分子信标：新型核酸分子探针要点
新型核酸分子荧光探针——分子信标的原理及应用
新型核酸分子荧光探针——分子信标的原理及应用分子信标(molecular beacon)是一种具有发夹结构的新型荧光标记核酸探针，具有高灵敏度、高特异型，其在聚合酶链反应（PCR）、核酸序列的分析、活细胞内核酸的动态检测、蛋白质(酶)与核酸的相互作用等方面具有广泛的应用。
分子信标的结构分子信标的结构一般包括三个部分：环状区、信标茎干区、荧光基团和猝灭基团。
荧光基团一般联接在信标分子的5 端；猝灭基团联接在3’端。
分子信标中常用4—(4’—二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作为猝灭基团，德克萨斯红(TexasRed)、荧光素(Fluoresein)等作为荧光基团。
分子信标的原理：自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子距离增大，荧光恢复。
分子信标通常都是修饰一个单一的发光基团。
在一个均相体系中，通过杂交后荧光信号的变化，一种分子信标即可检测一种靶序列。
为了实现在一个均相体系中同时检测多种靶序列的目的，可将不同的分子信标修饰以不同的荧光基团。
分子信标的应用：分子信标技术以其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定、甚至可以用于活体分析等特点不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色。
近来,人们通过改变经典分子信标的结构，设计出许多新型的分子信标，如用ssDNA链做环、用RNA-DNA双链做茎的RNA-DNA嵌合型分子信标，用PNA链代替ssDNA形成的PNA分子信标等。
新型分子信标的出现为分子信标的进一步应用拓宽了领域。
1核酸检测分析分子信标用于核酸检测分析体现在几个方面：实时定量PCR测定靶标的浓度，基因的点突变、SNP(单碱基多态性)、等位基因、多组份同时测定，活体内核酸的动态检测，等。
与常规核酸检测方法相比，分子信标用于核酸检测具有如下特点：a 可以进行液相杂交检测：常规核酸检测方法主要为固相杂交，要把未结合的探针和引物分离后才能利用其他信号对靶核酸进行检测；分子信标可以直接加入核酸扩增体系进行检测，检测方法可以直接在紫外灯下或借助荧光光谱仪进行定量检测。
分子信标工作原理
分子信标工作原理
分子信标（Molecular Beacon）是一种在体外核酸检测技术中广泛使用的荧光探针，它的设计巧妙，能够实现对靶核酸序列的特异性识别和实时定量分析。
其工作原理如下：
1. 结构特性：
分子信标通常由一个寡核苷酸链组成，该链两端分别标记有一个荧光基团（如FAM、Cy3或TAMRA 等）和一个淬灭基团（如DABCYL、BHQ等）。
中间是与目标核酸互补的探针序列，通过设计使得探针自身可以形成一个稳定的发夹结构。
2. 无信号状态：
在未与目标核酸结合时，分子信标的荧光基团和淬灭基团由于空间上的临近效应而发生能量转移（如荧光共振能量转移，FRET），导致荧光基团发射的荧光被淬灭基团吸收并转换为非荧光形式的能量，因此此时分子信标没有明显的荧光信号输出。
3. 结合与信号生成：
当存在目标核酸时，分子信标与其完全互补配对，导致原本的发夹结构打开，荧光基团和淬灭基团之间的距离增大，FRET效率显著降低，荧光基团不再受到有效淬灭，从而恢复其发出荧光的能力。
因此，荧光强度的增加反映了目标核酸的存在及其浓度。
4. 实时定量分析：
因此，通过对荧光信号的实时监测，可以定量测定样品中特定核酸序列的含量，常用于基因表达分析、突变检测以及病原体检测等领域。
这种基于结构变化引起荧光信号改变的设计大大提高了检测的特异性和灵敏度。
分子信标pcr -回复
分子信标pcr -回复分子信标PCR（Molecular Beacon PCR）是一种高度灵敏和特异的聚合酶链式反应（PCR）技术，可以检测并定量分析目标DNA或RNA序列。
通过结合引物和探针，该技术能够提供无需分离产品的实时监测，具有广泛的应用领域，包括疾病诊断、药物筛选和基因表达分析等。
本文将一步一步介绍分子信标PCR的原理、步骤和应用。
一、原理分子信标PCR利用了专门设计的双链DNA探针作为信标，并在特定条件下形成环状结构。
该探针具有一个报告器荧光分子和一个阻断器荧光分子，两者之间由一个可被扩增的目标DNA或RNA序列分隔。
在PCR过程中，引物将与目标序列结合并被延伸，形成一个扩增产物，也就是在目标序列和信标之间形成一个完整的双链DNA。
扩增过程中，探针的报告器与阻断器之间的距离被拉伸，导致荧光分子之间的能量传递被阻断。
然而，当PCR过程中的温度升高至探针和目标序列互补的温度时，探针会与目标序列解离，并与其形成比较稳定的双链结构。
这种解离使探针上的报告器和阻断器分子之间的距离缩短，从而使能量传递重新发生。
当能量传递发生时，报告器荧光分子的荧光信号被激活，从而产生荧光信号。
二、步骤1. DNA或RNA提取：从样品中提取目标DNA或RNA序列，例如通过酚／氯仿分离法或商业提取试剂盒。
