。
2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成 新的标记物。
10
3、生物素标记抗体（IgG）的制备 基本原理 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-
C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽 键，从而使其标记上生物素。
11
4、实验流程
1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶 液；
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素 -过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗（抗）体接触， 将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为 ABC法。
29
17第三节生物素和亲和素系统的技术方法一桥联亲和素生物素法bridgedavidinbiotintechnologybab法lymphocytebab法直接法检测原理示意图18二标记亲和素生物素法labelledavidinbiotintechlab间接法lab法直接法检测原理示意图20abc双抗体夹心elisa检测原理示意图三亲和素生物素化酶复合物法abcpapabc复合法检测原理示意图四酶抗酶亲和素生物素化酶复合物法papabc23第四节技术评价与应用领域1生物素b和亲和素a之间的高亲和力使反应试剂经得起高度稀释降低或避免了非特异性结合
的羧基经活化修饰 后形成的衍生物， 只有活化生物素才 能偶联各种其他生 物大分子，如蛋白 质、多糖、荧光素 等。
9章生物素亲和素
生物素活化
标记蛋白质醛基的活化生物素
标记蛋白质巯基的活化生物素
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
三、生物素标记蛋白质
1. 标记方式 生物素化蛋白质衍生物有二类： 一种是生物素化的大分子生物活性物 质（如生物素化抗原、抗体） 另一种是标记材料（如酶）结合生物 素后制成的标记物（如生物素 化酶）。
亲和素与链霉亲和素不同点
特点 等电点 分子量(KD) 是否有糖基 非特异吸附
AV 10.5 67 有 多
SAV 6 .0 65 无 少
三、SA和SAV的标记物 几乎所有用于标记的物质均可以同AV和 SAV结合， 125I、胶体金、荧光素、化学发光物 等 小分子物质 酶、抗原、抗体等大分子物质
BAS技术基本类型
1.BAB法（biotin--avidin bind，BAB ）， 也称为桥联亲和素－标记生物素法 （BRAB） 2.标记亲和素-生物素法（BA） （labeledavidin-biotin，LAB）
BAS技术基本类型
BAB法
（biotin--avidin bind，BAB）
及既可偶联生物大分子，又可连接荧光
素、酶等标记材料的特性，使该系统在
标记免疫分析技术领域中的应用具有很
强的稳定性和适用性。
第二节
生物素的理化性质及其标记物
一、生物素的特性 生物素（biotin，B）又称维生素H，辅酶R 分子量-----244.31 广泛分布于动、植物组织中，常从含 量较高的卵黄和肝组织中提取。生物素分 子有两个环状结构
生物素-亲和素预定位技术在肿瘤诊断和治疗中的应用
步法 、 ４步法和 ５步法等。多步法是在 ２步 法原 理的基础上 ， 由于需要清除体 内相关的影响因子， 而选择不 同的清除剂而
收稿 日期 ： ０ —２１ ２ ９１ ７ ０ 基金 项 目 ： 国家 自然科 学 基 金 面 上项 目 ： ６０ ８ ３ ７ ５４ ０
２ ０年 ２月第 １ ０１ ７卷 第 ｌ
５ ７
・
综
述 ・
生 物 素 ． 和 素 预 定 位 技 术 在 亲 肿 瘤 诊 断 和 治 疗 中 的应 用
邓新 荣 杜 ， 进。 罗志福 ，
（． １ 中国 原子 能科 学研 究 院 同位 素 研 究 所 ， 京 １２ １ ；． 北 ０４ ３ ２ 中国 同位 素 有 限公 司 ， 京 １０４ ） 北 ０ ０ ５ 用中具有 广泛 的应用前景。利用其作 用特点进 行肿瘤 显像诊 断和靶
向治 疗 的 研 究 是一 个 热 点 。 ２ 生 物 素一 亲和 素 系 统预 定 位 技 术 在肿 瘤 显 像 和 治 疗 中
应 用 的研 究现 状
肿瘤组织的浓聚 ， 提高了药物的有效性并减少 了毒副作用 。 预定位技 术 的 机 理 主 要 依 据 两 类 反 应 ： 和 素 （ 白素 ， 亲 卵
ａｉ ｎＡ） ｖ ｉ， 或抗 生 物 素 蛋 白链 菌 素 （ 霉 亲 和 素 ） ｓ ｅｔ ｉｉ， ｄ 链 （ｔ ｐａ ｄｎ ｒ ｖ
旦结合后很难分离 。但 当生 物素或 亲和 素的活性 受到 损
伤时 。 其结 合能 力 会 下 降 ０ 。
１２ 生物素 ． 亲和 素 系统的 特点
Ｂ Ｓ既 可偶 联 抗 体 等一 系列 大 分 子 活 性 物 质 ， 可 被 酶 Ａ 又
肿 瘤 预定 位 显 像 和 治 疗 的 具 体 方 案 可 以 分 为 ２步 法 、 ３
主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术
第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。
生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。
生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。
一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。
BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键。
从而使蛋白质标记上生物素。
（二）标记蛋白质醛基的活化生物素用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。
（四）标记核酸的活化生物素活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。
2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。
2.标记酶生物素标记辣根过氧化物酶第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。
生物素亲和素
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
分子量：68 000
比活性：A≥12u/mgP
亲和常数：1015/mol
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记特点：BHZ与蛋白质中的 醛基结合而标记
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：
能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻 效应，又可扩大其结合的对象。
生物素侧链的末
端羧基经化学修
饰后制成带各种 活性基团的衍生
物－活化生物素
(生物素化衍生 物)
标记蛋白质氨基的活化生物素
N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） 长臂活化生物素（BCNHS）
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
生物素-亲和素免疫放大技术
第十一章生物素 -亲和素免疫放大技术一、生物素 - 亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。
二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素N- 羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）2. 标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素3- （ N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和 BHZ。
