亲和素和生物素的ELISA试剂盒的应用
常见的生化检测方法
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------常见的生化检测方法Western-blot 法 Western Blot 印迹法是把通过电泳分离的蛋白质组分从凝胶转移至一种固相支持物，通过抗体与附着于固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生特异性反应进行检测。
Western Blot 既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定靶蛋白表达的最方便也是最通用的方法。
1、试剂耗材的准备：⑴、转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl， 39 mM 甘氨酸， 0. 037% SDS， 20%甲醇）：⑵、 10丽春红染液：⑶、 TBS 缓冲液：⑷、 TBST 缓冲液（含 20%Tween20 的 TBS 缓冲液）：⑸、封闭液（含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液）：⑹、一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或 TBST 进行稀释。
⑺、底物显色液 ECL，4℃ 避光保存，现用现配。
⑻、显影液和定影液。
用水稀释 10-20 倍于铝盒中，可多次使用。
室温避光存放。
2、实验步骤：⑴、蛋白样品制备：1 / 15用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。
⑵、取 1mg 蛋白进行 SDS-PAGE。
⑶、转膜：（转膜缓冲液4℃预冷备用，冷却装置于-80℃冰箱冷冻备用）。
⑷、将 2 张海绵垫、 2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。
⑸、戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的 PVDF 膜（83 mm75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有 20mL 甲醇的平皿中约 15 sec，直到膜变半透明。
用纯水冲洗膜2 次。
浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。
⑹、 SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。
亲和素和生物素
亲和素和生物素：两种重要的生物学试剂一、亲和素亲和素是一种重要的生物学试剂，它是一种结合蛋白质的小分子化合物。
亲和素可以通过特定的化学反应与蛋白质结合，从而用于分离、纯化和检测蛋白质。
亲和素的结合能力基于亲和素与蛋白质之间的特异性相互作用，这种相互作用可以形成强大的结合力。
亲和素在生物学研究中有着广泛的应用，例如：1. 分离和纯化蛋白质：亲和素可以用于分离和纯化具有特定结构或功能的蛋白质，例如酶、激素、抗体等。
2. 检测蛋白质：亲和素可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，例如Western blotting、ELISA等实验。
3. 蛋白质互作研究：亲和素可以用于研究蛋白质之间的相互作用，例如酶底物、受体配体等。
二、生物素生物素是一种水溶性维生素，也是一种重要的生物学试剂。
生物素可以与亲和素结合，形成亲和素-生物素复合物，从而实现对蛋白质的分离、纯化和检测。
生物素在生物学研究中有着广泛的应用，例如：1. 蛋白质标记：生物素可以用于将生物素结合在蛋白质上，从而实现蛋白质的标记。
这种标记可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，例如Western blotting、ELISA等实验。
2. 细胞标记：生物素可以用于将生物素结合在细胞表面上，从而实现对细胞的标记。
这种标记可以用于研究细胞的生理和病理过程。
3. 蛋白质互作研究：生物素可以用于研究蛋白质之间的相互作用，例如酶底物、受体配体等。
三、亲和素和生物素的结合亲和素和生物素的结合是一种特殊的相互作用，它可以形成亲和素-生物素复合物。
这种复合物在生物学研究中有着广泛的应用，例如：1. 亲和素-生物素标记法：亲和素和生物素的结合可以用于将生物素结合在蛋白质上，从而实现蛋白质的标记。
这种标记可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，例如Western blotting、ELISA等实验。
2. 亲和素-生物素分离法：亲和素和生物素的结合可以用于分离和纯化具有特定结构或功能的蛋白质，例如酶、激素、抗体等。
ELISA原理和几种方法
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
基本原理
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
生物素-亲和素系统elisa法
生物素-亲和素系统ELISA法是一种基于生物素和亲和素之间高度特异性和高亲和力的免疫检测方法。
这种方法利用生物素和亲和素之间的结合反应，将抗原或抗体与生物素结合，再通过亲和素与生物素之间的结合反应，将抗原或抗体固定在固相载体上。
在ELISA中，生物素-亲和素系统可以用于提高检测的灵敏度和特异性。
首先，亲和素与生物素之间的结合反应非常稳定，可以减少非特异性结合，提高检测的特异性。
其次，每个亲和素可以结合4个生物素，使得反应信号放大，提高检测的灵敏度。
生物素-亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式，包括用于固相化抗体或抗原的制备、用于ELISA终反应的放大等。
在固相化抗体或抗原的制备中，先将亲和素（或链霉亲和素）包被于固相载体，抗体或抗原也先与生物素结合，然后通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。
在ELISA终反应的放大中，用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物（BA-ELISA）、或亲和素及酶标生物京（BAB-ELISA）或ABC试剂（ABC-ELISA），从而使反应信号放大，提高检测灵敏度。
总之，生物素-亲和素系统ELISA法是一种灵敏度高、特异性好的免疫检测方法，可以用于各种抗原或抗体的检测。