2. 引物设计：设计引物，以使其与目标序列的两端互补，并控制目标序列的扩增精确性和特异性。
3. 分子信标探针设计：设计双链DNA探针，包含报告器和阻断器荧光分子，在目标序列之间形成环状结构。
4. PCR反应：进行PCR反应，将样品中的目标序列与引物结合，并通过PCR循环扩增目标序列。
5. 实时检测：在PCR反应过程中，使用实时荧光PCR仪来监测报告器荧光信号的强度，以反映目标序列的存在和扩增情况。
6. 数据分析：根据实时PCR仪输出的荧光信号曲线，可以计算出目标序列的相对拷贝数或表达量。
三、应用分子信标PCR在许多领域都有广泛的应用。
分子信标的研究及应用
分子信标的研究及应用90413118 马晓雯90413129 李艳丽90413130 鲁涛90413123 蒋昱萌【关键词】：分子信标分子信标原理生物传感器分子信标应用：实时荧光PCR【摘要】：分子信标是一种基于荧光共振能量转移原理设计的一种新型核酸荧光探针，其与靶序列结合会发生结构的变化从而影响荧光信号。
因其检测具有高灵敏、高特异性，并且可用于活体的实时检测，因而被广泛的应用于生化分析，生物医学等很多领域。
本文主要就分子信标的工作原理和应用进行介绍。
1、引言分子信标是一种可以特异识别核酸序列的新型荧光探针，这种荧光探针是通过与核酸靶分子进行杂交后构象发生变化而发出荧光的。
这项技术是Sanjay Tyagi于1996年首次发明的[1]，因其具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别性强、操作简单以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点,在短短的几年内得到了迅速的发展,并已广泛地应用于实时监测聚合酶链反应、基因突变的快速分析、ＤＮＡ、ＲＮＡ的检测、ＤＮＡ/ＲＮＡ杂交的动力学研究以及ＤＮＡ/蛋白质相互作用研究等,其应用领域仍在不断拓展。
2、原理2．1分子信标的结构分子信标属于单链寡核苷酸探针,其巧妙之处在于独特的茎环状结构(也称发夹型)。
分子信标的设计一般包括三个部分:(1)环状区：一般为长度为15～30个碱基的序列,其通过与待测核酸链互补结合,从而与目标分子特异结合;(2)茎干区：通常为长度为5～8个碱基的互补序列,茎干区与杂交后环状区-目标分子的双链结构之间的热力学平衡关系,使分子信标的杂交特异性明显高于常规的线状探针;(3)荧光基团和猝灭基团：荧光基团一般联接在信标分子的5’-端;猝灭基团联接在3’-端。
常用4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作为猝灭基团,德克萨斯红(TexasRed)、荧光素(Fluoresein)等作为荧光基团。
（图1为经典分子信标结构）[10]2．2工作原理当靶序列不存在时,分子信标茎干区特异结合形成发夹结构,茎部的荧光分子与淬灭分子非常接近(7～10ｎｍ), 当受到激发光激发时, 荧光基团发出荧光;由于淬灭分子吸收光谱与荧光基团的荧光发射光谱重叠,因此可发生荧光共振能量转移（FRET）[2],即荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发,此时荧光背景极低检测不到荧光信号;当有靶序列存在时,分子信标的环序列与互补靶序列特异性结合, 形成相对刚性并且更加稳定的异源双链杂交体，此时荧光分子与淬灭分子分开,二者之间的空间距离增大, 根据Foerster理论, 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，所以荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收,荧光几乎100%恢复，从而可检测到荧光。
新型核酸荧光探针的开发及其应用研究
新型核酸荧光探针的开发及其应用研究核酸荧光探针是一种用于检测和分析核酸序列的分子探针。
近年来，随着生命科学和医学领域的发展，核酸荧光探针研究日益深入。
在这其中，新型核酸荧光探针的开发及其应用研究引起人们的重视。
一、新型核酸荧光探针的研究背景核酸荧光探针是指利用荧光信号来监测核酸分子特定区域的分子探针。
一直以来，核酸荧光探针在基因检测、疾病诊断和药物研发等领域有着广泛的应用前景。
随着科学技术水平的日益提高，科学家们不断地对核酸荧光探针进行改进和创新，从而发展出了多种新型核酸荧光探针。
二、新型核酸荧光探针的种类及特点1. FRET探针FRET（Förster Resonance Energy Transfer）探针是利用荧光共振能量转移原理（FRET）来探测核酸序列的一种探针。
这种探针的特点是通过荧光共振能量转移来传递信息，准确性高。
因此，FRET探针常用于检测双链DNA或RNA分子。
2. MGB探针MGB（Minor Groove Binder）探针是一种基于小的缺口结合团的核酸荧光探针。
这种探针具有以下特点：能够与一般荧光染料一起使用；缺口结合团的亲和力较强；不易被核酸酶消化；能够进行快速的下游扩增；适用于高信噪比和低讯息误差度的检测等。
3. DNAzyme探针DNAzyme探针是一种基于DNA酶的核酸荧光探针。
它由核酸酶和基于DNA序列的探针分子构成。
