纳豆芽孢杆菌复壮

纳豆芽孢杆菌复壮及相关实验结题报告
08级生物工程2班解制怡
摘要
在前一阶段，我们从食品“丑女人纳豆中”提取出了纳豆芽孢杆菌，并进行了单菌落的分离和菌种保藏。

由于保藏期限已到，需进行菌种复壮。

为此，我们对纳豆芽孢杆菌进行了菌种复壮、单菌落的分离和斜面保藏，并对该过程中产生的杂菌进行菌种纯化，获得了其相应的单菌落并进行了斜面保藏，建立了菌种档案。

本期成果：我们完成了纳豆芽孢杆菌复壮及单菌落的分离，另外共分离了15种菌株，其中细菌4种，霉菌11种。

关键词:纳豆芽孢杆菌；分离纯化；保藏；革兰氏染色；菌种档案
第一章绪论
1.1纳豆芽孢杆菌
纳豆菌通常为（0.7-0.8）um×(2.0-3.0)um,革兰氏阳性。

生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。

芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。

生长温度最高位45-55℃，最低为5-20℃。

孢子耐热性强。

孢子型纳豆菌是具有耐酸、耐热特性的有益菌,在胃酸下四小时存活率为100%,同时具有强力的病原菌抑制能力,是各种益菌当中,对环境耐受力最好可以直达小肠的菌种之一，口服后可改变人体肠道菌丛生态,帮助消化道机能正常化,以使排便顺畅,维持体内生理环境；可以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫放应；并能生成多种蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料种某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率。

1.2纳豆生产的改善以及纳豆对人体的好处
芽孢杆菌属纳豆芽孢杆菌种（natto）从纳芽豆制品中或从自然界的稻、谷上面分离得到。

日本传统的做法是把煮熟的大豆装在用稻草做成的器皿里，利用稻草上附着的纳豆菌自然发酵而做成的。

用这种方法做成的纳豆中，除了纳豆菌以外，还含有其他杂菌，不仅卫生不过关，而且质量也不好。

1921年半泽博士培养分离出了纯纳豆菌，使纳豆菌商品化了。

利用纳豆菌可以制造纳豆。

因纳豆菌是嗜氧菌,接触空气是很重要的。

纳豆菌在通过吞噬大豆蛋白来繁殖的时候,产生出的无数酵素纳豆激酶和维生素K,具有神奇的药效,可以治疗三高（高血糖，高血压，高血脂）和溶解血栓的作用，而且还能产生出氨基酸的美味。

1.3菌种复壮常用的方式
1.3.1纯种分离法
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。

常用的分离纯化的方法可归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的。

例如采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法
获得单菌落。

另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法。

它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水平。

后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。

对于不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管截取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。

1.3.2宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。

例如，苏云金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。

如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。

根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。

1.3.3淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。

如有人曾将“5406”的分生孢子在低温(－10～30℃)下处理5～7d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。

1.3.4遗传育种法
即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。

第二章实验材料与方法
2.1导言
前一阶段，我们做了纳豆芽孢杆菌的单菌落分离，并保存了菌种，由于保藏时间过长，最近一个月我们进行了纳豆芽孢杆菌的复壮实验，采取纯种分离法进行菌种复壮,同时，对于在分离过程中出现的杂菌进行了分离与保藏，并建立了菌种档案。

2.2材料
2.2.1原料
斜面保藏的纳豆芽孢杆菌菌种
2.2.2试剂
牛肉膏，蛋白胨，NaCl，马铃薯，蔗糖，琼脂，结晶紫、碘液、75%和95%乙醇、番红液、香柏油、二甲苯。

2.2.3主要仪器和设备
ZDX-35RI型坐式自动电热压力蒸汽灭菌器、DNP-9162电热恒温培养箱、SR-1607F电加热板、RD23B-C电脑烧烤微波炉、AIR-TECH超净工作台、Haier冰箱、1／1000g 电子天平、涂布器、移液枪、接种环等。

2.3实验方法
2.3.1培养基的制备
2.3.1.1牛肉膏培养基
牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20g，加蒸馏水至1000 mL，pH 7.0,121
℃高压蒸汽灭菌20 min，将平板倒出。

2.3.1.2PDA培养基
土豆200g，蔗糖20g，琼脂20g，加蒸馏水至1000 mL，121℃高压蒸汽灭菌20 min，将平板倒出。

2.3.2纳豆芽孢杆菌的分离
2.3.2.1将移液枪头，涂布棒以及七根试管（一只10ml无菌水，其余装9ml）在试管中
取少量菌种放入10ml无菌水，记为1号，然后按梯度稀释到，依次编号2、4、5、
6；
2.3.2.2 在（-4）-（-6）中各取100ul菌液，进行涂布，涂布时注意：观察结果时发现，
细菌菌落分布过密，不利于观察和分离单菌落。

因此，涂布时挑取细菌药适量，并且要多
设几个梯度，以便得到理想的菌落分布。

涂布操作时，细菌容易分布不均。

因此，涂布的
时候一定要将菌液涂均匀，多涂几次；
2.3.2.3 经常观察，做好实验记录；
2.3.2.4.如有杂菌，再进行下一步涂布分离；
2.3.3杂菌的分离
2.3.3.1 对涂布分离得到的培养皿进行培养，对于在培养过程中出现的杂菌进第一次划线分离：
移近火焰处，左手拿平皿，右手拿接种环，挑取经稀释10倍的菌液在平板上划线(图Ⅴ-3)。

划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。

常用的划线方法有下列二种：
对于新出现的杂菌菌进行划线分离，对于划线后没有杂菌的培养皿，进行单菌落分离，细菌采取涂布分离法，霉菌采取点解分离法，接种时注意：点接分离时，容易接多或者没接上。

接多了不易形成单菌落需要多次重复接种，这既造成了实验材料的严重浪费又消耗了大量时间。

2.4菌种保藏（斜面法）
1. 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上；
2. 待菌充分生长，记录现象；
3. 棉塞部分用油纸或报纸包扎好，移至4℃的冰箱中保藏。

保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。

酵母菌2个月，细菌最好每月移种一次。

菌种保藏要注意：斜面制作时，倒入试管的五分之一培养基，灭完菌后，放置斜面，最好到试管的二分之一。

长出菌后，放入冰箱保存。

2.5革兰氏染色
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色1分钟后水洗，然后加革兰碘液媒染一分钟后用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复染。

染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G﹢）。

被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（Gˉ）。

具体操作方法是：
涂片固定→草酸铵结晶紫染2min→自来水冲洗→加碘液覆盖涂面染3min→水洗，用吸水纸吸去水分→加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色→20秒后水洗，吸去水分→蕃红染液染2min→自来水冲洗→干燥，镜检
革兰氏染色应注意：
脱色时间过长或者不足，容易导致最后结果错误。

时间过长可能导致假阴性，过短可能导致假阳性。

水洗时，水流不可正对着菌种进行冲洗，以免将菌种冲掉。

显微镜下发现一些载玻片有划痕，所以，以后在擦载玻片时动作要轻。

第三章实验结果与总结
在这一阶段实验中,我们的实验动手能力又有了一定的提高，对于菌种分离的方法有了进一步的提高，对于出现的问题,我们必须全力以赴的去改正，进一步规范超净工作台中的实验操作。

经过这一阶段的锻炼，我们对于实验的规范操作有了进一步的认识，提高了动手能力，为下一阶段实验的成功进行提供了必要条件。

总之，我们完成了纳豆芽孢杆菌复壮及单菌落的分离，另外共分离了15种菌株，其中细菌4种，霉菌11种。

以下是我们的一部分成果：。