生物素-亲和素免疫放大技术
主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术
第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。
生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。
生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。
一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。
BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键。
从而使蛋白质标记上生物素。
（二）标记蛋白质醛基的活化生物素用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。
（四）标记核酸的活化生物素活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。
2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。
2.标记酶生物素标记辣根过氧化物酶第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。
生物素-亲合素放大技术
标记核酸的活化生物素
光生物素(photobiotin)
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后,
变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结
合, 形成B（生物素）-核酸探针
生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）
作为TTP（三磷酸胸苷）的结构类似物，可 采用缺口移位法掺入化 特 性
亲合素（A）
结构 四亚基糖蛋白 pI 10.5 结合位 色氨酸 生物素 4 K（亲和常数） 1015 活性(U) 13～15
链霉亲合素(SA)
四肽链蛋白 无糖基 6 色氨酸 4 1015 15～18
二、亲合素/链霉亲合素标记
标记物：酶、胶体金 异硫氰酸荧光素（FITC） HRP-AV(SA) 改良过碘酸钠法、戊二醛法 ABC/SABC 预制亲和素(AV)-Biotin、 链霉亲和素(SAV)-Biotin
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
四、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用
以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离 纯化 将免疫测定技术与PCR结合建立免疫PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测。
可直接标记核酸， 但对碱基配对有影 响（影响氢键的形成）
二、生物素标记蛋白质
活化生物素通过侧链与蛋白分子连接 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记偏酸性抗原； 抗原、抗体标记后活性不变 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记 后活性将降低
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第十一章 生物素-亲和素放大技术(附答案解析)
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第十一章生物素-亲和素放大技术（附答案解析）一、A1型题1、每个亲和素能结合生物素分子的数目是（）A、4B、2C、1D、3E、82、以下关于生物素-亲和素系统（BAS）的说法错误的是（）A、1个亲和素分子可结合4个生物素分子B、1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C、生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合D、亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E、亲和素和生物素.有极强的亲和力3、免疫组化技术的优点不包括（）A、高特异性B、高敏感性C、形态学的直观性D、精确定量分析E、能对抗原表达情况进行分析4、BAS在ELISA技术中应用最广泛的反应模式是（）A、ABAB、ABCC、BRABD、BAE、LAB5、免疫组化染色前，对标本进行固定的目的是（）A、保存组织细胞的抗原性B、防止细胞脱落C、防止细胞自溶D、终止胞内酶的活性E、使细胞内蛋白质凝固6、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原7、关于亲和素-生物素系统的错误描述是（）A、用于间接包被B、用于终反应放大C、用于酶免疫测定D、用于胶体金测定E、不用于荧光免疫测定8、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原9、关于生物素标记蛋白质的注意事项，下列说法错误的是（）A、根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件B、活化生物素与待标记抗原或抗体可以为任意比例C、在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构可减少空间位阻影响D、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性E、生物素标记酶时会影响其免疫活性10、亲和素和生物素结合的特点是（）A、免疫反应B、不属于免疫反应C、特异性弱D、亲和力小E、不够稳定二、B型题1、 A.ABCBC.BABD.直接法BASE.间接法BAS<1> 、标记亲和素-生物素的方法为（）；<2> 、亲和素-生物素化酶复合物技术为（）；<3> 、生物素化第二抗体为（）；<4> 、生物素化第一抗体为（）。
生物素-亲和素免疫放大技术
第十一章生物素 -亲和素免疫放大技术一、生物素 - 亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。
二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素N- 羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）2. 标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素3- （ N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和 BHZ。
（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
标记方法：（ 1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用 BHZ。
（ 2）标记酶：以生物素标记HRP为例。
标记注意事项：（ 1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。
三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团 - 色氨酸。
2.链霉亲和素及其活性：活性基团- 色氨酸。
3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC 和胶体金。
亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1） HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素 - 生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素 - 生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。
四、生物素 - 亲和素系统的应用1.生物素 - 亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素 - 生物素化酶复合物技术（ ABC）。
生物素-亲合素放大技术
• 在生物素—亲合素（链霉亲合素）放大系统应 用中，无论采用酶、荧光素或发光物作为检测 示踪剂，均是待测抗原与生物素化抗体反应形 成复合物后，再利用生物素与亲合素间的多价 放大结合特性，或直接与标有示踪剂的生物素 结合（ BA 、 LAB 法），或依次与亲合素（链霉 亲合素）、生物素示踪标记物反应连接成聚合 物（BAB、ABC法），最终使待测反应信号被放 大，提高检测方法的灵敏度。
三、生物素-亲合素系统在荧光免 疫技术中的应用
BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA法， 即用荧光素直接标记亲合素（或链酶亲 合素）；也可采用游离亲合素（或链酶 亲合素）搭桥，两端分别连接生物素化 抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或 荧光标记的抗亲合素（或链酶亲合素） 抗体的夹心法。
四、生物素-亲合素系统在放射免 疫测定中的应用
第十一章 生物素-亲合 素放大技术
第一节 生物素的理化性质与标记 一、活化生物素 二、活化生物素标记蛋白质
第二节 亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记 一、理化特性 二、亲合素（或链酶亲合素）的标记
第三节 生物素-亲合素系统的特点 一、灵敏度 二、特异性 三、稳定性 四、适用性 五、其他 第四节 生物素-亲合素系统的应用 一、生物素-亲合素系统基本类型及原理 二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用 三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用 四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用 五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用 思考题 小结
却了加B-E的步骤
3.
