生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用

Part of ThermoFisher Scientific
Hyclone: Cell culture Technology Pierce: Protein Chemistry Dharmacon: RNAi Technology ABgene: PCR Technology
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PIERCE:
Technical Focus:
该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成 North2South™生物素随机引物Kit(该试剂盒含有足以完成10次标记反应的试 剂，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) 化学发光检测Kit 89880可检测1080cm2的杂交膜.
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探针得率高
高产率 ：模板DNA可以少至100ng，Klenow聚合酶无核酸外切酶活， 产率提高，每次标记至少产生1-2 ug的生物素标记的探针。 使用方便：标记好的探针可以在冰箱里保存一年。
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2. 杂交和洗膜之严谨洗膜 杂交和洗膜之严谨洗膜
1. 2. 配制1X严谨洗膜缓冲液，平衡严谨洗膜缓冲液到室温（溶解充分） ，加等体积去离子水配制所需洗膜液（0.2ml/cm2膜） 将膜转移到一个新的容器中（杂交管）。加入1X严谨洗膜液10－ 20ml，旋转洗膜3次（DNA杂交55℃，RNA:RNA杂交65℃），每 次15－20分钟。
稳定 信号放大 用途广泛
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生物素/ 生物素/亲和素应用
Affinity Chromatography Cross-linking Agents Affinity targeting Protein Interaction Cytological probes Blotting Bioaffinity sensors Epitope Mapping Biotin Avidin Technology Isolation/Purification Flow cytometry Immobilizing Agents
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原理
标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，在随 标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板， DNA聚合酶 DNA为模板 机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP dUTP掺入到合成的 机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP掺入到合成的 DNA探针中 产生可用于Southern Northern杂交实验的高活性生物素 探针中， Southern或 DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性生物素 标记的DNA DNA探针 标记的DNA探针 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP DNA上的生物素与HRP上的链亲和素 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP上的链亲和素 结合，HRP与 Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测 化学发光底物孵育曝光或冷光CCD 结合，HRP与Pierce 的Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测
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探针制备三之探针定量 探针制备三之探针定量
1. 500ul去离子水，260nm调零 2. 充分混匀2.5ul 探针和47.5ul 去离子水（即稀释20倍）分光光度计测 定OD260值 3. 定量计算公式：1 OD260 dsDNA = 50 μg/ml； 4. 样品浓度（μg/ml）=OD值X50X稀释倍数; 5. 样品浓度μg/ul= OD260值X50X20/1000 6. 样品浓度ng/ul= OD260值X50X20（注：如果稀释20倍，实际测定的 OD260值应该在0.02－0.05之间） Note:大多数情况下，由于各实验室用来测定核酸的仪器不同，检测灵 Note: 敏度不同以及样品中的一些干扰物质，测出的OD值往往是0甚至是负值 ，如果出现这种情况，再进行核酸定量没有实际价值，因此，根据经验 ，保守估计，在每次至少合成1ug探针的前提下，在杂交时，探针的用 量按照每ul含有20ng探针来使用，即每毫升杂交液加入变性的纯化过的 探针1.5-2ul.
