生物素-亲和素免疫放大技术

Dr. Wang Hui,
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( 二 ) 标记方法



1.标记抗体、抗原 抗体是常用的生物活性大分子 物质。由于一个抗体分子可连接多个生物素分子 , 因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个 亲和素分子结合 常用于标记抗体的活化生物素是 BNHS，但对于分 子偏酸性的抗原 , 标记时多采用 BHZ。 2. 标记酶 可标记 HRP 、 β 半乳糖昔酶 ( β-Gal) 和碱性磷酸酶 (AP)。
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( 二 ) 标记蛋白质醛基的活化生物素
用于此类标记的活化生物素有两种 : 生物素酰肼 (biotin hydrazine,BHZ)主要用于偏 酸性糖蛋白的生物素标记 肼化生物胞素 (biocytin hydrazine,BCHZ) 除可 与蛋白质的醛基结合外，它还与 N-羟基丁二酰亚 胺酯（BNHS）相同，能与蛋白质的氨基结合，因 此其适用范围较BHZ宽。
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生物素的分子量较小，当与抗体或酶反应形 成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的 空间位阻效应(steric hindrance),可对生 物素与亲和素间的结合以及BAS的应用效果 造成干扰。
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二、生物素标记蛋白质
（一）生物素化蛋白质衍生物的特性 一个蛋白质分子可联结多个生物素分子 , 从而使 其具较高的比活性 , 在与亲和素的反应中成为多 价。生物素化大分子的多价性 , 是 BAS 多级放大 作用的物质基础。 生物素化蛋白质衍生物有二类 , 一种是生物素化 的大分子生物活性物质 ( 如抗原、抗体 ),另一种 是标记材料( 如酶 )结合生物素后制成的标记物。
三、亲和素(或链霉亲和素)的标记



几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素 (AV) 或链霉亲合素 (SA) 结合。 最常用的是酶、异硫氨酸荧光素 (FITC) 和胶 体金。 亲和素或链霉亲和素均为大分子蛋白 , 其与酶 的标记结合物的制备除可用普通酶标记蛋白 质 分子的直接标记法外 , 由于其特有的与生物素 结合的性能 , 还可以通过与生物素化酶复合物 中的生物素结合 , 间接地与酶形成结合物。
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为减少生物素标记蛋白质后, 大分子物质造成 的空间位阻影响 , 有利于生物素与亲和素的结 合, 可在生物素与被标记物间加入交联臂样结 构。 生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后, 不影响 后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同, 对 HRP、葡萄糖氧化酶和β半乳糖苷酶, 酶活性 不受偶联生物素的干扰, 但某些酶(如碱性磷 酸酶)在标记生物素后, 其活性会有一定程度 降低。
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第二节 生物素的理化性质与标记
一、生物素及其活化 生物素经活化后 , 可容易地与各种抗原、 抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形 成生物素化标记物。
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BAB 法:也称为桥联亲和素-标记生物素法 (bridged avidin-biotin technique,BRAB), 是以游 离的亲和素(或链霉亲和素)作为桥联剂, 利用亲和素的多价性, 将检测反应体系中 抗原-生物素化抗体复合物与标记生物素 (如酶标生物素)联结起来, 达到检测反应 分子的目的。
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（三） 标记蛋白质巯基的活化生物素

3 － (N －马来酰亚胺－丙酰 )- 生物胞 素 [3-(N-maleimido-propiny)biocytin,MPB] 是能特异地与蛋白质巯基 结合的活化生物素试剂
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（四）标记核酸的活化生物素




活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化 学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过 酰胺键与核酸分子相连, 构成生物素标记的核酸探 针。 光生物素(photobiotin) 它是一种化学合成的生物 素衍生物 生物素脱氧核苷三磷酸 先将生物素与某种脱氧核 苷酸连接成活化生物素 BNHS和BHZ二者均可以在一定条件下与核酸胞嘧啶 分子中的 N4 氨基交联, 使核酸分子生物素化。
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BAS可用于微量抗原、抗体及受体的定量、 定性检测及定位观察研究，也可制成亲 和介质用于上述各类物质的纯化。 BAS的特点：灵敏度高、特异性强、稳定 性好、适用于多种反应体系。
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(三) 标记注意事项


