生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用
生物素标记抗体的原理应用
生物素标记抗体的原理应用引言生物素标记抗体是一种常用于生物学实验和生物化学研究的工具。
它可以通过结合生物素和抗体来标记目标蛋白，从而实现对目标蛋白的检测和定位。
本文将介绍生物素标记抗体的原理和常见的应用。
生物素标记抗体的原理生物素标记抗体是通过将生物素分子与抗体共价结合来实现标记的。
生物素是一种天然存在于生物体中的小分子，其与生物素受体（如亲和素或亲和力很强的亲和素结合蛋白）之间具有高度的亲和力。
生物素标记抗体的原理基于生物素与生物素受体之间的高亲和力，通过标记抗体即可实现对目标蛋白的检测和定位。
生物素标记抗体的应用生物素标记抗体在生物学实验和生物化学研究中有着广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用：1.免疫组化生物素标记抗体可以用于免疫组化实验中的抗原检测和定位。
通过将生物素标记的抗体与目标抗原结合，再将其与亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）复合物结合，可以实现对抗原的检测和可视化。
2.流式细胞术生物素标记抗体可以在流式细胞术中用于细胞表面标记。
通过将生物素标记的抗体与目标细胞结合，再与荧光素-生物素-蛋白（如荧光素结合蛋白）复合物结合，可以实现对目标细胞的检测和定位。
3.免疫沉淀生物素标记抗体在免疫沉淀实验中广泛应用。
通过将生物素标记的抗体与目标蛋白结合，再与琼脂糖颗粒（如琼脂糖颗粒A/G）结合，可以实现对目标蛋白的沉淀和富集。
4.西方印迹生物素标记抗体在西方印迹实验中也起着重要的作用。
通过将生物素标记的抗体与目标蛋白结合，再与亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）复合物结合，可以实现对目标蛋白的检测和定量。
结论生物素标记抗体是一种常用的生物学实验和生物化学研究工具，其原理基于生物素与生物素受体之间的高亲和力。
通过将生物素标记抗体与目标蛋白结合，可以实现对目标蛋白的检测和定位。
生物素标记抗体在免疫组化、流式细胞术、免疫沉淀和西方印迹等实验中有着广泛的应用。
在将来的研究中，生物素标记抗体将继续发挥重要的作用，并为研究人员提供更多的实验选择和研究手段。
emsa实验原理及应用
emsa实验原理及应用EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay），即电泳迁移位移实验，是一种常用的分析蛋白质与核酸相互作用的方法。
该实验基于核酸与蛋白质结合后在凝胶电泳中的迁移速度变慢的原理，通过观察核酸与蛋白质结合复合物的迁移差异，来研究它们之间的相互作用。
EMSA实验的原理是基于核酸与蛋白质相互作用后的电泳迁移差异。
在实验中，首先需要获得核酸分子（通常是DNA或RNA）和蛋白质样品。
然后，将核酸与蛋白质按照一定的比例混合，并进行反应使其结合。
接下来，将反应体系进行凝胶电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在凝胶电泳过程中，核酸与蛋白质复合物的迁移速度会变慢，而未结合的核酸则会较快地迁移。
这是因为核酸与蛋白质结合后形成的复合物比未结合状态下的核酸分子大，电荷密度也增加，从而导致复合物的迁移速度较慢。
通过观察电泳过程中形成的带状图案，可以确定核酸与蛋白质是否发生了结合。
EMSA实验在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用来研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用。
这对于理解基因表达、调控机制以及疾病的发生发展具有重要意义。
其次，EMSA实验可以用来鉴定蛋白质的结合位点。
通过对不同长度或突变的核酸序列进行EMSA实验，可以确定蛋白质与核酸的结合位点，进一步研究其功能。
此外，EMSA实验还可以用于筛选与特定蛋白质结合的核酸序列，从而寻找潜在的药物靶点。
尽管EMSA实验在研究蛋白质与核酸相互作用方面具有重要的应用价值，但也存在一些限制。
首先，EMSA实验只能提供间接的蛋白质与核酸结合信息，无法直接确定结合的强度或亲和力。
其次，EMSA实验需要一定的实验操作技巧，且耗时耗力。
此外，由于核酸与蛋白质之间的相互作用是动态的，EMSA实验只能提供一瞬间的结合信息，无法反映动态变化过程。
EMSA实验是一种常用的研究蛋白质与核酸相互作用的方法。
通过观察核酸与蛋白质结合复合物的电泳迁移差异，可以研究它们之间的相互作用及其调控机制。
化学发光标记生物素
化学发光标记生物素引言：化学发光技术是一种常用的生物分析技术，在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域发挥着重要作用。
其中，化学发光标记生物素技术是一种常见的应用，通过将生物素与特定的化学发光物质结合，可以实现对生物分子的高灵敏度、高特异性的检测。
本文将介绍化学发光标记生物素的原理、应用和优势。
一、化学发光标记生物素的原理化学发光标记生物素是基于生物素-亲和素系统的原理进行设计与制备的。
生物素是一种维生素B7，具有与亲和素（如蛋白质A、蛋白质G等）结合的特性。
在化学发光标记生物素中，生物素首先与化学发光物质（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）结合，形成生物素-化学发光物质复合物。
然后，生物素-化学发光物质复合物与待检测的目标分子（如蛋白质、核酸等）结合，形成生物素-目标分子-化学发光物质复合物。
最后，在适当的条件下，化学发光物质发生催化反应，产生可见光或荧光信号，从而实现对目标分子的检测。
二、化学发光标记生物素的应用化学发光标记生物素在生物医学研究和临床诊断中得到广泛应用。
以下是几个常见的应用领域：1. 免疫分析：化学发光标记生物素技术可以用于检测抗体和抗原的相互作用，从而实现对疾病标志物的检测。
例如，在HIV感染的诊断中，可以使用化学发光标记生物素技术检测HIV抗体的存在。
2. 基因检测：化学发光标记生物素技术可以用于检测基因的存在和表达水平。
例如，在PCR扩增反应中，可以使用化学发光标记生物素技术检测扩增产物的存在与否，从而实现基因的定性和定量分析。
3. 药物筛选：化学发光标记生物素技术可以用于评估药物与靶标的相互作用强度。
通过将药物与生物素结合，然后与靶标结合，可以利用化学发光技术检测药物-靶标复合物的形成情况，从而评估药物的亲和力和选择性。
三、化学发光标记生物素的优势化学发光标记生物素技术相比传统的染色标记技术具有以下优势：1. 高灵敏度：化学发光标记生物素技术可以实现对目标分子的高灵敏度检测，因为化学发光信号产生的过程具有高放大倍数。
EMSA实验
5、紫外交联
紫外交联仪是一种多用途的254mm紫外辐射系统主要用于将 核酸交为使核苷酸固定在杂交膜上。传统的方法是将膜置于80℃ 真空烘箱中烘2小时，在本紫外交联仪上仅需在254nm紫外光下照 射几秒钟即可。
· 紫外照射可使杂交信号比
传统烘烤法提高5-10倍。