（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
标记方法：（ 1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用 BHZ。
（ 2）标记酶：以生物素标记HRP为例。
标记注意事项：（ 1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。
三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团 - 色氨酸。
2.链霉亲和素及其活性：活性基团- 色氨酸。
3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC 和胶体金。
亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1） HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素 - 生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素 - 生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。
四、生物素 - 亲和素系统的应用1.生物素 - 亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素 - 生物素化酶复合物技术（ ABC）。
生物素-亲和素标记技术完整讲解
4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡 2.上样 3.洗杂 4.洗脱
五 反应特点
1. BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。
1包被抗原2洗涤3待测抗体4洗涤5生物素标二抗6洗涤7加亲和素8洗涤9加酶标生物素10洗涤11加底物12显色后加终止液直接法步骤2亲和素生物素过氧化物酶法abc法即亲和素生物素过氧化物酶法avidinbiotincomplextechnologyabc其原理是预先按一定比例将亲和素或链霉亲和素与酶标生物素结合形成可溶性的亲和素或链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物当其与检测反应体系中的生物素化一抗直接法或生物素化二抗间接法相遇时复合物中未饱和的亲和素或链霉亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合
磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共 价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离 生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能 力。
4.1.4 在免疫酶技术中的应用
BAS应用于免疫酶技术，通过生物素-亲和素将免疫复 合物与辣根过氧化物酶连接起来，形成免疫酶-生物素-亲 和素法。赵金富等用合成的雌三醇-生物素复合物(E3Biotin)结合辣根过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作
BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis，IRMA)方法偶联， 先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与 抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物， 再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合， 最终使反应信号放大。 李贵平等用153Sm标记BAS，再标记抗CEA 单抗， 最后在结肠癌裸鼠模型中进行γ显像和体内分布测定， 结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等采用生物素-磁珠富集微卫星， 与传统放射性同
生物素亲和素
生物素亲和素篇一：生物素标记蛋白操作方法下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。
1、溶解2－10mg蛋白于1ml的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。
如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。
计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。
2、在打开之前，平衡生物素至室温。
加2mgSulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
（见下表）3、室温30分钟，或冰上放置2小时。
4、用30mlPBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中。
5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。
6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。
HABA法检测生物素标记效果试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mMNaclPH7.2）②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mMHABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。
如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。
比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：1、吸取900ulHABA/亲和素溶液于1ml比色杯。
2、测定该溶液在500nm处的'吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。
3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin(数值必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。
生物素-亲和素
该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合,进一
步提高检测灵敏度。
免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫
测定基础上发展起来的一种新的免疫学技术。是 凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、 敏感性、稳定性及可重复性的有机结合。
5. BA -组织化学技术
利用BA 技术将染料浓聚于靶细胞表面， 使其更利于观察， 提高了检测灵敏度。 Xia Y1 等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤
性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生 物有生物素酰肼（BHZ）及肼化生物素 （BCHZ）。
亲和素（ Avidin ）－抗生物素蛋白、抗生物素
是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白， 它由四个相同的氨基酸亚基组成， 亚基之间通过二硫键连接，亲和素 的每一个亚基含有一个与生物素结 合的位点，并与生物素或其衍生物 形成高度稳定的复合物。
