第11章 生物素-亲合素放大技术

使用交联臂减少空间阻力
第二节 亲合素、链霉亲合素的理 化性质与标记
亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素
(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合
物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所
有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链
酶亲合素（SA）结合。
一、理 化 特 性
Anti-HCV
Sandwich principle.Total duration:18minutes. 1st incubation:40μL of sample,60 μ L of reagent containing biotinylated HCV antigens and 60 μ L of a reagent containing HCV antigens labeled with a ruthenium complex react to form a sandwich complex. 2nd incubation:After addition of strepetavidin-coated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biontin and streptavidin.
Anti-HBe
Competition principle. 1st:incubation:Anti-HBe in the sample (35 μL) binds to the added HBeAg. 2nd incubation:After addition of biotinylated antibodies and ruthenium complex-labeled antibodies specific for HBeAg,together with streptavdin-coated microparticles,the still-free binding sites on the HBe-antigens become occupied.The entire complex is then bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavdin.
Anti-HAV IgM
μ-Capture test principle.Total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:Pretreatment of 10 μL of the automatically 1:400 diluted sample(using Elecsys Diluent Universal )with anti-Fdy reagent to block specific in the presence of the monoclonal anti-HAV antibodies labeled with ruthenium complex.
O NH NH N3 NH NO2 (CH2)3 N CH3 (CH2)3 NH C (CH2)4 S
生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）
作为TTP的结构类似物，可采用缺口移 位法掺入到双链DNA中。
BNHS和BHZ 可直接标记核酸， 但对碱基配对有影 响。
二、生物素标记蛋白质
活化生物素通过侧链与蛋白分子连接； 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性； 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记微酸性抗原；
The reaction mixture is aspirated into the measuring cell where the microparticles are magnetically captured onto the surface of the electrode.Unbound substances are then removed with ProCell.Application of a voltage to the electrode then induces chemiluminescent emission which is measured by a photomultiplier. Results are determined automatically by the Elecsys software by comparing the electrochemiluminescence signal obtained from the sample with the cutoff value obtained by anti-HCV calibration.
亲合素（A）
结构 PI 结合位 生物素 Ka 活性 四亚基糖蛋白 10.5 色氨酸 4 1015 13～15
链霉亲合素(SA)
四肽链蛋白 无糖基 6 色氨酸 4 1015 15～18
二、亲合素/链霉亲合素标记
标记物：小分子示踪物125I、胶体金、荧光素、 化学发光物 大分子物质如酶抗原、抗体 亲和素的标记： HRP的标记 改良过碘酸钠法 戊二醛法
二、生物素-亲合素系统在酶免疫 测定中的应用
BAS在ELISA中的应用 生物素-亲合素系统在均相酶免疫测定
固相化抗原或抗体
A
电化学发光免疫测定示意图
用于终反应的放大
三、生物素-亲合素系统在荧光免 疫技术中的应用
BAS用于荧光抗体技术，通常采用BA法，即用 荧光素直接标记亲合素（或链酶亲合素）； 也可采用游离亲合素（或链酶亲合素）搭桥， 两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的 生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲合素（或 链酶亲合素）抗体的夹心法。
2.亲和素－生物素化HRP复合物的制备
B-E
+
A
ABC
链霉亲和素的标记 方法：过碘酸钠法 HRP+NaIO4+SA
透析+KBH4
沉淀
过碘酸盐氧化法
NaIO4
O O O O O O
酶-五炭糖环
+ NH2SAvidin
KBH4
O
O
O OH N Avdin
O N
H2O
O
N OH
O OH
O
SAvidin SAvidin
抗原、抗体标记后活性不变；
可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后 活性将降低；