应根据抗原或抗体分子结构中所带可标 记基团的种类 ( 氨基、醛基或巯基 ) 以 及分子的理化性质 (酸性、中性或碱性), 选择相应的活化生物素和反应条件。 标记反应时, 活化生物素与待标记抗原 或抗体应有适当的比例, 使每个蛋白质 分子上标记的生物素分子数量控制在一 定范围, 以免影响标记物的活性。
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链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个 生物素, 因此与亲和素一样, 一个链霉亲 和素分子也能结合 4 个生物素分子 。
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几种常用于标记不同类型生物大分子的活 化生物素的制备及特性。

标记蛋白质氨基的活化生物素
此种活化生物素的制备方法是将生物素与 N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行 缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺酯 （BNHS) BNHS分子酯键中的 -C=O 基团可与蛋白质 分子中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使蛋 白质标记上生物素
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第十一章 生物素－亲和素免疫放大技术
﹡重点：
生物素的理化性质与标记 生物素-亲和素系统基本类型及原理 生物素-亲和素系统在ELISA中的应用
﹡难点：
生物素-亲和素系统基本类型及原理
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一、生物素-亲和素系统基本类型及原理


BAS 在应用中的基本类型有二种 : 一类以游离 亲和素为中间物 , 分别连接包含生物素化大分 子的待检反应体系和标记生物素 , 称为 BAB 法 (biotin-avidin bind,BAB); 后来又在此基础上 发展了亲和素 -生物素化酶复合物技术 (avidinbiotin-peroxidase complex,ABC). 另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分 子反应体系进行检测的 BA 法, 或称标记亲和 素·生物素法 (labeled avidin-biotin,LAB)。
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二、链霉亲和素及其活性

链霉亲和素 (streptavidin,SA) 是由链霉 菌分泌的一种蛋白质。链霉亲和素分子由 4 条相同的肽链组成, 其氨基酸组成中, 甘氨酸和丙氨酸的含量较大, 而且结合生 物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基； 链霉亲和素是一种稍偏酸性的蛋白质, 并 且不带任何糖基 。
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第三节 亲和素、链霉亲和素的理化性 质与标记
一、亲和素及其活性 亲和素富含的色氨酸与其活性密切相关 , 是亲和素与生物素咪瞠环酬结合的基团。
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第四节 生物素 -亲和素系统的应用

生物素与亲和素间的结合亲和力高、特 异性强 , 且各自均可以与各型大小分子 偶联, 以及二者在结合反应时具有的多 级放大作用等优越性
早在1916年Bateman第一個發現雞蛋蛋白 中有一種有毒物質，直到1927年Boas才發 現某種食物可以預防蛋白的毒性。之後 的研究，即將此種可抗蛋白毒性的物質--生物素分離出來。生物素的結構於1936 年被發明而出，也在1943年即能在實驗 室中合成此種物質。
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长臂活化生物素 (BCNHS) 是在生物素和 N- 羟基丁二酰亚胺之间添加了两个 6氨基己糖分子基团，形成连结臂， 使其 与抗体、酶等生物大分子结合后，不受 位阻效应的影响, 更易发挥生物素的活 性作用。
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亲和素（Avidin)耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，与生物素 结合后稳定性更好。每个亲和素能结合四个分子的生物素。
第一节 生物素－亲和素系统的特点
生物素（Biotin)有两个 环状结构，I环为与亲和 素结合的主要部位；II 环为结合抗体和其它生 物大分子的部位。
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概述：

70年代后期在免疫酶技术中利用生物素亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)标 记抗体发展了又一种新型生物反应放大 技术。
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