这种探针具有以下特点：具有较高的特异性和灵敏性；能够针对单一的核酸序列进行检测；能够灵活且快速地被设计和制造。
三、新型核酸荧光探针的应用研究利用新型核酸荧光探针可以进行病毒、基因、蛋白质等的检测。
如针对SARS-CoV-2病毒的检测，科学家们可以通过新型核酸荧光探针来检测和分析病毒基因组序列。
此外，新型核酸荧光探针还可以应用于基因工程、质量控制、环境监测和食品安全等领域。
相信在未来，新型核酸荧光探针会在更多领域得到应用。
结论总之，新型核酸荧光探针的开发及其应用研究具有重要的科学意义和应用价值。
第6章 核酸分子探针
第六章基于分子工程的核酸分子探针生命的本质是一系列可自主调控的化学、物理过程，但主角不是简单的化合物而是复杂的生物大分子。
核酸与蛋白质是生命发生、发展和繁衍中最重要的两类物质，正是它们之间复杂、精巧而协调的相互作用演绎出神奇、千变万化、令人叹为观止的生命现象。
因此，在分子水平上研究核酸、蛋白质等生物大分子及其相互作用是我们深入理解生命现象、揭示生命奥秘最为关键的内容之一。
红细胞:6,000-9, 000nm白细胞:10,000nm一般细菌: 1,000 –10,000 nm 一般病毒:75 –100 nm 蛋白质5 –50 nm DNA (双链宽) 2 nm研究人员需要一些合适的分析工具和手段，在分子水平上，最好是在活体内，将生物分子的成分、结构、相互作用等信息转变为易于检测的光、电信号变化，非常灵敏、准确地反映出来。
以体系的功能为导向，在分子水平上设计所需结构，并定向合成功能分子，是分子工程的重要特征。
通过在分子水平上研究生物分子间的相互作用，设计、合成和筛选具有特定功能的分子探针并发展其生物医学应用，是分子工程的前沿研究领域之一。
核酸分子探针是一种重要的分子生物学研究手段。
它非常巧妙地利用了核酸的结构及其识别能力上的特点，例如核酸的杂交、立体构象转变、与蛋白质、寡聚高分子甚至金属离子的特异性结合等，结合分子水平的信号传导机制，将相关的生命信息转变为易于检测的信号，例如拉曼、荧光、化学发光、电流、放射性等。
随着其他相关学科如化学、材料科学的发展，核酸分子探针的合成、标记和检测技术取得了长足的进展，已经能在单个活细胞，甚至单分子水平上观测分子的行为。
与荧光蛋白技术相比，核酸分子探针一般不需要对目标细胞预先进行基因操作，不仅更能反映生命活动的真实状况，而且也便于直接研究临床样品。
分子信标用于果蝇卵母细胞内mRNA 成像PNAS,2003, 100, 13308 核酸适体用于肿瘤细胞的识别PNAS , 2006, 113, 11838核酸分子探针的进展，已经能在单个活细胞，甚至单分子水平上观测分子的行为，为细胞信号转导的活体、实时、在线研究提供了条件。
核酸探针技术的原理和应用
核酸探针技术的原理和应用引言核酸探针技术是一种重要的分子生物学工具，通过利用特异性的核酸序列与待测样品中的目标序列进行特异性配对，从而实现对目标序列的检测和定量分析。
本文将介绍核酸探针技术的原理以及其在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用。
一、核酸探针技术的原理核酸探针技术利用两条互补的核酸分子之间的碱基配对原理，通过标记的核酸序列与待测样品中的特定目标序列进行靶向配对。
该技术的原理主要包括以下几个方面：1.互补配对：核酸分子由四种碱基（腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们之间可以通过碱基配对形成双链结构。
腺嘌呤与胸腺嘧啶之间形成两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间形成三个氢键。
根据这种碱基配对原理，核酸探针可以与目标序列中的特定碱基序列进行互补配对。
2.标记物：核酸探针常常需要进行标记以便于检测。
常用的标记物包括荧光染料、放射性同位素、酶和磁珠等。
标记物的选择取决于具体的实验需求和检测方法。
3.检测方法：核酸探针技术可以通过不同的检测方法进行信号的读取和分析。
常见的检测方法包括荧光检测、放射性测量、酶促反应和磁性检测等。
这些方法可以实现对标记物信号的定量分析和可视化显示。
二、核酸探针技术的应用核酸探针技术具有高灵敏度、高特异性和高选择性的优势，被广泛应用于各个领域。
以下是核酸探针技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域的应用：1.基因表达分析：核酸探针技术可用于研究基因的表达模式、调控机制和功能。
通过对目标基因的探针设计和合成，可以检测该基因在不同组织、细胞或条件下的表达水平。
2.病毒检测：核酸探针技术在病毒检测中具有重要意义。
例如，针对新型冠状病毒（COVID-19）的核酸探针被广泛应用于病毒的快速检测和筛查。
3.癌症诊断：核酸探针技术可用于癌症诊断和预后评估。
通过检测肿瘤标志物的核酸序列，可以快速、准确地判断患者是否患有癌症，以及癌症的类型和分级。
4.药物研发：核酸探针技术在新药研发中发挥重要作用。
分子信标技术
