生物素-亲合素放大技术
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可直接标记核酸， 但对碱基配对有影 响（影响氢键的形成）
二、生物素标记蛋白质
活化生物素通过侧链与蛋白分子连接 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记偏酸性抗原； 抗原、抗体标记后活性不变 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记 后活性将降低
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
第四部分 生物素-亲合素系统的应用
生物素与亲合素之间结合的亲合力高、 特异性强 生物素与亲合素各自均可以与各型大 小分子结合，以及二者在结合反应时 具有的多级放大作用等优越性 使BAS及其相关技术被广泛应用在各种 标记免疫分析技术领域中，尤其为标 记免疫检测自动化分析做出了极大的 贡献
与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质巯基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
生物素 N-羟基丁二酰胺
碳二亚胺 生物素N羟基丁二 酰亚胺酯 （BNHS ）
BNHS分子可与蛋白质赖 氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记
基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸
碱性
控制生物素:蛋白质比例
① 生物素:IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1
② IgG应用浓度0.5~5μg/ml
③ 1~3个生物素/1个Ag，3~5个生物素/1个Ab
使用交联臂减少空间阻力
第二部分 亲合素、链霉亲合 素的理化性质与标记
标记核酸的活化生物素
光生物素(photobiotin)
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后,
变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结
合, 形成B（生物素）-核酸探针
生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）
作为TTP（三磷酸胸苷）的结构类似物，可 采用缺口移位法掺入到双链DNA中。
BNHS和BHZ
I 咪唑酮环
羧基
Ⅱ
噻吩环
一、活化生物素
生物素侧链的末
端羧基经化学修 饰后制成带各种 活性基团的衍生 物－活化生物素 (生物素化衍生物)
II环为噻吩环，其末端羧基是结合抗体和其他 生物大分子的惟一结 构，经化学修饰后成为活化生物素
生物素活化
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记蛋白质醛基的活化生物素
活化生物素易
亲和素-标记生物素法（BAB法）：先使抗原与生物素 （B）化的抗体结合，再以游离亲合素(A)将生物素化的 抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果
酶标生物素 底物
亲合素(A)
生物素化的抗体
+A
+A
返回
BAB法（亲和素-标记 生物素法）：
特点：以游离亲和素 为桥臂，分别连接生物 素化抗原（或抗体）和 标记生物素（如酶标生 物素）
标记蛋白质醛基的活化生物素
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物
主要用于标记偏酸性糖蛋白(Ag)
肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接 后，再与无水肼反应而成。除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特异地与 蛋白质巯基结合的活化生物素
BA法（标记亲和素生物素法）
特点：以标记亲和素/标 记链霉亲和素（AE/SA-E）代替BAB法中 的游离亲和素（A）， 省却了加标记生物素 （B-E）的步骤
BA法（标记亲和素-生物素法）：以标记亲和素/标记 链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的亲和素 （A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤
一、理 化 特 性
亲合素（A）
结构 四亚基糖蛋白 pI 10.5 结合位 色氨酸 生物素 4 K（亲和常数） 1015 活性(U) 13～15
链霉亲合素(SA)
四肽链蛋白 无糖基 6 色氨酸 4 1015 15～18
二、亲合素/链霉亲合素标记
标记物：酶、胶体金 异硫氰酸荧光素（FITC） HRP-AV(SA) 改良过碘酸钠法、戊二醛法 ABC/SABC 预制亲和素(AV)-Biotin、 链霉亲和素(SAV)-Biotin
亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物 二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记 的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素 （SA）结合
生物素（Biotin, B）
亲合素(Avidin, AV)
亲和素（Avidin)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素 结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素
生物素－亲和素免疫放大技术
培训人：马秀玲
概述：
70年代后期在免疫酶技术中利用生物素亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)标记抗体发展了又一种新型生物反 应放大技术。
主要内容
生物素理化性质与标记 亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记 生物素-亲和素的特点、基本类型及原理 生物素-亲和素系统的应用
二、生物素-亲合素系统在荧光免 疫技术中的应用
BAS用于荧光抗体技术 通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲 合素（或链酶亲合素） 游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两 端分别连接生物素化抗体和荧光素标记 的生物素（BAB法） 荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素） 抗体的夹心法