5.洗涤、孵育 用Washing Buffer洗涤(整个 过程避免膜干燥)
倒掉冲洗缓冲液，加入Block Buffer轻微震荡20min
加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素 室温震荡孵育45min。（勿将酶标记
物直接加到膜上）
去掉酶联物稀释液，用Washing Buffer洗膜三次，每次室温轻微震荡1
0min。
配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。 （可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，
使底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）
6、曝光成像
两种方法: 化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像 操作基本和Western 试验操作相当, 只是这个膜是一次性
的,不能重复使用, 一定保存好图片!由于跑得是非变性凝胶,蛋 白保持天然构像和活性,所以条带很可能是一块一块的而不像 WB那样很规整的一条细线,这个很正常。
用TNFa刺激肿瘤细胞后得到的核蛋白的NFKB的EMSA试验 图片
三、常见问题
1、为什么看不到迁移带？
1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。 2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。 3）探针与蛋白无特异性的相互作用。 4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。 5）曝光或者成像时间过短。
二、实验操作步骤
1、实验前准备
（1）合理的实验方案 根据研究目的合理设计特异性探针实验 组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体 组、特异性核酸竞争组等。
emsa实验原理
EMSA实验原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质与核酸（一般是DNA）之间的相互作用。
该技术通过观察蛋白质-核酸复合物在凝胶电泳中的迁移率变化，可以揭示蛋白质与DNA结合的情况。
实验原理在EMSA实验中，首先需要准备一定浓度的DNA片段，通常是已知序列的DNA探针。
接着，将待检测的蛋白质与这些DNA探针一起混合，形成蛋白质-核酸复合物。
随后，将这些混合物加载到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。
在凝胶电泳过程中，如果DNA片段没有与蛋白质结合，那么它们将会沿着电场方向运动到特定位置。
但是，如果DNA片段与蛋白质结合形成复合物，则复合物的迁移率会受到影响，迁移速度将会减慢。
结果就是在凝胶中观察到不同带电簇的出现，这些带电簇代表了不同的蛋白质-核酸复合物。
通过对凝胶电泳结果进行分析，可以确定哪些蛋白质与DNA结合，并且可以定量检测它们之间结合的强度和亲和力。
这样的信息对于理解蛋白质功能以及基因调控机制至关重要。
实验步骤1.制备实验样品：准备已知序列的DNA探针和待检测的蛋白质溶液。
2.形成蛋白质-核酸复合物：将DNA探针和蛋白质混合，在合适的条件下形成复合物。
3.加载到凝胶中：将混合物加载到琼脂糖凝胶上，进行电泳分离。
4.电泳分离：在合适的电场作用下，观察蛋白质-核酸复合物的迁移情况。
5.结果分析：分析凝胶电泳结果，确定蛋白质-核酸复合物的形成情况以及强度。
结论EMSA实验是一种简单有效的方法，用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用。
通过该实验，可以揭示蛋白质在基因调控中的作用，帮助科研人员深入理解这些生物大分子之间的相互作用机制。
EMSA技术在基因编辑、药物研发等领域有着广泛的应用前景，对于推动生命科学的发展起着重要作用。
荧光标记生物素
荧光标记生物素荧光标记生物素是一种常用的实验技术，在生物学和生物化学研究中起着重要作用。
荧光标记生物素利用荧光染料与生物素的特异性结合，将荧光信号与感兴趣的生物分子相结合，从而实现对其位置和表达水平的研究。
本文将介绍荧光标记生物素的原理、应用和优缺点。
一、荧光标记生物素的原理荧光标记生物素的原理基于生物素和荧光染料之间的结合。
生物素是一种小分子有机化合物，具有与细胞膜、细胞器和蛋白质等生物分子的特异性结合能力。
荧光染料可以发射特定波长的光信号，通过与生物素结合，将荧光信号引入到感兴趣的生物分子中。
二、荧光标记生物素的应用1. 免疫荧光染色：荧光标记生物素可以与抗体结合，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平和分布情况。
通过免疫荧光染色技术，可以观察细胞内特定蛋白质的定位和表达变化，从而研究其功能和调控机制。
2. 原位杂交：荧光标记生物素可以与DNA或RNA探针结合，用于检测特定基因在组织或细胞中的表达情况。
原位杂交技术可以帮助研究人员了解基因的表达模式、调控机制和细胞分化过程。
3. 荧光显微镜成像：荧光标记生物素可以用于荧光显微镜成像，观察细胞和组织中特定分子的定位和动态变化。
荧光显微镜成像技术可以提供高分辨率的图像，帮助研究人员深入了解细胞结构和功能。
4. 荧光流式细胞仪：荧光标记生物素可以用于流式细胞仪的分析，实现对细胞表面标记物、细胞周期和细胞凋亡等生物学过程的研究。
荧光流式细胞仪可以高通量地分析大量细胞的荧光信号，帮助研究人员获取更精确的数据。
三、荧光标记生物素的优缺点1. 优点：a. 高灵敏度：荧光标记生物素可以实现对生物分子的高灵敏检测，提供准确的定量数据。
b. 高特异性：荧光标记生物素通过特异性结合，可以选择性地标记感兴趣的生物分子，避免背景干扰。
c. 易于操作：荧光标记生物素的使用方法相对简单，不需要复杂的实验步骤和设备。
2. 缺点：a. 荧光信号衰减：荧光标记生物素的荧光信号会随着时间的推移而衰减，降低观察的时间窗口。
生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用精选 课件
North2South 杂交原理和操作流程RP的催化下反应发光，检测
3、杂交：生物素标记的 探针与靶DNA结合
底物
HRP
SA
│B
B
│
1、DNA电泳，转膜，紫外交联固定
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4、HRP标记的链亲和素与 探针上的生物素结合
2、洗膜封闭
Kit组成
▪ 该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成 ▪ North2South™生物素随机引物Kit(该试剂盒含有足以完成10次标记反应的试
剂，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) ▪ 化学发光检测Kit 89880可检测1080cm2的杂交膜.