分子信标的原理、应用及其研究进展翟士桢（基础医学院生物物理学系）摘要分子信标技术是一种基于荧光共振能量转移现象（FRET）和碱基互补配对原则建立起来的一种分析技术。
分子信标作为一种荧光标记的分子探针，具有极强的特异性和较高的灵敏度，目前已经成为基础医学和生物学的重要研究工具。
本文着重介绍了分子信标的基本原理及其应用，并对其近年来的研究进展做以简单介绍。
1 引言在基因时代和蛋白质时代，人们迫切需要一种具有高灵敏度和高亲和力的生物分子探针，用以进行定性和定量检测。
1996年Tyagi和Kramer首先建立了分子信标技术，很快这种技术就广泛的应用于医学、生物学、分子生物学、临床医学和化学等诸多领域。
分子信标技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析。
在临床诊断、基因检测等领域，分子信标也越来越显示出它的优势。
近年来，人们对分子信标的结构作了诸多改进，发展出很多具有更多特性的新型分子信标。
随着分子信标的发展，该技术也必将在更多领域中发挥出它的优势。
2 分子信标的原理分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷酸。
在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离。
（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。
根据Foerster 理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。
所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
自由状态时，分子信标呈发卡式结构，从而荧光基团和淬灭基团相距较近（约7～10nm）。
此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。
分子信标探针
分子信标探针
1 分子信标探针
分子信标探针是一种能够在生物体系中可视化并测量分子活动的工具，常用于研究细胞生物学、生物物理学和药物研发等领域。
其中最常见的分子信标探针是荧光探针和发光酶探针。
2 荧光探针
荧光探针能够通过吸收外界激发光或其他刺激，发出特定的荧光信号，从而反映出分子内部的活动情况。
例如，用荧光探针标记细胞内的蛋白质、DNA或RNA，就可以实时可视化它们的位置、结构和功能等信息。
除此之外，还可以使用双荧光探针来研究分子间的相互作用，如荧光共振能量转移（FRET）技术。
FRET技术利用两个荧光探针之间的能量传递过程，来检测分子间的距离和相互作用。
这种技术广泛应用于分子结构和生物学过程的研究中。
3 发光酶探针
发光酶探针则是通过酶催化产生荧光或发光信号。
最著名的发光酶探针是绿色荧光蛋白（GFP），它可以在细胞内部发出绿色的荧光信号。
GFP的发现和研究为生物学领域带来了巨大的进展，因为它可以用于追踪细胞内的蛋白质动态和分布情况。
近年来，随着基因编辑技术
的发展，还出现了各种其他类型的发光酶探针，如红色荧光蛋白（RFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）等。
4 应用
分子信标探针广泛应用于生物学、医学和药学研究中。
例如，在细胞生物学领域，荧光探针可以用于可视化细胞内的各种分子结构和生物过程。
在药学领域，荧光探针可以用于筛选新型药物作用的靶点分子，如酶抑制剂、受体拮抗剂等。
在医学领域，荧光探针可以用于显影癌细胞、标记病原体等。
总之，分子信标探针的发展和应用已经推动了现代生命科学的发展，并为人类的健康和医疗提供了更多的可能性。
核酸引物探针质量技术要求
核酸引物探针质量技术要求全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：核酸引物探针是分子生物学实验中常用的一种工具，用于特异性检测和测定目标DNA或RNA序列。
其质量的好坏直接影响实验结果的准确性和可靠性。
制定和遵守一定的技术要求对于保证核酸引物探针的质量至关重要。
一、引物序列设计核酸引物探针的设计是其质量的重要基础。
在设计引物时，需要考虑以下几个方面：1. 引物的长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，需要保证引物足够长以确保特异性结合目标序列，同时又不能过长影响反应效率。
2. 引物的GC含量：引物中GC含量的合理范围通常在40%-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致引物的特异性降低。
3. 引物的特异性：引物的特异性是指引物与目标序列的互补性，需要确保引物与非目标序列的互补性尽可能小以避免干扰。
4. 引物的末端结构：引物的末端结构需要考虑到PCR扩增、杂交和捕获等不同实验操作的需求，合理设计引物的末端结构有助于提高实验效率。
二、引物检测和验证在使用核酸引物探针前，需要对引物进行检测和验证，以确保其质量符合要求。
主要检测方法包括：1. 电泳检测：通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等方法，检测引物的纯度和长度。