1. BA-酶免疫技术
原理
亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再 将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔
内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来，
能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。
优点
生物素对抗体和酶的标记率高，又不影响其 他活性。 生物素亲和素的结合极为稳定，不会在孵育 和各种洗涤过程中脱落。 每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合 更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感 性。
۞ Morag
G.等使用硝基-(链霉)亲和素吸附于分离柱 上,分离提纯兔抗血清中的免疫球蛋白、抗-转移因 子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离 柱的生物学特性。
۞在制备特异性破骨细胞cDNA库时,加入 生物素化的mRNA,然后通过固相亲和素提取。 用斑点印迹法分析,发现在此提取物中, 高度聚集了特异性破骨细胞cDNA。
生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析
4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
生物素-亲和素系统相关技术3
3、BAS在放射免疫技术中的应用
4、
BAS在分子生物学中的应用
免疫-PCR
免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来 的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化 底物显色。
PCR具有很强的放大能力，其可以定量 地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和 特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通 过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由 此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
PCR技术具有高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
二、免疫PCR的发展
免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的
还不多；
实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，
且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几 百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检 测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适 用于检测一些含量特别少的抗原分子。
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯
（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。
2.标记蛋白质醛基：酰肼（BHZ）和肼化生
物胞素（BCHZ）。
3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）
-生物胞素（MPB）。
4.标记核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三
磷酸、BNHS和BHZ。
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯
降低ALP的活性。
活化生物素可与不同的大分子物质结合，应
根据可标记基团的种类及特性，选择相应的
活化生物素；
抗体：BNHS
偏酸性抗原：BHZ
核酸：光生物素
一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，即
生物素化大分子具有多价性，它是BAS多级 放大作用的物质基础。
免疫标记：四大免疫标记原理介绍
免疫标记：四大免疫标记原理介绍！为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。
常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。
这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabelling technique)。
免疫标记不仅大大提高了试验敏感性，若与光镜或电镜技术相结合，能对组织或细胞内的待测物质作精确定位，从而为基础与临床医学研究及诊断提供方便。
免疫标记技术大致分为两大类：一类属于免疫组织化学技术(immunohistochemical technique)，用于组织切片或其他标本中抗原的定位。
另一类称为免疫测定(immunoassay)，用于液体标本中抗原或抗体的测定。
一，免疫酶技术(immunoenzymatic technique)最早应用的免疫酶技术是免疫酶组织化学染色，即用标记的抗体与标本中的抗原发生特异性结合，当加入酶的底物时，在酶的作用下经一系列生化反应产生有色物质，借助光镜作出定位判断。
目前，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。
该法特异性强，敏感性高，既可检测抗体，又能测定可溶性抗原。
主要方法及操作要领见图18.5，除了图示的两种方法外，还有抗原竞争法，现较少应用。
ELISA常采用的酶为辣根过氧化物酶(hosradish peroxidase，HRP)，其底物是二氨基苯胺(DAB)，底物被分解则呈棕褐色，可目测或借助酶标仪比色。
ELISA为非均相免疫测定，另外还有均相法，在此不作介绍。
由于酶免疫测定无需特殊仪器和试剂，且操作简便，利于普及。
因此，在免疫标记技术中，该法应用最为广泛，并在原有方法基础上加以改良，使得众多新的，更敏感的方法应运而生。
①生物素-亲和素放大系统(biotin-avidin system，BAS)，建立于70年代后期，通过将酶标记在生物素或亲和素上，借助生物素与亲和素的高度亲力和生物素能与抗体结合的特点应用于ELISA，显著提高了检测的敏感性。
生物素-亲和素放大技术
生物素-亲和素放大技术生物素与亲和素之间结合的亲和力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及两者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性。
生物素的理化性质与标记亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记生物素-亲和素系统的特点生物素-亲和素系统的应用生物素的理化性质与标记生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。
活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，使之容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。
包括能标记蛋白质氨基、醛基、巯基和核酸的活化生物素。
常用于标记核酸分子的活化生物素有以下几种：1.光敏生物素它是一种化学合成的生物素衍生物，用于DNA或RNA的标记。