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探针得率高
▪ 高产率 ：模板DNA可以少至100ng，Klenow聚合酶无核酸外切酶活 ，产率提高，每次标记至少产生1-2 ug的生物素标记的探针。
▪ 使用方便：标记好的探针可以在冰箱里保存一年。
Affinity cytochemistry
Localization studies Signal Amplification
Diagnostics Histochemistry
7
1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应用
“Everything is possible - with the right tools”
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原理
▪ 标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板， 在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP掺入到合 成的DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性 生物素标记的DNA探针
▪ 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP上的链亲和 素结合，HRP与Pierce 的Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测
化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒 D3308 说明书
化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒产品编号 产品名称包装 D3308化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒1000cm 2产品简介：化学发光法生物素检测试剂盒(Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit)是一种通过Streptavidin-HRP 及后续的BeyoECL Moon 试剂来实现化学发光检测Biotin 标记核酸的检测试剂盒。
适用于Southern blot 、Northern blot 、ribonuclease protection assay (RPA)或EMSA 等实验中，采用生物素标记的DNA 或RNA 探针时的检测。
本试剂盒不适用于生物素标记蛋白的检测。
本试剂盒同时还提供了封闭液、洗涤液等检测时所需的配套试剂。
本试剂盒采用了高质量的Streptavidin-HRP Conjugate ，HRP 和Streptavidin 共价交联的比例大于3，这样比采用Streptavidin 和Biotin-HRP conjugate 两种试剂进行检测要更方便，并且灵敏度更高。
采用了非特异性结合比avidin 更低的strepatavidin ，使检测结果背景更低灵敏度更高。
本试剂盒没有提供生物素探针标记相关的试剂，生物素标记的DNA 探针或EMSA 探针的制备可以相应地使用碧云天生产的生物素3'末端DNA 标记试剂盒(D3106)或EMSA 探针生物素标记试剂盒(GS008)。
本试剂盒可以用于检测至少10块10×10cm 有生物素标记EMSA 探针的膜，即共1000cm 2。
包装清单：产品编号 产品名称包装 D3308-1 BeyoECL Moon A 液 55ml D3308-2 BeyoECL Moon B 液 55ml D3308-3 Streptavidin-HRP Conjugate100µl D3308-4 封闭液 380ml D3308-5 洗涤液(5X)250ml D3308-6检测平衡液 250ml —说明书1份保存条件：D3308-3 Streptavidin-HRP Conjugate 在-20ºC 保存，其余可4ºC 保存。
EMSA 中文操作说明
Procedure for Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)This kit has been optimized for use with polyacrylamide mini (8 × 8 × 0.1cm) gels. For larger gels, adjust electrophoresisconditions and detection reagent volumes accordingly.A. Plan Binding Reactions•Understanding the Control EBNA SystemInclude a complete set of three reactions each time an EMSA is performed. These reactions and expected results for the Control Epstein-Barr nuclear antigen (EBNA) System, which is included with the kit, are described in Table 1.andbyDemonstrates that the signal shift observed in #2 can beprevented by competition from excess non-labeled DNA,specificaccording to Table 2. Each 20 µl binding reaction contains 20 fmol of Biotin-EBNA Control DNA. Reactions were electrophoresed, transferred and detected according to the steps in Sections B-G of this protocol. If the kit is being used for the first time, perform the Control EBNA System reactions to verify that the kit components and overall procedure are working properly.B．准备与预电泳1.用0.5XTBE准备非变性的聚丙烯酰胺凝胶或预制的DNA阻滞凝胶。
生物素标记核酸方法
生物素标记核酸方法引言：生物素标记核酸方法是一种常用的实验技术，用于检测、定位和研究核酸的功能和分布情况。
生物素（Biotin）是一种小分子化合物，具有较强的亲和力和特异性，可以与酶和抗体等蛋白质结合，从而实现对核酸的标记和检测。
本文将介绍生物素标记核酸的原理、方法和应用。
一、生物素标记核酸的原理生物素标记核酸的原理基于生物素与亲和剂的结合。
生物素能够与亲和剂如酶、抗体等特异性结合，形成稳定的复合物。
通过将亲和剂标记在生物素上，就可以实现对核酸的标记。