ABC法
⑴ ⑵ A+B· E Ag+B· Ab A- B· E----ABC Ag-Ab· B
ABC
Ag-Ab· B-ABC
特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物 ABC
(完整word版)初级检验技师临床免疫学和免疫检验(2017年讲义)第十一章生物素-亲和素放大技术
第十一章生物素-亲和素放大技术生物素、亲和素是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。
生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。
第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。
一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素（二）标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。
（四）标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
1.光敏生物素：用于DNA或RNA的标记。
2.生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。
用缺口移位法掺入到双链DNA中。
3.BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。
通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。
2.标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）。
（三）标记注意事项1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。
2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。
生物素-亲和素系统相关技术3
3、BAS在放射免疫技术中的应用
4、
BAS在分子生物学中的应用
免疫-PCR
免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来 的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化 底物显色。
PCR具有很强的放大能力，其可以定量 地检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和 特异性，因此，将与抗原结合的特异抗体通 过连接分子与DNA结合，再经PCR扩增，由 此定量检测抗原使敏感性高于ELISA和RIA。
PCR技术具有高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
二、免疫PCR的发展
免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，应用的
还不多；
实验表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，
且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几 百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检 测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适 用于检测一些含量特别少的抗原分子。
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯
（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。
2.标记蛋白质醛基：酰肼（BHZ）和肼化生
物胞素（BCHZ）。
3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）
-生物胞素（MPB）。
4.标记核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三
磷酸、BNHS和BHZ。
1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯
降低ALP的活性。
活化生物素可与不同的大分子物质结合，应
根据可标记基团的种类及特性，选择相应的
活化生物素；
抗体：BNHS
偏酸性抗原：BHZ
核酸：光生物素
一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，即
生物素化大分子具有多价性，它是BAS多级 放大作用的物质基础。
生物素—亲和素免疫放大技术目的要求和教学内容
第十一章生物素—亲和素免疫放大技术第一部分目的要求和教学内容一、目的要求掌握：生物素—亲和素免疫放大技术、生物素、亲和素的概念，生物素—亲和素免疫放大技术的主要类型，原理和临床应用；熟悉：生物素—亲和素免疫放大技术的类型、原理及临床应用；了解：生物素及亲和素特性及其结合抗体的制备方法，各检测技术方法的技术要点。
二、教学内容1．胶体金与免疫金制备：生物素及亲和素特性及其制备，生物素的制备。
2．生物素—亲和素免疫放大技术的类型、原理。
3．生物素—亲和素免疫放大技术临床应用与评价。
第二部分测试题一、选择题(一)单项选择题(A型题)1.既能用于标记蛋白质氨基,又能标记蛋白质醛基的活化生物素是A.BNHSB.BCHZC.BHZD.MPBE.BCNHS2.间接法BA的反应模式为A.Ag-(Ab-B)-A*B.Ag-Ab1-(Ab2-B)-A*C.Ag-(Ab-B)-A-B*D.Ag-(Ab-B)-AB*CE.Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-B*3 下列哪一项属于长臂活化生物素A.BNHSB.BHZC.BCNHSD.BCHZE.MPB4.MPB是氯化生物胞素与3-(N-马来酰亚胺-丙酰)-N-BNHS在什么溶液中反应后制得的A.二甲基甲酰胺B.碳二亚胺C.N-羟基丁二酰亚胺D.马来酰亚胺E.水合肼5.每个亲和素能结合多少个分子的生物素A.1B.2C.3D.4E.56.生物素通过噻吩环戊酸侧链上的什么部位与多种大分子偶联A.羰基B.-NHC.羧基D.-CH3E.-NH27.常用于标记抗体的活化生物素是A.BNHSB.BHZC.BCNHSD.BCHZE.MPB8.