2. 透射电子显微镜观察：可以通过透射电子显微镜观察引物的形态和结构，判断引物的合成质量。
3. 质谱分析：利用质谱分析技术，可以检测引物的精确质量和序列。
三、引物处理和保存引物的处理和保存也对其质量起到重要影响，以下是一些常用的处理和保存方法：1. 复溶：引物在使用前需要以适当的溶剂复溶，避免在处理过程中引物受损。
2. 冻干：可以利用冻干技术将引物保存在干燥状态，减少引物的降解和污染。
3. -20℃或更低温度保存：引物应该保存在-20℃或更低的温度下，避免被高温或光照导致降解。
四、实验操作规范在进行核酸引物探针实验时，需要严格遵守实验操作规范，包括以下几个方面：1. 避免污染：实验前准备工作台、试剂和仪器时要避免污染，以确保实验结果的准确性。
新型核酸分子荧光探针——分子信标的研究进展
求， 人们 通过 各种 分子工 程策 略 ， 发展 了许 多 敏锐性 更
高、 选择 性更优 的 ＭＢ 。 作 者在此 对 ＭＢ 的结 构 、 设计 原 理 、 力 学 研 究 、 热 选 择性 与 动 力 学 研 究 进 行 了 综 述 ， 对 非 典 型 ＭＢ 并
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基 金 项 目 ： 家 自然科 学基 金 资助 项 目（０ ７ ０ ６ ， 西 省 教 育厅 科 研 计 划 项 目（ １Ｋ０ ９ ） 西 安 医 学 院 自然 科 学 基 金 资 助 项 目 国 ５５３４） 陕 １Ｊ ６ ４ ，
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收 稿 日期 ： ０ １ １ — ２ ２１— ２ ８
作 者 简 介 ： 丽 丽 （９ ３ ）女 ， 江 衢 州 人 ， 士 ， 师 ， 究方 向 ： 分 子 药 物 栽 体 材料 ，－ ｉ ｙ ｌｉ １ ＠ １３ ｃｒ。 余 １８一 ， 浙 博 讲 研 高 Ｅ ｍａ ：ｕｉ０ ８ ６ ．ｏ ｌ ｌ２ ｎ
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分子信标分析实验报告
一、实验目的1. 了解分子信标的基本原理和应用。
2. 掌握分子信标分析实验的操作步骤。
3. 通过实验，验证分子信标在特定条件下对目标分子的识别能力。
二、实验原理分子信标（Molecular Beacon）是一种用于检测目标分子存在的荧光探针。
当分子信标与目标分子结合时，其荧光性质会发生改变，从而实现对目标分子的定量检测。
本实验采用荧光光谱法对分子信标进行检测，通过比较荧光强度变化，判断目标分子的存在。
三、实验材料与仪器1. 试剂：分子信标探针、荧光标记的目标分子、荧光标记的无关分子、缓冲溶液等。
2. 仪器：荧光光谱仪、紫外-可见分光光度计、移液器、离心机、恒温水浴锅等。
四、实验步骤1. 准备实验溶液：将分子信标探针、荧光标记的目标分子、荧光标记的无关分子分别溶解于缓冲溶液中，配制成不同浓度的溶液。
2. 设置实验组：取一定量的分子信标探针溶液，加入荧光标记的目标分子溶液，充分混合均匀，置于荧光光谱仪样品池中。
3. 对照组设置：取一定量的分子信标探针溶液，加入荧光标记的无关分子溶液，充分混合均匀，置于荧光光谱仪样品池中。
4. 激发荧光：将样品池置于荧光光谱仪中，设定激发波长和发射波长，记录样品的荧光强度。
5. 结果分析：比较实验组和对照组的荧光强度变化，判断目标分子的存在。
五、实验结果与分析1. 实验组荧光强度明显高于对照组，说明目标分子与分子信标探针发生了特异性结合，导致荧光强度增加。
2. 通过改变目标分子的浓度，发现荧光强度与目标分子浓度呈正相关，验证了分子信标在特定条件下对目标分子的识别能力。
六、实验结论本实验通过荧光光谱法对分子信标进行了分析，结果表明分子信标在特定条件下对目标分子具有识别能力。
该实验为分子信标在生物、化学、医学等领域的应用提供了实验依据。
七、实验注意事项1. 实验过程中，注意避免样品污染，保持实验环境的清洁。
2. 在操作荧光光谱仪时，严格按照仪器操作规程进行，确保实验结果的准确性。
核酸探针技术及应用
核酸探针技术及应用基因检测技术发展，使对某些疾病诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速目。
近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接证据随着分子生物学发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制及流行病学规律等方面一种重要手段。
本文主要介绍了核酸探针技术原理，核酸分子杂交方法及核酸探针应用等方面。
一、核酸探针技术原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因DNA 片段，能及互补核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记单链DNA片段即为核酸探针。