常用的生物素标记方法包括生物素标记末端法、生物素标记引物法和生物素标记缺口法等。
二、生物素标记核酸的方法1. 生物素标记末端法生物素标记末端法是一种将生物素标记在核酸的末端的方法。
首先，将核酸末端修复，以便连接生物素分子。
然后，在核酸末端上引入生物素分子，通过特定的酶或化学试剂进行连接。
最后，通过适当的检测方法，如酶标测定法或荧光探针法，可以检测到生物素标记的核酸。
2. 生物素标记引物法生物素标记引物法是一种将生物素标记在核酸引物上的方法。
在引物的适当位置引入生物素分子，并通过特定的酶或化学试剂进行连接。
接下来，使用生物素标记的引物与待检测的核酸进行反应，形成生物素标记的核酸引物-目标核酸复合物。
最后，通过适当的检测方法，如PCR、电泳或原位杂交等，可以检测到生物素标记的核酸。
3. 生物素标记缺口法生物素标记缺口法是一种通过特定酶切割核酸，形成生物素标记的缺口的方法。
首先，在核酸的适当位置引入生物素分子，并通过特定的酶或化学试剂进行连接。
然后，使用特定酶切割核酸，使核酸链断裂形成缺口，并在断裂的位置上引入生物素标记。
最后，通过适当的检测方法，如原位杂交或荧光显微镜观察等，可以检测到生物素标记的核酸。
三、生物素标记核酸的应用1. 分子生物学研究生物素标记核酸方法在分子生物学研究中广泛应用。
例如，通过生物素标记的引物进行PCR扩增，可以检测和定量目标核酸的存在和表达水平。
EMSA技术的原理
EMSA技术的原理EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）技术是一种常用的生物学实验方法，用于研究蛋白质与核酸相互作用的原理。
该技术可以测定核酸结合蛋白的结合亲和性和特异性。
下面将详细介绍EMSA技术的原理。
EMSA技术的原理基于核酸与蛋白质相互作用的电泳迁移差异。
在该实验中，核酸分子（DNA或RNA）与特定的蛋白质结合形成复合物，从而改变了核酸分子的电泳迁移性。
这种差异可以通过电泳分离和检测来观察和分析。
EMSA技术的主要步骤包括以下几个方面：第一步是制备探针。
通常使用核酸探针来进行EMSA实验。
探针可以是标记有荧光染料或放射性同位素的DNA或RNA分子。
这些探针通常具有与目标蛋白质结合的特定序列。
第二步是制备样品。
样品通常包括目标蛋白质和核酸探针。
目标蛋白质可以是从细胞提取的总蛋白质，也可以是经过纯化的特定蛋白质。
核酸探针和目标蛋白质在适当的缓冲液中混合，形成复合物。
第三步是电泳分离。
样品中的复合物和未结合的核酸探针通过电泳在聚丙烯酰胺凝胶中分离。
由于复合物的存在，复合物的电泳迁移速度较慢，而未结合的核酸探针的电泳迁移速度较快。
第四步是转移和固定。
在电泳分离之后，核酸分子被转移到固定在膜上的凝胶上。
这一步可以通过将凝胶与膜进行转移来完成。
第五步是探针的探测。
转移后的凝胶上的核酸探针可以使用适当的方法进行探测。
常用的方法包括荧光染色、放射性探测和化学发光等。
EMSA技术的原理基于核酸与蛋白质相互作用的电泳迁移差异，通过核酸探针与目标蛋白质结合形成复合物，从而改变了核酸分子的电泳迁移性。
这种差异可以通过电泳分离和探测来观察和分析。
EMSA技术在研究蛋白质-DNA或蛋白质-RNA相互作用、转录调控、信号传导等方面具有广泛的应用。
它可以帮助科学家们更好地理解生物学过程以及相关疾病的发生机制，为新药的开发和治疗提供有力的依据。
化学发光法EMSA试剂盒 说明书
装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜 液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜 方法请参考电转膜装置的使用说明。 G. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一 步的交联步骤，不可使膜干掉。 7. 交联： A. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒。如果没有紫外交联仪可以使用普 通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工 作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。 B. 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。 如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联 一次，以进一步改善交联效果。 8. 化学发光法检测生物素标记的探针： A. 37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。 注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种 溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。 B. 取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。 C. 取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。 D. 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水 平摇床上缓慢摇动15分钟。 E. 取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。 F. 将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。 G. 去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。 H. 重复步骤G 三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。 I. 将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。 J. 取5ml BeyoECL Plus Reagent A和5ml BeyoECL Plus Reagent B混匀，配制成BeyoECL Plus Reagent工作液。注意： BeyoECL Plus Reagent工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。 K. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。 L. 在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECL Plus Reagent工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置 2-3分钟。 M. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也 称片夹)内。 N. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30 秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。