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团
的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性； 控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；
特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物 ABC
+ B-E + A ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
BA法 Ag+B· Ab Ag-Ab· B
A· E
Ag-Ab· E B-A·
特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省
却了加B-E的步骤
Ag-Ab1-Ab2-B + A-E
标记核酸的活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
O C NH CH NH CH NH2 C CH2 CH2 C O (CH2)4COOH O O EDC C O N C O CH2 O C CH2
CH2
S
CH
NH
OH 碳二亚 胺
生物素
N-羟基丁二酰胺
生物素羟基 琥珀酰亚胺 酯（BNHS ）
活化生物素
后，再与无水肼反应而成。
除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB) 能特异地与蛋白质巯基结合的活化 生物素
标记核酸的活化生物素
光敏生物素(photobiotin)
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香 基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合, 形成B-核酸探针
一、生物素-亲合素系统基本类型 及原理
BAB法：
Ag+B· Ab
Ag-Ab· B
A
Ag-Ab· B-A
B· E
Ag-Ab· B-A-B· E
特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
+A
+A
ABC法
⑴ ⑵ A+B· E Ag+B· Ab A- B· E----ABC Ag-Ab· B
ABC
Ag-Ab· B-ABC
I 咪唑酮环
羧基
Ⅱ
噻吩环
一、活化生物素
生物素侧链的末
端羧基经化学修 饰后制成带各种
活性基团的衍生
物－活化生物素 (生物素化衍生物)
生物素活化
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记蛋白质醛基的活化生物素
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质巯基的活化生物素
Ag-Ab1-Ab2-B-A-E
+A-E
BAS实验方法及反应层次
方法
直接法 BA
反应层次
Ag-(Ab-B)-A*
BAB
ABC 间接法 BA BAB
Ag- (Ab-B)-A-B*
Ag- (Ab-B)-AB*C Ag-Ab1-(Ab2-B)-A* Ag-Ab1- (Ab2-B)-A-B*
பைடு நூலகம்ABC
Ag- Ab1- (Ab2-B)-AB*C
四、生物素-亲合素系统在放射免 疫测定中的应用
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
五、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用
以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离 纯化 将免疫测定技术与PCR结合建立免疫PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测
第十一章 生物素-亲合 素放大技术
第一节
生物素理化性质与标记
I环为咪唑酮环，可与亲合 素结合 Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸 侧链的未端羧基是结合生 物大分子的唯一结构
生物素（biotin,B）是一 种小分子生长因子,又称维生 素H或辅酶R 动、植物组织中广泛分布, 卵黄和肝含量高 MW 244.31kD.
HBsAgII
Sandwich principle.Total duration of assay:18 minutes. 1st incubation:50 μL of sample,two biotinylated monoclonal anti-HBsAg antibodies, and a mixture of monoclonal anti-HBsAg antibody and polyclonal anti-HBsAg antibodies labeled with a ruthenium complex form a sandwich complex. 2nd:incubation:After addition of streptavidincoated microparticles,the complex becomes bound to the solid phase via interaction of biotin and streptavidin.
过碘酸盐氧化法
NaIO4
O O O O O O
酶-五炭糖环
+ NH2Avidin
NaBH4
O
O
O OH N Avdin
O N
H2O
O
N OH
O OH Avidin
O
Avidin
Schiff碱
戊二醛法
O H
C
酶－NH2 亲和素－NH2 ＋ (CH2)3 C O H
酶
N
CH (CH2)3
亲和素
N
CH
Schiff碱
第三节 生物素-亲合素系统的特点
一、灵敏度高 二、特异性强 三、稳定性好 四、适用性广 五、其他
第四节 生物素-亲合素系统的应用
生物素与亲合素之间结合的亲合 力高、特异性强，各自均可以与各型 大小分子结合，以及二者在结合反应 时具有的多级放大作用等优越性，使 BAS及其相关技术被广泛应用在各种标 记免疫分析技术领域中，尤其为标记 免疫检测自动化分析做出了极大的贡 献。
如何减小空间位阻？
长臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添 加了两个6-氨基已糖分子基团，形 成连结臂，生物素与大分子基团的 距离
BNHS分子可与蛋白质 赖氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质
标记蛋白质醛基的活化生物素
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接