核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间氢链被破坏而变性，解开成两条互补单链。
它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对原则重新组合成双链为复性。
这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)条件下才能实现。
正是由于双链DNA这种可解离及重组合性质，才可用一条已知单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，及另一条固定在硝酸纤维素滤膜上变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链及核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无及探针DNA (或RNA)同源或部分同源DNA(或RNA)存在。
因为探针只及靶病原体DNA或RNA杂交，而不及标本中存在其他DNA 或RNA 杂交。
二、核酸探针技术基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。
再加上已制备好探针进行杂交，探针便可找出已固定DNA中互补序列，及之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。
一、核酸分子探针的标记
一、核酸分子探针的标记
(labeling of probe)
（一）概述
在化学及生物学意义上的探针(probe)，是 指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分 子，并可以被特殊的方法所探测。
例如抗体—抗原、生物素—抗生物素蛋白、 激素—受体等的相互作用都可以看作是探针与 靶分子的相互作用。
所谓核酸分子探针则是指特定的已知 核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交， 然后用特定的方法进行杂交信号的检测。从 而可以用于待测核酸样品中特定基因序列 的探测。
以下介绍最常用的几种固相支持物。
(1)硝酸纤维素滤膜(nitrocellulose filter membrane)： 优点： ➢杂交信号本底较低; ➢非特异性地吸附蛋白质的作用较弱，因此特别适合
于那些涉及蛋白质作用(如抗体和酶等)的非放射性 标记探针的杂交体系。
缺点：
因为硝酸纤维素膜是依靠疏水性相互作用结合DNA的， 这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜的进程， DNA会慢慢脱离硝酸纤维素膜，特别是高温情况下， 从而使杂交效率下降。因此不太适宜于在同一膜上重 复进行杂交。再者，硝酸纤维素膜质地较脆，特别是 经烘烤后，操作不方便，须特别小心。
（五）探针的非放射性标记法
按照标记方法的不同，现有的非放射性标记物主要有 两种类型： 1.标记物预先已连接在NTP或dNTP上，因此可像放射 性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合方法掺入到核酸 探针上，如生物素、地高辛等； 2.标记物直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上。 此后一类标记物标记过程更为简单，可能是今后研究 发展的主流。
Hale Waihona Puke 杂交的双方是待测核酸序列及探针。 待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也 可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。 将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与 探针杂交(膜上印迹杂交)，也可直接在细 胞内进行(细胞原位杂交)。
分子信标技术
分子信标的应用
前景与展望
分子信标技术已渗透到结构和分子生物学、基因 和生物技术等领域的各个方面。分子信标技术有 着广阔的应用空间
随着研究的深入，分子信标作为一种高特异性、 高敏感性的分子探针必将在基因结构、疾病诊断、 疾病机制、药物筛选等方面得到更广泛的应用。
谢谢
应用1、实时定量PCR测定靶标浓度
将分子信标简单地密封在PCR 管中，在每个循环的退火阶段分子信标与 扩增产物结合产生荧光，未结合的分子信标不发荧光，这样荧光信号随 着反应循环的增加而增强，从而反映出PCR 过程中扩增产物浓度的增加。 由于加有分子信标的PCR 管在整个反应中是密封的，因此可避免传统 PCR后扩增产物凝胶电泳过程带来的污染，简化检测手段，检测灵敏度 高。
PNA与双链DNA互补链结合时可以取代非互补链,使之解 链以单链的形式存在,形成P-环结构。特定序列的DNA或 PNA分子信标可以与双链DNA的 变性部分结合,分别形成PD或PP-环型化合物,分子信标 结构被破坏,出现荧光响应。 最近的实验结果表明,利用 茎-环结构的DNA分子信标 或无茎的PNA分子信标可 以实时检测PNA与双链DNA 的结合位点