生物素-亲和素标记技术完整讲解
4.1.3在胶体金技术中的应用 BAS应用于胶体金技术，其原理为带正电荷的链霉亲 和素标记的带负电荷的胶体金颗粒能与生物素紧密结合， 使检测信号在只有胶体金标记或只有BAS标记的基础上得 到扩大。吕丰等应用石英晶体微天平(QCM)研究了基于 BAS的葡萄糖氧化酶的固定化，结果在利用BAS固定过的 葡萄糖氧化酶过程中，经过纳米金颗粒修饰的QCM基片 对酶的吸附量比未经修饰的基片多。张志锋等以组装型金 磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共 价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离 生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能 力。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
4.1.5 在ELISA中的应用 用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗 体，然后连接亲和素-酶结合物(BA-ELISA)、或亲 和素及酶标生物素(BAB-ELISA)或ABC试剂(ABCELISA)，从而使反应信号放大，提高检测的灵敏 度。王传彬等用生物素标记的纯化抗禽流感病毒 H5亚型血凝素单抗和酶标亲和素检测H1、H15亚 型AIV标准毒株和H5、H7、H9亚型AIV分离株， 与血凝和血凝抑制试验比较，纯化后的单抗具有 良好的反应活性。祝军等将BA-辣根过氧化物酶 复合物系统ELISA策略，对ANEPⅢ寡核苷酸适配 子的亲合力进行测定。
4.2 在分子生物学中的应用
液相杂交
麻疹病毒(MLs)IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)
麻疹病毒（MLs）IgM抗体检测试剂盒（酶联免疫法）使用说明（96T/48T）[原理]本试剂盒采用亲和素-生物素化麻疹病毒抗原预包被板ELISA 原理，检测人血清/血浆中存在的麻疹病毒IgM 抗体，并配以酶标记抗人IgM单克隆抗体作为标记物。
加入底物TMB显色后终止反应，在450nm波长测各孔O.D值，O.D值的大小与待检抗体含量成正比。
生物素系统（biotin-avidin system）的稳固级联放大作用，使试剂的特异性、灵敏度、稳定性极大地提高。
另外，血清/血浆经预吸收后非特异性因素（如RF因子和变性或聚合的人IgG）的影响被彻底消除，经验证其结果完全等同于capture-ELISA，为本试剂盒之独特点。
[用途]麻疹是是传染性很强的急性呼吸道疾病，其并发症常见为下呼吸道感染、巨细胞间质肺炎及神经系统慢性进行性疾病-亚急性硬化性全脑炎（SSPE）等。
本试剂盒用于定性检测人血清/血浆中的麻疹病毒早期IgM型抗体，对早期和原发性感染的诊断具有重要价值。
适应范围：麻疹的早期诊断和筛查。
易感人群和高发地区的监查。
[试剂盒组成]1、生物素化抗原预包被板1块（8X12/4X12）2、阴性对照血清1瓶3、阳性对照血清1瓶4、标本稀释液（含抗干扰因子）1瓶（20 ml/10ml，直接使用）5、酶结合物1瓶（12/5ml，直接使用）6、30X浓缩洗液1瓶（20/10ml，加蒸馏水1：30稀释使用）7、显示剂A、B液各1瓶（5/3ml）8、终止液（2M H2SO4）1瓶（5/3ml）9、说明书1份[操作步骤]将试剂盒平衡至室温后取出反应板拆封后置于板架上。
1、样本稀释：用标本稀释液以1：101（5ul—500ul）稀释标本，混匀后置37℃20分钟。
2、加样：小心吸取已稀释待检标本上清液100ul于反应孔中，设阴、阳性对照（各100ul）及空白对照（加100ul标本稀释液）各一孔。
轻拍混匀。
3、37℃温育30分钟。
ELISA说明书翻译
实验步骤1.开始ELISA前一天，稀释包被抗体，取酶标板每孔加入100ul包被抗体溶液，4度过夜2.使用前将所有试剂放置室温，强烈建议所有标准品和样品做复孔或三孔，各次检测均要求做标准曲线3.洗涤液不少于300ul洗板4次，并在吸水纸上拍干板子，后续洗涤液同此4.为了阻断非特异性结合和减少背景，每孔加200ul样品稀释液5.封板并在摇床上室温孵育1h6.在上述期间，准备标准品稀释液和适当的样品稀释液（如必需）7.标准品稀释：500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml,62.5 pg/ml, 31.25 pg/ml, 15.6 pg/ml,7.8pg/ml 和0 pg/ml8.如步骤3洗板4次9.每孔加入100ul标准品稀释液和样品到对应孔，如有需要可对样品进行稀释10.封板并在摇床上室温孵育2h11.如步骤3洗板4次12.每孔加入100ul已稀释的二抗，封板并在摇床上室温孵育1h13.如步骤3洗板4次14.每孔加入100ul 稀释的HRP，封板并在摇床上室温孵育30min15.如步骤3洗板5次，每次洗涤洗涤液浸泡30s至1min，有利于减少背景16.每孔加入100ulTMB显色液，并在摇床孵育15-30min，阳性孔将变为淡蓝色，此步无需封板17.每孔加入100ul终止液终止反应，阳性孔将由蓝色变为黄色18.终止反应半小时内测定OD值（450nm）ELISA实验基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
竞争法
此法可用于小分子抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。被 结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如 果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就 减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点 在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；小分子 激素、药物等ELISA测定多用此法。
掌握免疫标记技术的基本原理。 掌握三大免疫标记技术的工作原理及主要实验类型的
原理和方法。 熟悉ELISA试验的实验设计原理。 了解免疫标记技术的应用与发展。
酶免疫测定类型
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定
均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定