2.生物素脱氧核苷三磷酸先将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。
可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。
3.BNHS和BHZ 二者均可以在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
而且一个蛋白质分子可连接多个生物素分子，从而使其具有较高的比活性，在与亲和素的反应中成为多价。
生物素化大分子的多价性，是BAS多级放大作用的物质基础。
生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
（二）标记注意事项1.选择正确的活化生物素和反应条件；2.应有适当的比例，以免影响被标志物的活性；3.可在生物素与被标志物间加入交联臂样结构；4.不影响被标记物的免疫活性。
亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素（AV）和链霉亲和素（SA）是生物亲和素的天然特异性结合物。
而且，二者均为大分子蛋白，几乎所有用于标记的物质均可以与之结合。
生物素-亲和素标记技术完整讲解
直接法：
+ B-E + A
ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
直接法 间接法
（3）标记生物素-抗生物素法
标记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin， LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接 与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色 反应，间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合， 由于加入了二抗，较直接法检测灵敏度要高，对 免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB 法需以生物素标记一抗，应用不如ABC法普遍， 与ABC法相比，LAB法操作较简单，但灵敏度较 低
亲和素：
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大， 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的 结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
生物素亲和素放大系统
生物素亲和素放大系统
生物素亲和素放大系统（Biotin-Avidin Amplification System）是免疫组织化学技术中常用的增强方法。
其原理是生物素与链霉亲和素（Avidin）结合后形成生物素-链霉亲和素复合物，生物素-链霉亲和素复合物与连接荧光素等物质的新化学实体进一步增强了检测灵敏度。
在该系统中，样品经过初级抗体与标记试剂（如酶标记抗体或荧光标记抗体）结合后，再加上与标记试剂相称的生物素化二抗，使生物素化二抗与标记试剂结合。
最后，加入与生物素结合的标记试剂（如辣根过氧化物酶（HRP）偶联的荧光素）来检测目标分子。
这种方法在检测抗原、蛋白质、核酸等方面具有广泛应用。
生物素-亲合素系统
生物素-亲合素系统生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。
随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。
生物素亲合素系统1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点，建立了标记亲合素和生物素法（LAB／BA）与桥联亲合素—生物素技术（BRAB）。
1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法（ABC法）。
近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、S PA等。
生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。
BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。
BAS用于检测的基本方法可分为三大类。
第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。
第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素-生物素法(BRAB)。
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。
尽管方法很多，但在目前国内主要还是BAS-ELISA法。
特别是其中的BA法和ABC法用得较多。
至于其它标记材料(如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等) 的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再根据B AS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序。
BAELISA原理BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。
亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kD a，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。
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标记核酸的活化生物素
光生物素(photobiotin)
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后,
变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结
合, 形成B（生物素）-核酸探针
生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）
作为TTP（三磷酸胸苷）的结构类似物，可 采用缺口移位法掺入化 特 性
亲合素（A）
结构 四亚基糖蛋白 pI 10.5 结合位 色氨酸 生物素 4 K（亲和常数） 1015 活性(U) 13～15
链霉亲合素(SA)
四肽链蛋白 无糖基 6 色氨酸 4 1015 15～18
二、亲合素/链霉亲合素标记
标记物：酶、胶体金 异硫氰酸荧光素（FITC） HRP-AV(SA) 改良过碘酸钠法、戊二醛法 ABC/SABC 预制亲和素(AV)-Biotin、 链霉亲和素(SAV)-Biotin
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
四、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用
以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离 纯化 将免疫测定技术与PCR结合建立免疫PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测。
可直接标记核酸， 但对碱基配对有影 响（影响氢键的形成）
二、生物素标记蛋白质
活化生物素通过侧链与蛋白分子连接 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记偏酸性抗原； 抗原、抗体标记后活性不变 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记 后活性将降低
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
第四部分 生物素-亲合素系统的应用