Leabharlann Baidu
三、生物素-亲合素系统在放射免 疫测定中的应用
方法应用
BSA在酶免疫测定中的应用 BSA在荧光免疫技术中的应用 BSA在放射免疫测定中的应用 BSA在分子生物学中的应用
一、生物素-亲合素系统在酶免疫 测定中的应用
BAS在ELISA中的应用
生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定
BAB-ELISA夹心法测抗原的原理：用生物素化的抗体替代 常规ELISA中的酶标抗体，与已与固相抗体结合的抗原抗 体复合物结合，然后连接亲和素及酶标生物素，从而使反 应信号放大，提高检测灵敏度
A-E
+A-E
+ B-E + A ABC
ABC法
特点:将BAB法中的A（亲和素） 先与B-E（酶标生物素）结合， 制备成复合物ABC（亲和素-生物 素-过氧化酶复合物）
ABC法 原理示意图
特点：将BAB法中的A（亲和素）先与B-E（酶标生 物素）结合，制备成复合物ABC
预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物素结合，形成可溶 性的亲和素（或链霉亲和素）-生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。 当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体 （间接法）相遇时，ABC（或SABC）复合物中未饱和的亲和素（或链霉亲 和素）结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应体系与ABC （或SABC）标记体系连成一体进行检测
第三部分 生物素-亲合素系统的特点、 基本类型及原理
一、特点: 灵敏度 特异性 稳定性 适用性 其他
①灵敏度高 ②其反应呈高度专一性 ③稳定性高 ④适用范围广 ⑤实验成本低
二、生物素-亲合素系统基本类型及原理
BAB法（亲和素-标记生 物素法）： 特点：以游离亲和素为 桥臂，分别连接生物 素化抗原（或抗体） 和标记生物素（如酶 标生物素）
第一部分
生物素理化性质与标记
生物素（Biotin)有两个环状结构 I环（咪唑酮环）为与亲和素结合 维生素H 的主要部位 动、植物组织中广泛 II环（噻吩环）为结合抗体和其它 分布,卵黄和肝含量高 生物大分子的部位，C2上戊酸侧 链的未端羧基是结合生物大分子 MW 244.31kD 的唯一结构
如何减小空间位阻？
长臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添 加了两个6-氨基已糖分子基团，形 成连结臂，以减少位阻效应的影响
长臂活化生物素 (BCNHS) 是在生物素和 N-羟基 丁二酰亚胺之间添加了两个 6- 氨基己糖分子基 团，形成连结臂， 使其与抗体、酶等生物大分子 结合后，不受位阻效应的影响, 更易发挥生物素 的活性作用
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
四、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用
以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离 纯化 将免疫测定技术与PCR结合建立免疫PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测。
- 报告结束 –
请各位专家提出宝贵意见
二、生物素标记蛋白质
活化生物素通过侧链与蛋白分子连接 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记偏酸性抗原； 抗原、抗体标记后活性不变 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记 后活性将降低
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
第四部分 生物素-亲合素系统的应用
生物素与亲合素之间结合的亲合力高、 特异性强 生物素与亲合素各自均可以与各型大 小分子结合，以及二者在结合反应时 具有的多级放大作用等优越性 使BAS及其相关技术被广泛应用在各种 标记免疫分析技术领域中，尤其为标 记免疫检测自动化分析做出了极大的 贡献
与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质巯基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
生物素 N-羟基丁二酰胺
碳二亚胺 生物素N羟基丁二 酰亚胺酯 （BNHS ）
BNHS分子可与蛋白质赖 氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记
基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸
碱性
控制生物素:蛋白质比例
① 生物素:IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1
② IgG应用浓度0.5~5μg/ml
③ 1~3个生物素/1个Ag，3~5个生物素/1个Ab
使用交联臂减少空间阻力
第二部分 亲合素、链霉亲合 素的理化性质与标记
标记核酸的活化生物素
光生物素(photobiotin)
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后,
变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结
合, 形成B（生物素）-核酸探针
生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）
作为TTP（三磷酸胸苷）的结构类似物，可 采用缺口移位法掺入到双链DNA中。
BNHS和BHZ
I 咪唑酮环
羧基
Ⅱ
噻吩环
一、活化生物素
生物素侧链的末
端羧基经化学修 饰后制成带各种 活性基团的衍生 物－活化生物素 (生物素化衍生物)
II环为噻吩环，其末端羧基是结合抗体和其他 生物大分子的惟一结 构，经化学修饰后成为活化生物素
生物素活化
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记蛋白质醛基的活化生物素
活化生物素易
亲和素-标记生物素法（BAB法）：先使抗原与生物素 （B）化的抗体结合，再以游离亲合素(A)将生物素化的 抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果
酶标生物素 底物
亲合素(A)
生物素化的抗体
+A
+A
返回