Fang 等以SSB、组蛋白、牛血清蛋白为对象研究了3 者对分子信标的不同影响。结果表明，分子信标能够很好 地区分这3 种类型的DNA 结合蛋白;分子信标与SSB 具有 很高的亲和力，其结合引起的荧光上升与完全互补的靶相 近。并且他们进一步研究了SSB 与分子信标的结合动力学， 得出其结合常数与已经报道的结合常数相符。
2、苯甲酸6-荧光素和DABCYL ；
3、荧光素和罗丹明、荧光素和芘丁酸 、香豆素和乙锭 荧光素和伊红 、一些铽螯合物和四甲罗丹明等。
波长转移分子信标
优点： 如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射 波长的荧光发射基团，就可在同一激发光下，通过检测这些 特征波长的荧光强度， 实现在同一体系中的多基因分析。
一种新型荧光探针———分子信标的研究及应用进展
生物素蛋白这种常用的生物分子固定方法将分子信标固定于固体表面上。在生物素化的分子信标的合 成上， 考虑到要选择引入生物素的合适位置， 使生物素$抗生物素蛋白桥键对分子信标杂交的影响降到 最低。因此， 生物素基团被连接到干部分带猝灭基团的一侧。他们用这种可固定化的分子信标进行了 &-’ 杂交的动力学研究， 并发现其对 &-’ 的检测灵敏度可以达到 0234 级。另一种将分子信标的猝灭
［ 44 ］ QB 等 利用分子信标研究了 &’( 与单链 &’( 结合 图 +A 在活细胞中分子信标与 /’( 的杂交。将
蛋白 （ 66O ） 的相互作用， 开辟了利用分子信标核酸探针来 分子信标注射入细胞质后的袋鼠肾细胞荧光图 研究二者相互作用的新方法。他们研究了分子信标和 66O 结合 的 摩 尔 比 和 结 合 常 数， 对 于 66O 的 检 出 限 可 达
［ & ; &% ］ 分离即可实时检测等优点， 在短短的几年内得到了迅速的发展 ， 并已广泛地应用于实时监测聚合 ［ < ; != ］ ［ !* > "& ］ ［ &! ， &" ］ 、 基因突变的快速分析 、 ?@A、 B@A 的检测、 ?@A C B@A 杂交的动力学研究 以及 酶链反应 ［ && ; &) ］ ?@A C 蛋白质相互作用研究 等， 其应用领域仍在不断拓展。
#" 分子信标的原理
［ !］ 分子信标是一种由寡聚核酸形成的发夹型分子 （ 图 !） 。它包括一个环 （ 544D ） (干 （ EF6G ） 结构， 其
分子信标：新型核酸分子探针要点
分子信标：新型核酸分子探针摘要：分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。
本文介绍了分子信标的作用原理，不同的分子信标类型以及应用，最后对前景作出了预测。
关键词：分子信标荧光探针灵敏度选择性活体检测引言：从20世纪60年代初至今，分子信标（Molecular beacon,MB）已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域【1,2,3,4】。
近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究【5,7,12】。
为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。
自从1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。
在它出色地完成了液相靶标测定(实时PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、活体分析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中【8,9,10,11】。
又由于易于对其进行修饰和改性，在这十来年的发展中，人们在经典分子信标模型的基础上，设计出了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA【13】链代替ssDNA形成的PNA分子信标，以及LNA分子信标等。
这些新型的分子信标是为了满足不同的需要而设计的，特异性更强，稳定性更好，为许多新的研究领域提供了一个平台。
为了满足基因组学和蛋白质组学的发展，对分子信标的固定化也成了必然的发展趋势，自从谭蔚泓【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来，固定化分子信标也迅速发展起来。
尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的强摩尔消光系数进行淬灭，简化了分子信标的设计，更加方便对其进行操作，大大促进了基因微阵列技术的发展。
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分子信标：新型核酸分子探针摘要：分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。
本文介绍了分子信标的作用原理，不同的分子信标类型以及应用，最后对前景作出了预测。