EMSA说明书
非放射性凝胶迁移试剂盒（EMSA）操作手册 本说明书适用于产品号为SIDET001, SIDET003与SIDET004的产品目录号 产品名称 包装SIDET001非放射性 NF-KB EMSA36 次结合反应SIDET003非放射性 STAT3 EMSA36 次结合反应SIDET004非放射性 STAT5 EMSA36 次结合反应VER. 3.112005年2月目 录1. 简介 (3)2. 试剂盒包装清单 (3)3. 自备实验材料与仪器 (4)4. DNA/蛋白质结合反应 (4)5. 聚丙稀酰胺凝胶电泳 (5)6. 电转移 (6)7. DNA的交联固定 (6)8. 化学发光反应 (6)9. 化学发光图像显示 (7)10．常见问题 (8)11. 参考文献 (8)12．注意事项 (9)2005© Viagene，All rights reserved.1．简介EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。
这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。
当核转录因子与一条人工合成的特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。
Viagene公司的非放射性EMSA成套试剂盒是结合高灵敏度的化学致发光技术建立起来的实验系统。
与市场上的EMSA产品比较，Viagene公司的EMSA试剂盒操作更简单迅速，并可得到更好的实验效果；与同位素放射法相比Viagene公司的非放射性EMSA试剂盒解决了探针不稳定、同位素辐射等问题，并具有高灵敏度、快速获得结果、避免材料浪费等优点。
目前Viagene公司提供三套非放射性EMSA试剂盒用来检测活化的NF-KB(核转录因子-KB，Cat#; SIDET001)、STAT3(信号转导和转录激活因子3，Cat#; SIDET003)和STAT5(信号转导和转录激活因子5，Cat#; SIDET004)。
生物素化标记作用
生物素化标记在免疫组化中起到了至关重要的作用。免疫组化是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的存在和定位。生物素化标记可以将生物素与抗体结合，形成生物素化抗体复合物。通过与细胞或组织中目标蛋白质的结合，生物素化抗体复合物可以用于检测目标蛋白质的表达和定位，从而帮助研究者了解蛋白质在细胞或组织中的分布和功能。
生物素化标记还广泛应用于蛋白质亲和纯化技术中。蛋白质亲和纯化是通过特定的亲和剂选择性地富集目标蛋白质的技术。生物素化标记可以将生物素引入到亲和剂（如亲和树脂、亲和抗体等）中，形成生物素化亲和剂。通过与目标蛋白质的结合，生物素化亲和剂可以用于选择性地富集目标蛋白质，从而帮助研究者纯化和分析蛋白质。
生物素化标记还可以应用于荧光显微镜分析中。荧光显微镜是一种常用的细胞和组织成像技术，可以用于研究生物体内部结构和功能。生物素化标记可以将生物素与荧光染料结合，形成生物素化荧光探针。通过与目标结构或分子的特异性结合，生物素化荧光探针可以用于实现对目标结构或分子的高分辨率成像，从而帮助研究者观察和分析生物过程。
生物素化标记在原位杂交实验中也发挥着重要的作用。原位杂交是一种用于检测特定核酸序列在细胞或组织中的存在和定位的技术。生物素化标记可以将生物素引入到探针（通常是亮氨酸探针）中，形成生物素化探针。通过与目标核酸序列的互补配对，生物素化探针可以用于检测目标核酸序列的存在和定位，从而帮助研究者了解基因表达和调控的机制。
EMSA实验方案(LightShift
EMSA实验方案(LightShiftEMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种常用的方法，用于研究DNA与蛋白质的相互作用。
其中的LightShift EMSA实验方案结合了EMS（Electrophoretic Mobility Shift）技术和特殊的标记技术，可以用来检测DNA与蛋白质的结合，并研究其结合位点、结合亲和性以及识别新的结合蛋白等。
以下是LightShift EMSA实验方案的详细步骤：1.DNA质粒制备：从菌落中挑出含有目标DNA或合成的DNA片段的细菌，并进行PCR扩增。
通过酶切方法，将目标DNA切割并提取。
使用琼脂糖凝胶电泳检测切割效果，然后进行纯化并定量。
2.DNA标记：使用合适的DNA标记试剂盒，将目标DNA进行标记。
常用的标记方法包括放射性标记，如32P标记，或非放射性标记，如荧光标记、生物素标记等。
3.蛋白质提取：从细胞提取目标蛋白质，通过抑制剂和洗涤缓冲液可以避免蛋白质降解和保持其活性。
使用草履虫虫酶或超声波破碎等方法破坏细胞膜，并将蛋白质溶于提取缓冲液中。
4.EMSA反应：在一个反应管中，将标记的DNA与蛋白质混合，然后加入适量的电泳缓冲液和其他成分。
根据实验需要，可以添加特定的抑制剂或其他化合物。
混合物进行孵育反应。
5.凝胶电泳：将反应混合物分别装入聚丙烯酰胺凝胶槽中，进行凝胶电泳。
使用含有缓冲液的凝胶槽，在适当的电压下进行电泳，使DNA和蛋白质分别根据其电荷、大小和结构在凝胶中迁移。
6.显影与分析：根据标记的方式，选择合适的显影方法。
如果使用放射性标记，可以使用X射线底片显影；如果使用非放射性标记，可以使用荧光标记物激发和检测。
通过观察DNA迁移位置和据对比组进行分析，判断是否有蛋白质结合的迁移带。
7.重复实验与数据分析：重复以上实验步骤，以确保结果的重复性和可靠性。
通过对不同条件下的实验数据进行统计学分析，计算结合率和蛋白质与DNA结合的亲和性。
《现代生命科学研究技术》实验指导-EMSA验证蛋白与DNA的结合-笔记版
利用凝胶阻滞实验（EMSA）验证蛋白与DNA的结合一、实验原理及应用凝胶阻滞实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA），是一种研究蛋白和核酸相互作用的技术。
蛋白质与放射性标记或生物素标记的探针结合后，形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率比自由探针的迁移率大大降低，表现为条带滞后。
凝胶阻滞实验具有简单、快捷、灵敏等优点，可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来进一步确定阻滞条带所结合的蛋白质。
结合定点突变技术，还可以用来研究蛋白结合核酸的关键位点。
许多生物学过程，如染色体的包装、维持及控制，都与蛋白质-DNA间的非特异性相互作用有关。
在古菌中发现的某些小分子量DNA结合蛋白具有与组蛋白类似的功能，按分子量不同分为7kDa、8kDa和10kDa三类。
本实验中所用的蛋白质Sul7d是来源于嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）中的7kDa 蛋白，能够和DNA非特异性结合。
本实验中利用EMSA实验验证体外表达的Sul7d蛋白和DNA的相互作用。
60 bp的DNA片段由公司合成。
部分DNA片段由生物素标记。