生物素与亲合素之间结合的亲合力高、 特异性强 生物素与亲合素各自均可以与各型大 小分子结合，以及二者在结合反应时 具有的多级放大作用等优越性 使BAS及其相关技术被广泛应用在各种 标记免疫分析技术领域中，尤其为标 记免疫检测自动化分析做出了极大的 贡献
与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质巯基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
生物素 N-羟基丁二酰胺
碳二亚胺 生物素N羟基丁二 酰亚胺酯 （BNHS ）
BNHS分子可与蛋白质赖 氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质
如何减小空间位阻？
长臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添 加了两个6-氨基已糖分子基团，形 成连结臂，以减少位阻效应的影响
长臂活化生物素 (BCNHS) 是在生物素和 N-羟基 丁二酰亚胺之间添加了两个 6- 氨基己糖分子基 团，形成连结臂， 使其与抗体、酶等生物大分子 结合后，不受位阻效应的影响, 更易发挥生物素 的活性作用
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记
基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸
碱性
控制生物素:蛋白质比例
① 生物素:IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1
② IgG应用浓度0.5~5μg/ml
③ 1~3个生物素/1个Ag，3~5个生物素/1个Ab
使用交联臂减少空间阻力
第二部分 亲合素、链霉亲合 素的理化性质与标记
BA法（标记亲和素生物素法）
特点：以标记亲和素/标 记链霉亲和素（AE/SA-E）代替BAB法中 的游离亲和素（A）， 省却了加标记生物素 （B-E）的步骤
BA法（标记亲和素-生物素法）：以标记亲和素/标记 链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的亲和素 （A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤
A-E
+A-E
+ B-E + A ABC
ABC法
特点:将BAB法中的A（亲和素） 先与B-E（酶标生物素）结合， 制备成复合物ABC（亲和素-生物 素-过氧化酶复合物）
ABC法 原理示意图
特点：将BAB法中的A（亲和素）先与B-E（酶标生 物素）结合，制备成复合物ABC
预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物素结合，形成可溶 性的亲和素（或链霉亲和素）-生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。 当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体 （间接法）相遇时，ABC（或SABC）复合物中未饱和的亲和素（或链霉亲 和素）结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应体系与ABC （或SABC）标记体系连成一体进行检测
方法应用
BSA在酶免疫测定中的应用 BSA在荧光免疫技术中的应用 BSA在放射免疫测定中的应用 BSA在分子生物学中的应用
一、生物素-亲合素系统在酶免疫 测定中的应用
BAS在ELISA中的应用
生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定
BAB-ELISA夹心法测抗原的原理：用生物素化的抗体替代 常规ELISA中的酶标抗体，与已与固相抗体结合的抗原抗 体复合物结合，然后连接亲和素及酶标生物素，从而使反 应信号放大，提高检测灵敏度
二、生物素-亲合素系统在荧光免 疫技术中的应用
BAS用于荧光抗体技术 通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲 合素（或链酶亲合素） 游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两 端分别连接生物素化抗体和荧光素标记 的生物素（BAB法） 荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素） 抗体的夹心法
三、生物素-亲合素系统在放射免 疫测定中的应用
标记蛋白质醛基的活化生物素
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物
主要用于标记偏酸性糖蛋白(Ag)
肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接 后，再与无水肼反应而成。除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特异地与 蛋白质巯基结合的活化生物素
- 报告结束 –
请各位专家提出宝贵意见
第三部分 生物素-亲合素系统的特点、 基本类型及原理
一、特点: 灵敏度 特异性 稳定性 适用性 其他
①灵敏度高 ②其反应呈高度专一性 ③稳定性高 ④适用范围广 ⑤实验成本低
二、生物素-亲合素系统基本类型及原理
BAB法（亲和素-标记生 物素法）： 特点：以游离亲和素为 桥臂，分别连接生物 素化抗原（或抗体） 和标记生物素（如酶 标生物素）
生物素－亲和素免疫放大技术
培训人：马秀玲
概述：
70年代后期在免疫酶技术中利用生物素亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)标记抗体发展了又一种新型生物反 应放大技术。
主要内容
生物素理化性质与标记 亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记 生物素-亲和素的特点、基本类型及原理 生物素-亲和素系统的应用
亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物 二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记 的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素 （SA）结合
生物素（Biotin, B）
亲合素(Avidin, AV)
亲和素（Avidin)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素 结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素
I 咪唑酮环
羧基
Ⅱ
噻吩环
一、活化生物素
生物素侧链的末
端羧基经化学修 饰后制成带各种 活性基团的衍生 物－活化生物素 (生物素化衍生物)
II环为噻吩环，其末端羧基是结合抗体和其他 生物大分子的惟一结 构，经化学修饰后成为活化生物素
生物素活化
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记蛋白质醛基的活化生物素
活化生物素易
第一部分
生物素理化性质与标记
生物素（Biotin)有两个环状结构 I环（咪唑酮环）为与亲和素结合 维生素H 的主要部位 动、植物组织中广泛 II环（噻吩环）为结合抗体和其它 分布,卵黄和肝含量高 生物大分子的部位，C2上戊酸侧 链的未端羧基是结合生物大分子 MW 244.31kD 的唯一结构
亲和素-标记生物素法（BAB法）：先使抗原与生物素 （B）化的抗体结合，再以游离亲合素(A)将生物素化的 抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果
酶标生物素 底物
亲合素(A)
生物素化的抗体
+A
+A
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BAB法（亲和素-标记 生物素法）：
特点：以游离亲和素 为桥臂，分别连接生物 素化抗原（或抗体）和 标记生物素（如酶标生 物素）