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对照DNA点杂交 对照DNA点杂交 DNA
备用试剂：0.1N NaOH 煮沸变性DNA变性成单链（ 对照DNA，5μl，250ng/μl） 准备生物素标记的对照探针或阳性样品探针（见探针标记，纯化和定量 ） 准备目标膜（注意：推荐使用带正电尼龙膜，需带无粉手套并用乙醇净 化的镊子拿膜。） • 0.1N NaOH稀释变性DNA得到1，0.5，0.25，0.125，0.0625， 0.0312，和0.015ng/μl稀释梯度。 • 在膜上平行点两点。点前最好把膜预洗一下，半干的时候点，但 干点同样有用。 • 用1X TE轻轻漂洗膜（～10秒），微波炉高火加热2分钟，紫外交 联（自动交联）或烘干固定。注：如果没有紫外交联仪，则可以 注 将膜置于80度温箱烘烤2－3小时，可达到固定目的 • 交联固定完，用0.1％SDS预湿润膜，进入下面预杂交，杂交以及 底物孵育和曝光 杂交，严谨洗膜和封闭，抗体孵育，洗膜，平衡，底物孵育以及曝光见 前所述
交联化学： 交联化学：交联剂，修饰试剂，生物素化试剂…
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1. 生物素标记和化学发光检测 技术在核酸杂交和EMSA EMSA中的应用 技术在核酸杂交和EMSA中的应用
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关于生物素
别名： Vitamin B 分子量： 244.31 水溶性好 结合对象： 亲和素Avidin 亲和素Avidin 链亲和素Streptavidin 链亲和素Streptavidin 中性亲和素NeutrAvidin 中性亲和素NeutrAvidin 单体亲和素Mono 单体亲和素Mono Avidin
有机合成，化学耦联，表面化学和分析化学
Product Focus： Focus：
分子生物学： 分子生物学：各种化学发光Blotting, EMSA,RPA 蛋白质组学： 蛋白质组学：蛋白抽提, 蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色 试剂和预染Markers 免疫学 ：抗体制备, 纯化，片断化, 分型和修饰
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3. 化学发光检测
Note1:要保证所有缓冲液充分溶解，没有颗粒 1.封闭：封闭液20ml（0.25ml/cm2膜）于37－50°振荡洗膜封闭15分钟 2.抗体孵育：20ml抗体稀释液（ 66.7ulSA-HRP＋20ml封闭液），室温孵育 15分钟 3.洗膜：20ml的1X漂洗缓冲液分别室温轻柔振荡漂洗4次，每次5分钟 4.平衡：杂交膜与30ml的底物平衡液室温轻柔振荡孵育5分钟 5.底物孵育：把湿润的膜放在一个干净的塑料盘（平皿）里，与底物工作液 在室温下孵育5分钟（推荐在暗室中）。确保膜被底物溶液完全淹没或覆 盖底物工作溶液需足够以完全覆盖杂交膜（约0.1ml/cm2）。 6.曝光：滤纸吸附多余底物，作好标记，保鲜膜包裹，确保保鲜膜和杂交膜 间无气泡和皱褶。把包好的杂交膜放在暗夹里，放上X光片，曝光1－5分 钟。曝光时间长短可以稍有变化以获得理想的信号。 7.从暗夹里取出X光片，按厂家的使用说明书显影和定影。 Note2:可与底片背景去除试剂配合使用，以获得更理想的实验结果
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North2South 杂交原理和操作流程
5、SuperSignal® Dura 底物在 HRP的催化下反应发光，检测
底物
HRP
4、HRP标记的链亲和素与 探针上的生物素结合
3、杂交：生物素标记的 探针与靶DNA结合 │
B
SA
B
│
2、洗膜封闭
1、DNA电泳，转膜，紫外交联固定
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Kit组成 组成
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1. 探针制备一之探针标记
1. 2. 3. 4. 5. 6. 将20ul生物素标记的N4-dCTP与80ul的5XdNTP混合物充分混合备用（ 总量100ul） 稀释约100ng线性探针模板至24ul于离心管中(模板DNA要定量和纯化) DNA要定量和纯化 (模板DNA要定量和纯化) 加入10ul随机引物（Heptanucleotide mix）于上述离心管中，煮沸 变性5分钟，迅速在冰水混合物退火5分钟 加入10ul N4-dCTP与5XdNTP的混合物，5ul 反应缓冲液，1ul Klenow 酶片断，混匀 37°孵育60分钟 加入2ul EDTA以灭活Klenow酶活性
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方便快速
0.5－10分钟即可检测到特异性信号 6小时的超长发光时间允许多次曝光 可以使用冷光CCD成像仪扫描成像
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操作流程与时间