BAB法（亲和素-标记 生物素法）：
特点：以游离亲和素 为桥臂，分别连接生物 素化抗原（或抗体）和 标记生物素（如酶标生 物素）
标记蛋白质醛基的活化生物素
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物
主要用于标记偏酸性糖蛋白(Ag)
肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接 后，再与无水肼反应而成。除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特异地与 蛋白质巯基结合的活化生物素
BA法（标记亲和素生物素法）
特点：以标记亲和素/标 记链霉亲和素（AE/SA-E）代替BAB法中 的游离亲和素（A）， 省却了加标记生物素 （B-E）的步骤
BA法（标记亲和素-生物素法）：以标记亲和素/标记 链霉亲和素（A-E/SA-E）代替BAB法中的亲和素 （A），省却了加标记生物素（B-E）的步骤
一、理 化 特 性
亲合素（A）
结构 四亚基糖蛋白 pI 10.5 结合位 色氨酸 生物素 4 K（亲和常数） 1015 活性(U) 13～15
链霉亲合素(SA)
四肽链蛋白 无糖基 6 色氨酸 4 1015 15～18
二、亲合素/链霉亲合素标记
标记物：酶、胶体金 异硫氰酸荧光素（FITC） HRP-AV(SA) 改良过碘酸钠法、戊二醛法 ABC/SABC 预制亲和素(AV)-Biotin、 链霉亲和素(SAV)-Biotin
亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物 二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记 的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素 （SA）结合
生物素（Biotin, B）
亲合素(Avidin, AV)
亲和素（Avidin)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素 结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素
生物素－亲和素免疫放大技术
培训人：马秀玲
概述：
70年代后期在免疫酶技术中利用生物素亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)标记抗体发展了又一种新型生物反 应放大技术。
主要内容
生物素理化性质与标记 亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记 生物素-亲和素的特点、基本类型及原理 生物素-亲和素系统的应用
二、生物素-亲合素系统在荧光免 疫技术中的应用
BAS用于荧光抗体技术 通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲 合素（或链酶亲合素） 游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥，两 端分别连接生物素化抗体和荧光素标记 的生物素（BAB法） 荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素） 抗体的夹心法
Leabharlann Baidu
三、生物素-亲合素系统在放射免 疫测定中的应用
方法应用
BSA在酶免疫测定中的应用 BSA在荧光免疫技术中的应用 BSA在放射免疫测定中的应用 BSA在分子生物学中的应用
一、生物素-亲合素系统在酶免疫 测定中的应用
BAS在ELISA中的应用
生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定
BAB-ELISA夹心法测抗原的原理：用生物素化的抗体替代 常规ELISA中的酶标抗体，与已与固相抗体结合的抗原抗 体复合物结合，然后连接亲和素及酶标生物素，从而使反 应信号放大，提高检测灵敏度
A-E
+A-E
+ B-E + A ABC
ABC法
特点:将BAB法中的A（亲和素） 先与B-E（酶标生物素）结合， 制备成复合物ABC（亲和素-生物 素-过氧化酶复合物）
ABC法 原理示意图
特点：将BAB法中的A（亲和素）先与B-E（酶标生 物素）结合，制备成复合物ABC
预先按一定比例将亲和素（或链霉亲和素）与酶标生物素结合，形成可溶 性的亲和素（或链霉亲和素）-生物素-过氧化物酶复合物（ABC或SABC）。 当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体 （间接法）相遇时，ABC（或SABC）复合物中未饱和的亲和素（或链霉亲 和素）结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原-抗体反应体系与ABC （或SABC）标记体系连成一体进行检测
第三部分 生物素-亲合素系统的特点、 基本类型及原理
一、特点: 灵敏度 特异性 稳定性 适用性 其他
①灵敏度高 ②其反应呈高度专一性 ③稳定性高 ④适用范围广 ⑤实验成本低
二、生物素-亲合素系统基本类型及原理
BAB法（亲和素-标记生 物素法）： 特点：以游离亲和素为 桥臂，分别连接生物 素化抗原（或抗体） 和标记生物素（如酶 标生物素）
第一部分
生物素理化性质与标记
生物素（Biotin)有两个环状结构 I环（咪唑酮环）为与亲和素结合 维生素H 的主要部位 动、植物组织中广泛 II环（噻吩环）为结合抗体和其它 分布,卵黄和肝含量高 生物大分子的部位，C2上戊酸侧 链的未端羧基是结合生物大分子 MW 244.31kD 的唯一结构
如何减小空间位阻？
长臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添 加了两个6-氨基已糖分子基团，形 成连结臂，以减少位阻效应的影响
长臂活化生物素 (BCNHS) 是在生物素和 N-羟基 丁二酰亚胺之间添加了两个 6- 氨基己糖分子基 团，形成连结臂， 使其与抗体、酶等生物大分子 结合后，不受位阻效应的影响, 更易发挥生物素 的活性作用
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
四、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用
以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离 纯化 将免疫测定技术与PCR结合建立免疫PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测。
- 报告结束 –
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