第11章 生物素-亲合素放大技术

Ag-Ab1-Ab2-B-A-E
+A-E
BAS实验方法及反应层次
方法
直接法 BA
反应层次
Ag-(Ab-B)-A*
BAB
ABC 间接法 BA BAB
Ag- (Ab-B)-A-B*
Ag- (Ab-B)-AB*C Ag-Ab1-(Ab2-B)-A* Ag-Ab1- (Ab2-B)-A-B*
ABC
Ag- Ab1- (Ab2-B)-AB*C
The reaction mixture is aspirated into the measuring cell where the microparticles are magnetically captured onto the surface of the electrode.Unbound substances are then removed with ProCell.Application of a voltage to the electrode then induces chemiluminescent emission which is measured by a photomultiplier. Results are determined automatically by the Elecsys software by comparing the electrochemiluminescence signal obtained from the sample with the cutoff value obtained by anti-HCV calibration.
HBsAgII
Sandwich principle.Total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:50 μL of sample,two biotinylated monoclonal anti-HBsAg antibodies, and a mixture of monoclonal anti-HBsAg antibody and polyclonal anti-HBsAg antibodies labeled with a ruthenium complex form a sandwich complex. 2nd:incubation:After addition of streptavidincoated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.
特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物 ABC
+ B-E + A ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
BA法 Ag+B· Ab Ag-Ab· B
A· E
Ag-Ab· E B-A·
特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省
却了加B-E的步骤
Ag-Ab1-Ab2-B + A-E
标记核酸的活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
O C NH CH NH CH NH2 C CH2 CH2 C O (CH2)4COOH O O EDC C O N C O CH2 O C CH2
CH2
S
CH
NH
OH 碳二亚 胺
生物素
N-羟基丁二酰胺
生物素羟基 琥珀酰亚胺 酯（BNHS ）
活化生物素
抗原、抗体标记后活性不变；
可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后 活性将降低；
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团
的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性； 控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；
使用交联臂减少空间阻力
第二节 亲合素、链霉亲合素的理 化性质与标记
亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素
(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合
物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所
有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链
酶亲合素（SA）结合。
一、理 化 特 性
四、生物素-亲合素系统在放射免 疫测定中的应用
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
五、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用
以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离 纯化 将免疫测定技术与PCR结合建立免疫PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测
后，再与无水肼反应而成。
除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB) 能特异地与蛋白质巯基结合的活化 生物素
标记核酸的活化生物素
光敏生物素(photobiotin)
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香 基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B-核酸探针
二、生物素-亲合素系统在酶免疫 测定中的应用
BAS在ELISA中的应用 生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定
固相化抗原或抗体
A
电化学发光免疫测定示意图
用于终反应的放大
三、生物素-亲合素系统在荧光免 疫技术中的应用
BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA法，即用 荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）； 也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥， 两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的 生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲合素（或 链酶亲合素）抗体的夹心法。
2.亲和素－生物素化HRP复合物的制备
B-E
+
A
ABC
链霉亲和素的标记 方法：过碘酸钠法 HHale Waihona Puke P+NaIO4+SA
透析+KBH4
沉淀
过碘酸盐氧化法
NaIO4
O O O O O O
酶-五炭糖环
+ NH2SAvidin
KBH4
O
O
O OH N Avdin
O N
H2O
O
N OH
O OH
O
SAvidin SAvidin
一、生物素-亲合素系统基本类型 及原理
BAB法：
Ag+B· Ab
Ag-Ab· B
A
Ag-Ab· B-A
B· E
Ag-Ab· B-A-B· E
特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
+A
+A
ABC法
⑴ ⑵ A+B· E Ag+B· Ab A- B· E----ABC Ag-Ab· B
ABC
Ag-Ab· B-ABC
Anti-HCV
Sandwich principle.Total duration:18minutes. 1st incubation:40μL of sample,60 μ L of reagent containing biotinylated HCV antigens and 60 μ L of a reagent containing HCV antigens labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich complex. 2nd incubation:After addition of strepetavidin-coated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biontin and streptavidin.
Anti-HAV IgM
μ-Capture test principle.Total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:Pretreatment of 10 μL of the automatically 1:400 diluted sample(using Elecsys Diluent Universal )with anti-Fdy reagent to block specific in the presence of the monoclonal anti-HAV antibodies labeled with ruthenium complex.
Anti-HBe
Competition principle. 1st:incubation:Anti-HBe in the sample (35 μL) binds to the added HBeAg. 2nd incubation:After addition of biotinylated antibodies and ruthenium complex-labeled antibodies specific for HBeAg,together with streptavdin-coated microparticles,the still-free binding sites on the HBe-antigens become occupied.The entire complex is then bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavdin.
I 咪唑酮环
羧基
Ⅱ
噻吩环
一、活化生物素
生物素侧链的末