将纯化好的Sul7d蛋白与DNA底物共孵育，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；将凝胶上的样品转移到NC膜，利用显色剂显影后即观察到目标蛋白与不同结构底物的结合情况。
生物素标记法采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，以随机引物为起始引物，将生物素标记的dUTP引入到合成的DNA探针中，产生高活性生物素标记的DNA片段。
生物素标记相对于同位素标记，操作方便、安全。
为了获得准确的实验结果，还应该在蛋白质-核酸混合液中分别加入不同浓度的“竞争剂”（competitor）。
竞争剂与探针序列相同，但没有被标记。
如果被检测的滞后条带随“竞争剂”浓度增加而逐渐减弱，说明蛋白质和探针之间的结合是特异的。
已知结合序列emsa探针设计方法
已知结合序列emsa探针设计方法EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一种用来研究蛋白质与DNA相互作用的实验技术。
这项技术广泛应用于基因调控、信号转导以及药物研发等领域。
而emsa探针设计是EMSA技术中的重要一环，它直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍emsa探针设计的方法和注意事项，以供实验人员参考。
首先，我们需要了解什么是EMSA技术以及为什么它如此重要。
EMSA技术是一种通过电泳检测蛋白质与核酸结合的实验方法。
通过在凝胶中进行电泳，能够观察到DNA和蛋白质相互作用后的迁移速度变化，从而得知它们之间是否发生了结合。
这项技术在基因调控研究中具有重要的应用，可以帮助科研人员了解蛋白质与DNA之间的相互作用机制，从而有助于揭示生物学过程中的调控原理。
而EMSA实验中的探针设计则是至关重要的。
探针是一段具有特定序列的DNA或RNA分子，它会与目标蛋白质结合，从而形成DNA-蛋白质复合物。
因此，探针的设计需要考虑到多个因素，包括探针长度、序列特异性、标记方式以及纯度等。
只有设计合理的探针，才能保证实验结果的准确性和可靠性。
接下来，我们将从几个方面介绍emsa探针设计的方法和注意事项。
首先是探针的序列设计。
在进行EMSA实验时，我们需要设计一段具有特定序列的DNA或RNA探针，以便与目标蛋白质结合形成复合物。
因此，在探针设计时需要考虑到探针的长度、序列特异性和GC含量等因素。
通常情况下，探针的长度应在20-50bp之间，而且需要确保探针的序列能够特异性地结合目标蛋白质，同时尽量避免与其他非特异性蛋白质结合。
其次是探针的标记方式。
在EMSA实验中，我们通常需要对探针进行标记，以便于观察DNA-蛋白质复合物的形成。
目前常用的探针标记方法包括放射性标记、荧光标记和生物素标记等。
每种标记方法都有其优缺点，实验人员需要根据实际情况选择合适的标记方式。
生物素标记的应用实验原理
生物素标记的应用实验原理1. 引言生物素标记是生命科学研究中常用的一种实验技术，在生物学领域中有着广泛的应用。
本文将介绍生物素标记的原理、实验步骤以及常见应用领域。
2. 生物素标记的原理生物素标记是利用生物素与亲生物素的高亲和力进行标记的一种技术。
生物素是一种小分子，能够与亲生物素结合蛋白质相互作用。
亲生物素是一种对生物素具有高亲和力的结合剂，通过与生物素结合形成稳定的复合物。
3. 生物素标记的实验步骤生物素标记实验通常包括以下步骤：3.1 标记反应首先，需要准备好待标记的分子，可以是蛋白质、核酸或其他小分子。
然后，将生物素和亲生物素标记剂一起与待标记的分子进行反应。
标记反应可以通过化学交联、生物合成或标记基团的化学反应等方式进行。
3.2 纯化和检测完成标记反应后，需要对反应产物进行纯化和检测。
纯化可以使用凝胶过滤、柱层析等方法进行。
检测可以利用电泳、质谱等技术进行，以确保标记的分子具有高纯度和理想的标记效果。
3.3 应用实验标记完成的分子可以用于各种生物学实验中。
常见的应用实验包括免疫组化、荧光染色、原位杂交等，这些实验可以在细胞水平或组织水平上观察到标记分子的位置和定位。
4. 生物素标记的应用领域生物素标记在生命科学研究中有着广泛的应用。
下面将介绍几个常见的应用领域：4.1 蛋白质研究生物素标记可以用于蛋白质的表达和纯化过程中，通过标记蛋白质使其易于检测和纯化。
此外，生物素标记还可以用于蛋白质间相互作用的研究，通过标记不同蛋白质使其易于检测和定位。
4.2 基因组学研究生物素标记可以用于DNA或RNA的标记，用于基因组学研究中的测序、杂交等实验。
标记后的DNA或RNA可以用于检测特定序列、寻找基因突变等。
4.3 细胞信号转导研究生物素标记可以用于研究细胞信号转导通路中的蛋白质相互作用和定位。
通过标记信号蛋白，可以研究其在信号传递过程中的活性、相互作用和定位。
4.4 药物研发生物素标记可以用于药物研发中的药物靶点筛选和药物活性评价。
NF-kb通路讨论
这是从丁香园看到的非常好的讨论NF-KB通路的帖子，个人觉得很好，贴出来分享传播一下，详细的登录丁香园顶贴吧~/bbs/topic/1634747，如有侵权请和我说明，我删除文档NF-KB通路专题讨论NF-kB是近年发现的转录因子家族中的新成员，是细胞内最重要的核转录因子，他在许多细胞刺激介导的细胞信息的转录调控中起核心作用，参与多种基因的表达和调控，是细胞激活的标志.NF-κB一般以同源或异源二聚体形式存在.在静息细胞中，NF-kB二聚体通过非共价键的形式与其抑制蛋白IkB 结合而分散在细胞质内，包括内质网应激在内的许多因素可激活NF-kB，激活后的NF-kB进入细胞核，与DNA模块上的特异蛋白结合，诱导特异mRNA的产生，最后转录、产生和释放各种细胞因子.NF-κB，激活后与靶基因上特定的DNA序列（κB位点，其核心序列为GGGRNNYYCC，R：嘌呤Y：嘧啶N：任意碱基）结合并调节基因转录，只要有这段核心序列就行，无种属差异.这是一段通用序列，适用于人、大鼠：5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’老板最近要求做信号转导，所以对NF-KB肯定要好好研究一番。
我是菜鸟，所以还需要各位大虾多多指教！我看了各位大虾的帖子，总的来说检测NF-KB的方法有那么几种：1．EMSA：生物素标记的EMSA试剂盒,PIERCE公司，效果好、灵敏，可一天完成整个过程，特别方便。
EMSA试剂盒约4000多元，可打8.5折，3500元。
最重要的就是核蛋白的质量，基本上就是按说明书操作。
EMSA现在有很多种成像方法，除了放射性标记外，还有地高辛等非放射性标记方法。
以下两篇文章中还有更多的方法，供参考：>2．免疫组化：免疫组化可以观察NF-kB的核移位情况，但定量较困难，可以用image pro来计数。
3。
western blot：可以测胞浆蛋白IkB，另外，western也可以测核蛋白NF-kB，用p65抗体，但要求核蛋白量较多，意义和EMSA相仿。
生物素标记核酸方法
生物素标记核酸方法引言：生物素标记核酸方法是一种常用的实验技术，通过将生物素与核酸分子结合，可以追踪和检测特定的核酸序列。
本文将介绍生物素标记核酸的原理、方法以及应用领域。
一、原理生物素是一种小分子有机物，具有很强的亲和力。
生物素标记核酸方法利用生物素与亲和剂亲和结合的特性，将生物素连接到核酸分子上。
