分子信标：新型核酸分子探针要点

分子信标：新型核酸分子探针

摘要：

分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。本文介绍了分子信标的作用原理，不同的分子信标类型以及应用，最后对前景作出了预测。

关键词：分子信标荧光探针灵敏度选择性活体检测

引言：

从20世纪60年代初至今，分子信标（Molecular beacon,MB）已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域【1,2,3,4】。近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究【5,7,12】。为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。

自从1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。在它出色地完成了液相靶标测定(实时PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、活体分析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中【8,9,10,11】。又由于易于对其进行修饰和改性，在这十来年的发展中，人们在经典分子信标模型的基础上，设计出了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA【13】链代替ssDNA形成的PNA分子信标，以及LNA分子信标等。这些新型的分子信标是为了满足不同的需要而设计的，特异性更强，稳定性更好，为许多新的研究领域提供了一个平台。为了满足基因组学和蛋白质组学的发展，对分子信标的固定化也成了必然的发展趋势，自从谭蔚泓【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来，固定化分子信标也迅速发展起来。尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的强摩尔消光系数进行淬灭，简化了分子信标的设计，更加方便对其进行操作，大大促进了基因微阵列技术的发展。

1 分子信标的结构和作用原理

分子信标的结构(图1)：分子信标是一种设计巧妙的荧光探针。常规的分子信标是由一段包含了茎一环结构的单链寡聚核苷酸组成，形成一个发夹型结构。在其环状部分，一般是一段长度为15—30碱基的序列，能与目标分子特异结合，茎区是长度为5—8碱基的互补序列，茎区的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团。为了保证分子信标的灵敏度和热力学稳定性，在其茎干区设计的碱基数目一般为其环区的一半。过长，则灵敏度下降；过短，则稳定性下降。由于分子信标杂交前后环状区与目标分子的双链结构之间存在热力学平衡关系，使它的杂交特异性明显高于常规的线状探针。

近来，Dubertret等【17】用金纳米粒子簇代替DABcYL做淬灭剂，可以通过调节金纳米簇的形状、大小和组成而得到不同的淬灭剂。由于金纳米簇对荧光试剂有着更高的淬灭效率，所以用金纳米粒子代替DABcYL后，大大提高了分子信标的灵敏度和特异性。其它的淬灭基团还有铜离子螯合物【18】、超分子淬灭剂【19】以及直接利用碱基【20】本身做淬灭剂等。

图1 典型分子信标结构

另一种结构的分子信标是无茎分子信标。与经典分子信标结构类似，无茎分子信标只是不再含有双链结构的茎杆区，只含有单链的环状结构，具有很好的柔韧性。目前的无茎分子信标有PNA【21,22,23】和DNA【24,25,26】两种，自由状态时，由于荧光分子与淬灭分子之间的疏水作用使得无茎分子信标近似于一个闭环结构。当分子信标与靶序列结合后，探针与靶标形成的双链由于具有刚性使得荧光分子与淬灭分子分开，荧光恢复。无茎分子信标与标准分子信标相比，由于其柔韧性增加，所以在体系中检测时，对靶标的响应加快，特异性也增强，又因为其不需要茎的结构，在设计和合成上相对简单，成本降低。但其结构上缺少了茎区，稳定性有所下降，背景荧光相对增强。

分子信标作用原理：在自由状态下，分子信标以发夹结构存在，茎区的碱基互补配对，使连接在探针的5’端荧光基团及3’端的淬灭基团相互接近(约为7—10 nm)。当一定波长的激发光照射时，荧光分子和淬灭分子之间发生荧光共振能量转移。荧光基团受激所产生的荧光被淬灭基团吸收，并以热量的形式散发，荧光几乎完全淬灭，此时荧光背景极低(如图2)。加入与环状区互补的靶核苷酸序列后，分子信标可与之形成相对刚性并且更加稳定的双链体，使茎干区的互补链被拉开，从而使得荧光基团与淬灭基团分开，空间距离增大，根据Forster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。杂交后，分子信标的荧光几乎完全恢复。并且荧光强度与溶液中靶标序列的量成正比，所以可以用来作定量分析。

图2. 分子信标作用原理

2 分子信标的类型

2.1 双重荧光共振能量转移(FRET)分子信标

双重荧光共振能量转移(FRET)(图3)分子信标【27】是指在一个体系中同时设计了两种分子信标，只有通过这两种分子信标的相互作用才能实现检测。其中一个分子信标包含一个荧光给体基团和一个淬灭基团，另一个分子信标包含一个荧光受体基团和一个淬灭基团。在自由状态时，荧光给体基团和荧光受体基团都处于荧光淬灭状态，当在体系中加入目标分子时，这一对分子信标同时打开，荧光给体基团与荧光受体基团头对头地与目标分子特异性结合，此时，两基团彼此挨得很近(<6 nm)，发生荧光共振能量转移，给体分子将能量传递给受体分子，受体分子获得能量发出特征荧光。通常用来做荧光给体的是镧系元素螯合物，有机荧光团作为荧光受体。因为镧系元素螯合物的荧光发光寿命很长(约1 ms)，发出的光的带分布很窄，在某一些波长区域，几乎不发荧光，而且还能有效地降低荧光受体基团、实验中干扰物以及池子自身的荧光，使得在某一些波长区域的背景荧光几乎接近零，大大地提高了信噪比，从而提高了检测的灵敏度，所以很适合于作为荧光给体材料。因为常规的分子信标用于活体检测时，由于细胞内的环境比较复杂，如可能被细胞内的核酸酶降解或非特异性地与核酸结合蛋白结合，而导致假阳性信号。但采用这种双重荧光共振能量转移(FRET)分子信标，因为只有当荧光给体基团与荧光受体基团同时发生杂交时，才能发出受体基团的特征荧光，所以能大大地减小假阳性信号。与以前的双线型探针相比，采用这种方法能显著地降低由于光谱重叠而产生的高背景信号，提高检测灵敏度，还能区分单碱基多态性【28,29】。因此，这种分子信标将会成为基因表达实时监测，活体细胞定量检测的有力工具【30,31】。