固相酶免疫测定 液相酶免疫测定
酶联免疫吸附试验
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫 测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。
HRP催化过氧化物的氧化反应。
供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波 长为492nm
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后， 由蓝色呈黄色，最适吸收波长为450nm .TMB性质较稳定，可 配成溶液试剂，只需与H2O2溶液进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需 稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝 标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原 的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
捕获法 测IgM抗体
ELISA知识
ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.0的碳酸盐包被缓冲液，将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
酶联免疫吸附实验(ELISA)基本原理
酶联免疫吸附实验（ELISA）基本原理基本原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELIS A）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。
这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。
②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
方法类型和操作步骤ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。
洗涤除去其他未结合的物质。
（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
酶联免疫吸附实验(ELISA)基本原理
更新时间：2004-12-210:30:001971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linkedassay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定加入酶反应的底物后，ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。
根据颜色反应的程度进行根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗15-5）。
这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。
单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA 提高到新水平。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。
当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。
钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。
其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析
4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
生物素亲和素系统在免疫检测技术中的应用
生物素亲和素系统在免疫检测技术中的应用说到生物素亲和素系统，很多人可能会觉得有点高深莫测，甚至想直接掉头走人。
嘿嘿，别急，别急，今天咱们就来聊聊这个看似复杂其实超有趣的玩意儿，特别是在免疫检测技术中的应用。
你想，咱们平时听到的免疫检测，通常都离不开那一堆看起来高大上的术语，什么抗体、抗原、酶标……一堆听起来就让人头大。
可是真正搞明白这些东西之后，你会发现，它们其实在生活中无处不在，搞不好明天你就能用上。
今天这篇文章，不聊深奥的生物学公式，而是跟大家说说这个“亲和力”到底有多神奇，怎么在免疫检测中发挥大作用，嗯，这个话题一定让你眼前一亮。
你有没有想过，咱们身体里那一堆“免疫小兵”是怎么识别敌人的？就是那些个看不见摸不着的细菌、病毒、癌细胞啥的。
别看这些“免疫小兵”天天忙着为咱们抵御外敌，它们工作时可是极其讲究效率的。
它们的“武器”就像是超精准的靶子，专门对着目标，打得那叫一个准。
为了让这些“武器”发挥最大作用，免疫检测技术就来了，简单说就是找找看咱们身体里有没有潜在的敌人，能不能提前发现问题。
可是，怎么才能找到这些“潜在敌人”呢？这里就有一个小秘密，那就是——生物素亲和素系统。
你可能想，哎，这俩词听起来怎么这么“硬核”？其实它们也没那么神秘，简单来说，就是一种通过“亲和力”来进行精准结合的工具。
咱们身边的很多事物都讲“缘分”，这“亲和力”其实就是缘分的一种延伸。
生物素（也就是维生素H）和亲和素（一个特异性的蛋白质）就是有种天然的“化学吸引力”，就像两只手拼命地握在一起。
你想，它们互相吸引，紧密结合，这个特性就被聪明的科学家们用到免疫检测中。
比如，当咱们想要检测某种蛋白质或者抗体时，可以利用生物素和亲和素之间的“牵手”来帮助快速找出目标。
这就像是你在玩捉迷藏，大家都躲得很好，但偏偏你和你的好朋友是最先找到藏匿的敌人的组合，大家合作得天衣无缝。
这就带我们进入了免疫检测的世界。
免疫检测技术的基本原理就像是“军队侦察”，它通过检测抗原、抗体的结合来判断是否存在某种疾病或者感染。
生物素标记试剂盒使用说明书
生物素标记试剂盒使用说明书货号: EBLK0002产品介绍：Elabscience生物素标记试剂盒提供了生物素标记所需全部试剂，用于含有氨基（NH2-）抗体的标记。
生物素已经活化，可直接使用，每个试剂盒足以完成3次标记，每次可标记0.2-2mg。
试剂盒中包括6个用于抗体标记脱盐的Filtration tube，不用透析，操作简便，熟练操作90min可完成整个标记过程。