通常采用二亚甲基双亲和剂（EDC）或过氧化物酶（H2O2）等化学试剂进行反应，将生物素共价地连接到核酸分子上。
二、方法1. 生物素标记DNA方法（1）制备DNA探针：将需要标记的DNA序列与生物素探针连接，通常采用连接试剂进行反应，生成生物素标记的DNA探针。
（2）标记DNA探针：将连接了生物素的DNA探针与目标DNA 序列进行杂交反应，使生物素与目标DNA结合。
（3）检测信号：通过酶标法、荧光染料或放射性同位素等方法，将生物素标记的DNA探针检测出来。
2. 生物素标记RNA方法（1）制备RNA探针：将需要标记的RNA序列与生物素探针连接，通常采用连接试剂进行反应，生成生物素标记的RNA探针。
（2）标记RNA探针：将连接了生物素的RNA探针与目标RNA序列进行杂交反应，使生物素与目标RNA结合。
（3）检测信号：通过酶标法、荧光染料或放射性同位素等方法，将生物素标记的RNA探针检测出来。
三、应用领域1. 基因表达分析：生物素标记核酸方法可以用于研究基因的表达水平，通过标记mRNA或miRNA等核酸分子，可以检测它们在细胞或组织中的表达情况。
2. 分子诊断：生物素标记核酸方法可以用于检测病原体的核酸序列，如病毒、细菌等，用于疾病的诊断和监测。
3. 分子遗传学研究：生物素标记核酸方法可以用于研究基因的遗传变异、突变等，从而揭示基因与表型之间的关系。
4. 蛋白质相互作用研究：生物素标记核酸方法可以用于研究蛋白质与核酸的相互作用，通过标记DNA或RNA分子，可以检测它们与特定蛋白质的结合情况。
结论：生物素标记核酸方法是一种重要的实验技术，可以用于追踪和检测特定的核酸序列。
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交联化学： 交联化学：交联剂，修饰试剂，生物素化试剂…
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1. 生物素标记和化学发光检测 技术在核酸杂交和EMSA EMSA中的应用 技术在核酸杂交和EMSA中的应用
The world leader in serving science
关于生物素
别名： Vitamin B 分子量： 244.31 水溶性好 结合对象： 亲和素Avidin 亲和素Avidin 链亲和素Streptavidin 链亲和素Streptavidin 中性亲和素NeutrAvidin 中性亲和素NeutrAvidin 单体亲和素Mono 单体亲和素Mono Avidin
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3. 化学发光检测
Note1:要保证所有缓冲液充分溶解，没有颗粒 1.封闭：封闭液20ml（0.25ml/cm2膜）于37－50°振荡洗膜封闭15分钟 2.抗体孵育：20ml抗体稀释液（ 66.7ulSA-HRP＋20ml封闭液），室温孵育 15分钟 3.洗膜：20ml的1X漂洗缓冲液分别室温轻柔振荡漂洗4次，每次5分钟 4.平衡：杂交膜与30ml的底物平衡液室温轻柔振荡孵育5分钟 5.底物孵育：把湿润的膜放在一个干净的塑料盘（平皿）里，与底物工作液 在室温下孵育5分钟（推荐在暗室中）。确保膜被底物溶液完全淹没或覆 盖底物工作溶液需足够以完全覆盖杂交膜（约0.1ml/cm2）。 6.曝光：滤纸吸附多余底物，作好标记，保鲜膜包裹，确保保鲜膜和杂交膜 间无气泡和皱褶。把包好的杂交膜放在暗夹里，放上X光片，曝光1－5分 钟。曝光时间长短可以稍有变化以获得理想的信号。 7.从暗夹里取出X光片，按厂家的使用说明书显影和定影。 Note2:可与底片背景去除试剂配合使用，以获得更理想的实验结果
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2. 探针制备二之探针纯化 探针制备二之探针纯化
1. 2. 3. 4. 5. 6. 加入5ul醋酸铵于上述50ul反应离心管，吹打混匀 加入110 ul 冰预冷的无水乙醇，充分混匀，冰或－70°放置15分钟 12000rpm 4°离心15分钟 观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀 用冰预冷的70％乙醇洗涤一次，12000rpm 4°离心15分钟，观察沉 淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀 50ulTE或RNA酶free 的水溶解沉淀（－20℃或－70℃长期保存）
Affinity cytochemistry
Localization studies Signal Amplification Diagnostics Histochemistry
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1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应 1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应 用
“Everything is possible - with the right tools”
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2. 杂交和洗膜之严谨洗膜 杂交和洗膜之严谨洗膜
1. 2. 配制1X严谨洗膜缓冲液，平衡严谨洗膜缓冲液到室温（溶解充分） ，加等体积去离子水配制所需洗膜液（0.2ml/cm2膜） 将膜转移到一个新的容器中（杂交管）。加入1X严谨洗膜液10－ 20ml，旋转洗膜3次（DNA杂交55℃，RNA:RNA杂交65℃），每 次15－20分钟。
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对照DNA点杂交 对照DNA点杂交 DNA
备用试剂：0.1N NaOH 煮沸变性DNA变性成单链（ 对照DNA，5μl，250ng/μl） 准备生物素标记的对照探针或阳性样品探针（见探针标记，纯化和定量 ） 准备目标膜（注意：推荐使用带正电尼龙膜，需带无粉手套并用乙醇净 化的镊子拿膜。） • 0.1N NaOH稀释变性DNA得到1，0.5，0.25，0.125，0.0625， 0.0312，和0.015ng/μl稀释梯度。 • 在膜上平行点两点。点前最好把膜预洗一下，半干的时候点，但 干点同样有用。 • 用1X TE轻轻漂洗膜（～10秒），微波炉高火加热2分钟，紫外交 联（自动交联）或烘干固定。注：如果没有紫外交联仪，则可以 注 将膜置于80度温箱烘烤2－3小时，可达到固定目的 • 交联固定完，用0.1％SDS预湿润膜，进入下面预杂交，杂交以及 底物孵育和曝光 杂交，严谨洗膜和封闭，抗体孵育，洗膜，平衡，底物孵育以及曝光见 前所述
该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成 North2South™生物素随机引物Kit(该试剂盒含有足以完成10次标记反应的试 剂，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) 化学发光检测Kit 89880可检测1080cm2的杂交膜.