在生物素标记抗体时,生物素:IgG 的比例(mg/mg)为多少时,效果较好A.1:1B.3:1C.4:1D.2:1E.5:19.在用生物素标记酶时,酶活性会降低的是A.HRPB.葡萄糖氧化酶C.β-GalD.APE.LDH10.亲和素-生物素化碱性磷酸酶(ABAP)复合物的制备是将亲和素溶液与生物素化AP按多少浓度比反应后制得A.1:1B.2:1C.3:1D.4:1E.5:111.标记蛋白质氨基的活化生物素是A.BHZB.MPBC.光生物素D.生物素脱氧核苷三磷酸E.BNHS12.标记蛋白质巯基的活化生物素是A.MPBB.BNHSC.BHZD.光生物素E.生物素脱氧核苷三磷酸13.制备ABC复合物时,亲和素的浓度不能高于A.10ug/mlB.20ug/mlC.30ug/mlD.35ug/mlE.40ug/ml14.标记核酸的活化生物素,下列哪项除外A.MPBB.光生物素C.生物素脱氧核苷三磷酸D.BNHSE.BHZ15.用活化生物素标记核酸的方法,下列哪项除外A.缺口移位法B.光化学法C.化学偶联法D.放射免疫法E.末端标记法16.下列说法不正确的是A.标记反应时,活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当比例B.一般每个抗原或抗体分子标记1-3或3-5个生物素分子较为适宜C.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后,不影响后者的免疫活性D.生物素与酶结合后,酶活性不受影响E.为减少空间位阻影响,常在生物素与被标记物间加入交联臂样结构17.下列哪种方法不能用于制备生物素标记的核酸探针A.缺口移位法B.化学偶联法C.光化学法D.末端标记法E.电化学法二、填空题1.不受位阻效应影响,更易发挥生物素活性作用的是（）。
第11章生物素-亲合素放大技术
长臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添 加了两个6-氨基已糖分子基团，形 成连结臂，生物素与大分子基团的 距离
BNHS分子可与蛋白质 赖氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质
标记蛋白质醛基的活化生物素
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接
亲合素（A）
结构 PI 结合位 生物素 Ka 活性 四亚基糖蛋白 10.5 色氨酸 4 1015 13～15
链霉亲合素(SA)
四肽链蛋白 无糖基 6 色氨酸 4 1015 15～18
二、亲合素/链霉亲合素标记
标记物：小分子示踪物125I、胶体金、荧光素、 化学发光物 大分子物质如酶抗原、抗体 亲和素的标记： HRP的标记 改良过碘酸钠法 戊二醛法
Anti-HAV IgM
μ-Capture test principle.Total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:Pretreatment of 10 μL of the automatically 1:400 diluted sample(using Elecsys Diluent Universal )with anti-Fdy reagent to block specific in the presence of the monoclonal anti-HAV antibodies labeled with ruthenium complex.
HBsAgII
Sandwich principle.Total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:50 μL of sample,two biotinylated monoclonal anti-HBsAg antibodies, and a mixture of monoclonal anti-HBsAg antibody and polyclonal anti-HBsAg antibodies labeled with a ruthenium complex form a sandwich complex. 2nd:incubation:After addition of streptavidincoated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.
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Dr. Wang Hui,
第四节 生物素 -亲和素系统的应用
生物素与亲和素间的结合亲和力高、特 异性强 , 且各自均可以与各型大小分子 偶联, 以及二者在结合反应时具有的多 级放大作用等优越性
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一、生物素-亲和素系统基本类型及原理
BAS 在应用中的基本类型有二种 : 一类以游离 亲和素为中间物 , 分别连接包含生物素化大分 子的待检反应体系和标记生物素 , 称为 BAB 法 (biotin-avidin bind,BAB); 后来又在此基础上 发展了亲和素 -生物素化酶复合物技术 (avidinbiotin-peroxidase complex,ABC). 另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分 子反应体系进行检测的 BA 法, 或称标记亲和 素·生物素法 (labeled avidin-biotin,LAB)。
早在1916年Bateman第一個發現雞蛋蛋白 中有一種有毒物質，直到1927年Boas才發 現某種食物可以預防蛋白的毒性。之後 的研究，即將此種可抗蛋白毒性的物質--生物素分離出來。生物素的結構於1936 年被發明而出，也在1943年即能在實驗 室中合成此種物質。
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（三） 标记蛋白质巯基的活化生物素
3 － (N －马来酰亚胺－丙酰 )- 生物胞 素 [3-(N-maleimido-propiny)biocytin,MPB] 是能特异地与蛋白质巯基 结合的活化生物素试剂
三、亲和素(或链霉亲和素)的标记
几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素 (AV) 或链霉亲合素 (SA) 结合。 最常用的是酶、异硫氨酸荧光素 (FITC) 和胶 体金。 亲和素或链霉亲和素均为大分子蛋白 , 其与酶 的标记结合物的制备除可用普通酶标记蛋白 质 分子的直接标记法外 , 由于其特有的与生物素 结合的性能 , 还可以通过与生物素化酶复合物 中的生物素结合 , 间接地与酶形成结合物。