产品特点：试剂全面:本试剂盒提供了生物素标记所需全部试剂。
快速:整个过程仅需90min。
方便:通过Filtration tube即可脱盐，无需透析或者凝胶过滤。
使用灵活:既可用于微量标记又可大量标记，每次可标记0.2-2mg。
理想的标记效果:已经优化确定了最适的标记比例，降低标记不足或由于过度标记而失活的可能性。
产品组成：标记过程需要仪器：1. 10ul，50ul，200ul，1000ul可调高精度移液器2. 恒温箱（37℃）3. 离心机（离心力可达到12,000×g）储存条件：本试剂盒未开封前在2-8℃可稳定保存一年生物素标记反应原理：NH2-Reactive Biotin专一地与伯胺反应（N-末端及赖氨酸残基侧链）形成稳定的酰胺键生物素标记NH2-Reactive Biotin使用量的计算：每个反应中生物素试剂的使用量取决于待标记蛋白质的量和浓度。
通过优化，我们确定了标记2mg/ml的抗体（IgG ，150KD），使用生物素和抗体的分子比为20:1能达到较理想的标记效果。
1、标记2mg/ml的抗体，使用生物素和抗体的分子比为20:1时，应加入生物素量的计算方法：ml蛋白×2mg蛋白ml蛋白×1mmolIgG150,000mgIgG×20mmol生物素mmol蛋白= mmol生物素2、对于10mmol的生物素溶液，应加入反应中该生物素体积的计算方法：mmol生物素×1,000,000μLL ×L10mmol= ul生物素计算示例：对于0.5ml 2mg/ml的IgG（分子量为150,000）溶液，需加入10mM的生物素溶液13.3ul。
生物素-亲和素标记技术完整讲解
直接法：
+ B-E + A
ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
直接法 间接法
（3）标记生物素-抗生物素法
标记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin， LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接 与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色 反应，间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合， 由于加入了二抗，较直接法检测灵敏度要高，对 免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB 法需以生物素标记一抗，应用不如ABC法普遍， 与ABC法相比，LAB法操作较简单，但灵敏度较 低
亲和素：
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大， 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的 结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
Elisa技术原理及应用
ELISA的原理
上海启因生物科技有限公司
➢ 定义：以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反 应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种检测未 知抗体或抗原的敏感性很高的试验技术。
➢ 反应的基础： 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记（结合在 固相载体的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，而酶标 记的抗原或抗体既保持其免疫学活性又保留酶的活 性）； 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行 定性或定量分析。
根据颜色反应的程度进行该抗原 的定性或定量
ELISA的检测类型 双抗原夹心法测抗体
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用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标 本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间 接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关 键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合 适的标记方法。
ELISA的检测类型
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ABS-ELISA法
➢ 亲和素与生物素的结合，
虽不属于免疫反应，但特
异性强，亲和力大，能够
形成一种极为稳定的复合
体。把亲和素和生物素与
ELISA偶联起来，可以大
①：固相支持物；
大提高ELISA的敏感度。
②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）；
Elisa技术原理及应用
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Elisa发展 Elisa原理 常用检测方法 应用前景
ELISA的发展
上海启因生物科技有限公司
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定 ( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的 简称。其是继免疫荧光（IFA）和放射性免 疫（RIA）分析技术之后，建立起来的用酶 来标记抗原或抗体的分析技术。自上世纪70
ELISA分类
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
一双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：⑴将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
⑵加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。
洗涤除去其他未结合的物质。
⑶加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