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 探针标记与纯化（1小时） 预杂交（0.1mL/cm2 ,55或者65°, 0.5小时） 杂交（8－12小时） 严谨洗膜（3X15分钟,提高温度,降低离子强度） 封闭（ 0.25mL/cm2 , 轻柔振荡15分钟） SA-HRP孵育（,1:300稀释度,轻柔振荡15分钟） 洗膜（ 4X5分钟） 平衡（5分钟） 底物孵育(0.125mL/cm2 , 5分钟) 曝光检测（0.5－ 10分钟）
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检测安全
采用非同位素的化学发光系统，免除放射性的危险与处理同位素废物 的麻烦，减少环境污染；无须专门的同位素操作室，易于使用推广 anyone,anywhere and anytime
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高灵敏度与高信噪比
生物素标记的dUTP保证了与HRP标记的链亲和素（Kd=10-15M； 抗体10-5～8M ） Kd=10 15M； 抗体10 最大结合，经受最严谨的洗膜条件 优化杂交液和封闭液保证了探针与靶DNA的完美结合 Dura （10-14克）底物保证了保证了高于地高辛（DIG）-AP标记系统，等同 于或者超过同位素的检测灵敏度
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来自百度文库
2. 杂交和洗膜之杂交
1. 平衡杂交液到室温 2. 预杂交:将转好的膜置于杂交管，点样面朝上，确保膜被杂交缓冲液均 匀覆盖，杂交炉要缓慢转动以保证杂交液与膜能充分接触，（每平方 厘米膜至少0.1ml杂交液。除了RNA:RNA杂交用65℃外，其他的都用 55℃）,50-100rpm旋转，至少30分钟。 3. 热变性探针：煮沸变性10分钟，迅速在冰/盐水混合物退火5-10分钟 4. 杂交：加入已经变性的DNA探针于杂交液，充分混匀（探针加入到杂交 液，不要加到膜上，要轻轻晃动，使探针均匀分散在杂交液中），探 针浓度约30ng/ml杂交液, 50-100rpm旋转，孵育过夜。
Biotin: Avidin 体系的优点： 体系的优点：
生物素/ 生物素/亲和素复合物
其中与前三者的结合解离系数为 Ka = 1015 M-1.具有极高的结合能力，只有8M 1.具有极高的结合能力，只有8M 的盐酸胍在PH1.5的极端条件下或在SDS 的盐酸胍在PH1.5的极端条件下或在SDS 煮沸才可以将其破坏解离， 而2mM生物素即可将单体亲和素与生物素 2mM生物素即可将单体亲和素与生物素 标记的生物大分子置换解离。
1.生物素标记和化学发光检测技术在核 1.生物素标记和化学发光检测技术在核 酸杂交和EMSA中的应用 酸杂交和EMSA中的应用 2.Western Blotting的问题与对策 Blotting的问题与对策
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Steven Product manager Apr 24 ,2007
Affinity cytochemistry
Localization studies Signal Amplification Diagnostics Histochemistry
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1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应 1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应 用
“Everything is possible - with the right tools”
O OH
O HN H S NH H
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关于生物素/ 关于生物素/亲和素复合物
亲和素 亲和素Avidin 亲和素Avidin 链亲和素Streptavidin 链亲和素Streptavidin 中性亲和素NeutrAvidin 中性亲和素NeutrAvidin 单体亲和素Mono 单体亲和素Mono Avidin
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2. 探针制备二之探针纯化 探针制备二之探针纯化
1. 2. 3. 4. 5. 6. 加入5ul醋酸铵于上述50ul反应离心管，吹打混匀 加入110 ul 冰预冷的无水乙醇，充分混匀，冰或－70°放置15分钟 12000rpm 4°离心15分钟 观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀 用冰预冷的70％乙醇洗涤一次，12000rpm 4°离心15分钟，观察沉 淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀 50ulTE或RNA酶free 的水溶解沉淀（－20℃或－70℃长期保存）