第十一章 生物素－亲和素免疫放大技术
﹡重点：
生物素的理化性质与标记 生物素-亲和素系统基本类型及原理 生物素-亲和素系统在ELISA中的应用
﹡难点：
生物素-亲和素系统基本类型及原理
Dr. Wang Hui,
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Dr. Wang Hui, Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College
BAS可用于微量抗原、抗体及受体的定量、 定性检测及定位观察研究，也可制成亲 和介质用于上述各类物质的纯化。 BAS的特点：灵敏度高、特异性强、稳定 性好、适用于多种反应体系。
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(三) 标记注意事项
应根据抗原或抗体分子结构中所带可标 记基团的种类 ( 氨基、醛基或巯基 ) 以 及分子的理化性质 (酸性、中性或碱性), 选择相应的活化生物素和反应条件。 标记反应时, 活化生物素与待标记抗原 或抗体应有适当的比例, 使每个蛋白质 分子上标记的生物素分子数量控制在一 定范围, 以免影响标记物的活性。
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二、链霉亲和素及其活性
链霉亲和素 (streptavidin,SA) 是由链霉 菌分泌的一种蛋白质。链霉亲和素分子由 4 条相同的肽链组成, 其氨基酸组成中, 甘氨酸和丙氨酸的含量较大, 而且结合生 物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基； 链霉亲和素是一种稍偏酸性的蛋白质, 并 且不带任何糖基 。
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第三节 亲和素、链霉亲和素的理化性 质与标记
一、亲和素及其活性 亲和素富含的色氨酸与其活性密切相关 , 是亲和素与生物素咪瞠环酬结合的基团。
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亲和素（Avidin)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素 结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素。
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BAB 法:也称为桥联亲和素-标记生物素法 (bridged avidin-biotin technique,BRAB), 是以游 离的亲和素(或链霉亲和素)作为桥联剂, 利用亲和素的多价性, 将检测反应体系中 抗原-生物素化抗体复合物与标记生物素 (如酶标生物素)联结起来, 达到检测反应 分子的目的。
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Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang肽链都能结合一个 生物素, 因此与亲和素一样, 一个链霉亲 和素分子也能结合 4 个生物素分子 。
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( 二 ) 标记方法
1.标记抗体、抗原 抗体是常用的生物活性大分子 物质。由于一个抗体分子可连接多个生物素分子 , 因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个 亲和素分子结合 常用于标记抗体的活化生物素是 BNHS，但对于分 子偏酸性的抗原 , 标记时多采用 BHZ。 2. 标记酶 可标记 HRP 、 β 半乳糖昔酶 ( β-Gal) 和碱性磷酸酶 (AP)。
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几种常用于标记不同类型生物大分子的活 化生物素的制备及特性。
标记蛋白质氨基的活化生物素
此种活化生物素的制备方法是将生物素与 N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行 缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺酯 （BNHS) BNHS分子酯键中的 -C=O 基团可与蛋白质 分子中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使蛋 白质标记上生物素
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生物素的分子量较小，当与抗体或酶反应形 成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的 空间位阻效应(steric hindrance),可对生 物素与亲和素间的结合以及BAS的应用效果 造成干扰。
概述：
70年代后期在免疫酶技术中利用生物素亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)标 记抗体发展了又一种新型生物反应放大 技术。
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( 二 ) 标记蛋白质醛基的活化生物素
用于此类标记的活化生物素有两种 : 生物素酰肼 (biotin hydrazine,BHZ)主要用于偏 酸性糖蛋白的生物素标记 肼化生物胞素 (biocytin hydrazine,BCHZ) 除可 与蛋白质的醛基结合外，它还与 N-羟基丁二酰亚 胺酯（BNHS）相同，能与蛋白质的氨基结合，因 此其适用范围较BHZ宽。
Dr. Wang Hui,
Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College
长臂活化生物素 (BCNHS) 是在生物素和 N- 羟基丁二酰亚胺之间添加了两个 6氨基己糖分子基团，形成连结臂， 使其 与抗体、酶等生物大分子结合后，不受 位阻效应的影响, 更易发挥生物素的活 性作用。
第一节 生物素－亲和素系统的特点
生物素（Biotin)有两个 环状结构，I环为与亲和 素结合的主要部位；II 环为结合抗体和其它生 物大分子的部位。
Dr. Wang Hui,
Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College