⑷加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
二双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。
这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。
单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。
当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。
钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
三间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。
操作步骤如下：⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。
ELISA在应用亲和素和生物素的作用
ELISA在应用亲和素和生物素的作用
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。
分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。
现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。
生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存
（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS
特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。
由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。
因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。
可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。
这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。
另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
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亲和素和生物素的ELISA试剂盒的应用
亲和素-生物素系统在ELISA试剂盒中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。
可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。
这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。
另外，在常规ELISA试剂盒中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。
应用亲和素和生物素的ELISA试剂盒,亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。
分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。
现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素。
生物素又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。
用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯(BNHS)可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素医学教育网整理化的产物。
亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。
由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。
因此把亲和素和生物素与ELISA试剂盒偶联起来，就可大大提高ELISA试剂盒的敏感度。
Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。
由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。
ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM 抗体ELISA检测。
【试剂盒规格】：48T/96T
【试剂盒方法】：酶联免疫法/酶免法(ELISA)
【性状】：液态
【试剂盒种属】马铃薯、鹿、羊、鸡、鸭、鱼、人、大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、裸鼠、兔子、猪、犬、猴、马、牛等动植物。
【试剂盒标本】血清、血浆、细胞上清液、尿液、体液、灌洗液、脑脊髓、心房水、胸房水、组织等
【用途】：科研实验
【贮存】：贮存于2℃-8℃.
ELISA试剂盒操作注意事项
1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。
稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3．不用的其它试剂应包装好或盖好。
不同批号的试剂不要混用。
保质前使用。
4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。
使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。
底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
避免用手接触，有毒。
实验完成后应立即读取OD值。
8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
本公司长期供应进口ELISA试剂盒，种属齐全,有专门检测人、小鼠、大鼠、豚鼠、猪、狗、猴、羊、牛、鸡、兔等各种样本科研试剂盒。
试剂盒提供免费代测、技术指导、全方位售后服务，欢迎来电咨询。