分子信标技术

影响分子信标的因素
• 荧光—猝灭基团间的距离的影响：
E：FRET效率 R：荧光给体与受体之间的距离
• 环境pH值的影响：pH过高时，茎干区碱基对 之间的稳定结合被破坏，分子信标变性，荧光 基团与猝灭基团分开产生荧光。
影响分子信标的因素
• 温度对分子信标的影响
分子信标设计原理
1、序列长度（环状序列比茎杆序列长两倍以上， 茎杆序列不能过长或过短） 2、茎杆序列中G和C的含量不能太高 3、5’-端的第一个碱基最好不要选择G 4、由于被测对象DNA或RNA是大分子，存在扭 曲现象，因此要选择被测对象的外围碱基序列， 即容易接近的那段序列来设计信标。
分子信标技术
分子信标简介 分子信标的结构 分子信标的工作原理 分子信标的应用 前景与展望
分子信标简介
Tyagi和Krammer于1996年首次建立，目的是 在液相中定量测定靶标序列。
基于荧光共振能量转移（FRET）设计的一种新 型荧光标记核酸探针；
特殊的发夹结构使得其具有背景信号低、灵敏度 高、特异性识别性强的特点；
PNA与双链DNA互补链结合时可以取代非互补链,使之解 链以单链的形式存在,形成P-环结构。特定序列的DNA或 PNA分子信标可以与双链DNA的 变性部分结合,分别形成PD或PP-环型化合物,分子信标 结构被破坏,出现荧光响应。 最近的实验结果表明,利用 茎-环结构的DNA分子信标 或无茎的PNA分子信标可 以实时检测PNA与双链DNA 的结合位点
2、苯甲酸6-荧光素和DABCYL ；
3、荧光素和罗丹明、荧光素和芘丁酸 、香豆素和乙锭 荧光素和伊红 、一些铽螯合物和四甲罗丹明等。
波长转移分子信标
优点： 如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射 波长的荧光发射基团，就可在同一激发光下，通过检测这些 特征波长的荧光强度， 实现在同一体系中的多基因分析。
广泛应用于分子生物学、生物技术、生化分析， 生物医学研究和临床诊断 。
分子信标的结构
经典分子信标结构包括：
1、环状区（长度15～30个碱基的序列， 能与目标分子特异结合）；
2、信标茎杆区（长度为5～8个碱基的互 补序列，使得形成发夹结构）；
3、5’端荧光基团（徳克萨斯红、荧光素 等染料）；
4、3’端猝灭基团（DABCYL ）。
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应用3、同时检测多个靶核苷酸
通过选择不同的荧光分子-猝灭分子对，可以设 计出不同荧光的多个分子信标(又称多色分子标)， 每个分子信标与其各自的靶标序列杂交后， 荧光检 测系统可以检测到不同颜色的荧光， 这样多色分子 信标可对多个靶核苷酸同时定量测定。另外，波长 转移分子信标同样可以用于核酸的多组分同时定量 测定。
应用1、实时定量PCR测定靶标浓度
将分子信标简单地密封在PCR 管中，在每个循环的退火阶段分子信标与 扩增产物结合产生荧光，未结合的分子信标不发荧光，这样荧光信号随 着反应循环的增加而增强，从而反映出PCR 过程中扩增产物浓度的增加。 由于加有分子信标的PCR 管在整个反应中是密封的，因此可避免传统 PCR后扩增产物凝胶电泳过程带来的污染，简化检测手段，检测灵敏度 高。
波长转移分子信标
表面固定分子信标
量子点分子信标
分子信标的应用
• 核酸的检测分析 1.实时定量PCR测定靶标浓度 2.活体内核酸的动态检测 3.同时检测多个靶核苷酸 4.检测双链DNA
分子信标的应用
• 研究DNA—蛋白质的相互作用 用于核酸酶的研究 用于研究DNA——蛋白质的相互作用
• 用作生物芯片和生物传感器
relatively large suggesting association or clustering of multiple telomeres.
分子信标的应用
Whitcombe设计的一种 将ＰＣＲ引物与分子信标 相结合的蝎状引物荧光探 针。在该探针中,ＰＣＲ引 物与分子信标之间有一间 隔臂,使ＰＣＲ反应不能往 分子信标方向延伸。在Ｐ ＣＲ过程中,非特异扩增产 物不会产生荧光信号,而当 特异性扩增产物生成时,分 子信标将立即与其进行分 子内杂交,同时发出荧光信 号。
应用4、用于核酸酶的研究
应用4、用于核酸酶的研究
应用5、用于研究DNA-蛋白质的相互作 用
DNA 和蛋白质的相互作用的研究是目前分子生物学和 生物技术研究中非常重要并迅速发展的领域。将分子信标 用于DNA -蛋白质相互作用的研究， 发挥了其简单、灵 敏等特点， 又实现了对体系的实时监测， 甚至可以用于 活体细胞的动态研究。
分子信标的应用
Human osteosarcoma cell nucleus (U2OS cell line) vitally injected with a Cy3-labelled probe specific for chromosomal telomeric repeat sequenes. Note that some spots are
分子信标技术常用的荧光剂-淬灭剂
荧光猝灭依赖的是能量共振转移，而转移的效率与荧光 基团发射光谱同猝灭基团激发光谱的完全重叠有关。为了荧 光能有效猝灭，荧光基团的发射光谱应完全覆盖猝灭基团激 发光谱。符合此要求且较常用的荧光剂-淬灭剂有： 1、EDANS（5′- (2′-氨乙基氨基奈-1-磺酸)和DABCYL （4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯)；
应用2、活体内核酸的动态检测
Perlette 利用微注射法在袋鼠肾细胞质中引入分子信标，对单个活细胞中的 RNA 进行了检测，并利用ICCD 成像系统得到了一系列反应分子信标与
RNA 结合的荧光图像。结果表明，利用分子信标可以有效地实时检测活细 胞中的RNA 及研究RNA/ DNA 的杂交过程。
分子信标的应用-双链DNA检测
环状区
猝灭基团
茎杆区
首例分子信标结构示意图
荧光基团
分子信标工作原理
无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近，发生 FRET，荧光猝灭，荧光背景极低。
加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳定 的双链杂交体，使得荧光基团和猝灭基团距离增大，阻止了FRET的发 生，荧光恢复。