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探针得率高
高产率 ：模板DNA可以少至100ng，Klenow聚合酶无核酸外切酶活， 产率提高，每次标记至少产生1-2 ug的生物素标记的探针。 使用方便：标记好的探针可以在冰箱里保存一年。
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2. 杂交和洗膜之杂交
1. 平衡杂交液到室温 2. 预杂交:将转好的膜置于杂交管，点样面朝上，确保膜被杂交缓冲液均 匀覆盖，杂交炉要缓慢转动以保证杂交液与膜能充分接触，（每平方 厘米膜至少0.1ml杂交液。除了RNA:RNA杂交用65℃外，其他的都用 55℃）,50-100rpm旋转，至少30分钟。 3. 热变性探针：煮沸变性10分钟，迅速在冰/盐水混合物退火5-10分钟 4. 杂交：加入已经变性的DNA探针于杂交液，充分混匀（探针加入到杂交 液，不要加到膜上，要轻轻晃动，使探针均匀分散在杂交液中），探 针浓度约30ng/ml杂交液, 50-100rpm旋转，孵育过夜。
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检测安全
采用非同位素的化学发光系统，免除放射性的危险与处理同位素废物 的麻烦，减少环境污染；无须专门的同位素操作室，易于使用推广 anyone,anywhere and anytime
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高灵敏度与高信噪比
生物素标记的dUTP保证了与HRP标记的链亲和素（Kd=10-15M； 抗体10-5～8M ） Kd=10 15M； 抗体10 最大结合，经受最严谨的洗膜条件 优化杂交液和封闭液保证了探针与靶DNA的完美结合 Dura （10-14克）底物保证了保证了高于地高辛（DIG）-AP标记系统，等同 于或者超过同位素的检测灵敏度
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方便快速
0.5－10分钟即可检测到特异性信号 6小时的超长发光时间允许多次曝光 可以使用冷光CCD成像仪扫描成像
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操作流程与时间
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 探针标记与纯化（1小时） 预杂交（0.1mL/cm2 ,55或者65°, 0.5小时） 杂交（8－12小时） 严谨洗膜（3X15分钟,提高温度,降低离子强度） 封闭（ 0.25mL/cm2 , 轻柔振荡15分钟） SA-HRP孵育（,1:300稀释度,轻柔振荡15分钟） 洗膜（ 4X5分钟） 平衡（5分钟） 底物孵育(0.125mL/cm2 , 5分钟) 曝光检测（0.5－ 10分钟）
1.生物素标记和化学发光检测技术在核 1.生物素标记和化学发光检测技术在核 酸杂交和EMSA中的应用 酸杂交和EMSA中的应用 2.Western Blotting的问题与对策 Blotting的问题与对策
The world leader in serving science
Steven Product manager Apr 24 ,2007
有机合成，化学耦联，表面化学和分析化学
Product Focus： Focus：
分子生物学： 分子生物学：各种化学发光Blotting, EMSA,RPA 蛋白质组学： 蛋白质组学：蛋白抽提, 蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色 试剂和预染Markers 免疫学 ：抗体制备, 纯化，片断化, 分型和修饰
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North2South 杂交原理和操作流程
5、SuperSignal® Dura 底物在 HRP的催化下反应发光，检测
底物
HRP
4、HRP标记的链亲和素与 探针上的生物素结合
3、杂交：生物素标记的 探针与靶DNA结合 │
B
SA
B
│
2、洗膜封闭
1、DNA电泳，转膜，紫外交联固定
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Kit组成 组成
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原理
标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，在随 标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板， DNA聚合酶 DNA为模板 机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP dUTP掺入到合成的 机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP掺入到合成的 DNA探针中 产生可用于Southern Northern杂交实验的高活性生物素 探针中， Southern或 DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性生物素 标记的DNA DNA探针 标记的DNA探针 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP DNA上的生物素与HRP上的链亲和素 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP上的链亲和素 结合，HRP与 Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测 化学发光底物孵育曝光或冷光CCD 结合，HRP与Pierce 的Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测
O OH
O HN H S NH H
5
关于生物素/ 关于生物素/亲和素复合物
亲和素 亲和素Avidin 亲和素Avidin 链亲和素Streptavidin 链亲和素Streptavidin 中性亲和素NeutrAvidin 中性亲和素NeutrAvidin 单体亲和素Mono 单体亲和素Mono Avidin
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探针制备三之探针定量 探针制备三之探针定量
1. 500ul去离子水，260nm调零 2. 充分混匀2.5ul 探针和47.5ul 去离子水（即稀释20倍）分光光度计测 定OD260值 3. 定量计算公式：1 OD260 dsDNA = 50 μg/ml； 4. 样品浓度（μg/ml）=OD值X50X稀释倍数; 5. 样品浓度μg/ul= OD260值X50X20/1000 6. 样品浓度ng/ul= OD260值X50X20（注：如果稀释20倍，实际测定的 OD260值应该在0.02－0.05之间） Note:大多数情况下，由于各实验室用来测定核酸的仪器不同，检测灵 Note: 敏度不同以及样品中的一些干扰物质，测出的OD值往往是0甚至是负值 ，如果出现这种情况，再进行核酸定量没有实际价值，因此，根据经验 ，保守估计，在每次至少合成1ug探针的前提下，在杂交时，探针的用 量按照每ul含有20ng探针来使用，即每毫升杂交液加入变性的纯化过的 探针1.5-2ul.