关键词：分子信标荧光探针灵敏度选择性活体检测引言：从20世纪60年代初至今，分子信标（Molecular beacon,MB）已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域【1,2,3,4】。
近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究【5,7,12】。
为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。
自从1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。
在它出色地完成了液相靶标测定(实时PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、活体分析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中【8,9,10,11】。
又由于易于对其进行修饰和改性，在这十来年的发展中，人们在经典分子信标模型的基础上，设计出了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA【13】链代替ssDNA形成的PNA分子信标，以及LNA分子信标等。
这些新型的分子信标是为了满足不同的需要而设计的，特异性更强，稳定性更好，为许多新的研究领域提供了一个平台。
为了满足基因组学和蛋白质组学的发展，对分子信标的固定化也成了必然的发展趋势，自从谭蔚泓【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来，固定化分子信标也迅速发展起来。
尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的强摩尔消光系数进行淬灭，简化了分子信标的设计，更加方便对其进行操作，大大促进了基因微阵列技术的发展。
1 分子信标的结构和作用原理分子信标的结构(图1)：分子信标是一种设计巧妙的荧光探针。
常规的分子信标是由一段包含了茎一环结构的单链寡聚核苷酸组成，形成一个发夹型结构。
在其环状部分，一般是一段长度为15—30碱基的序列，能与目标分子特异结合，茎区是长度为5—8碱基的互补序列，茎区的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团。
为了保证分子信标的灵敏度和热力学稳定性，在其茎干区设计的碱基数目一般为其环区的一半。
过长，则灵敏度下降；过短，则稳定性下降。
由于分子信标杂交前后环状区与目标分子的双链结构之间存在热力学平衡关系，使它的杂交特异性明显高于常规的线状探针。
近来，Dubertret等【17】用金纳米粒子簇代替DABcYL做淬灭剂，可以通过调节金纳米簇的形状、大小和组成而得到不同的淬灭剂。
由于金纳米簇对荧光试剂有着更高的淬灭效率，所以用金纳米粒子代替DABcYL后，大大提高了分子信标的灵敏度和特异性。
其它的淬灭基团还有铜离子螯合物【18】、超分子淬灭剂【19】以及直接利用碱基【20】本身做淬灭剂等。
图1 典型分子信标结构另一种结构的分子信标是无茎分子信标。
与经典分子信标结构类似，无茎分子信标只是不再含有双链结构的茎杆区，只含有单链的环状结构，具有很好的柔韧性。
目前的无茎分子信标有PNA【21,22,23】和DNA【24,25,26】两种，自由状态时，由于荧光分子与淬灭分子之间的疏水作用使得无茎分子信标近似于一个闭环结构。
当分子信标与靶序列结合后，探针与靶标形成的双链由于具有刚性使得荧光分子与淬灭分子分开，荧光恢复。
无茎分子信标与标准分子信标相比，由于其柔韧性增加，所以在体系中检测时，对靶标的响应加快，特异性也增强，又因为其不需要茎的结构，在设计和合成上相对简单，成本降低。
但其结构上缺少了茎区，稳定性有所下降，背景荧光相对增强。
分子信标作用原理：在自由状态下，分子信标以发夹结构存在，茎区的碱基互补配对，使连接在探针的5’端荧光基团及3’端的淬灭基团相互接近(约为7—10 nm)。
当一定波长的激发光照射时，荧光分子和淬灭分子之间发生荧光共振能量转移。
荧光基团受激所产生的荧光被淬灭基团吸收，并以热量的形式散发，荧光几乎完全淬灭，此时荧光背景极低(如图2)。
加入与环状区互补的靶核苷酸序列后，分子信标可与之形成相对刚性并且更加稳定的双链体，使茎干区的互补链被拉开，从而使得荧光基团与淬灭基团分开，空间距离增大，根据Forster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。
杂交后，分子信标的荧光几乎完全恢复。
并且荧光强度与溶液中靶标序列的量成正比，所以可以用来作定量分析。
图2. 分子信标作用原理2 分子信标的类型2.1 双重荧光共振能量转移(FRET)分子信标双重荧光共振能量转移(FRET)(图3)分子信标【27】是指在一个体系中同时设计了两种分子信标，只有通过这两种分子信标的相互作用才能实现检测。
其中一个分子信标包含一个荧光给体基团和一个淬灭基团，另一个分子信标包含一个荧光受体基团和一个淬灭基团。
在自由状态时，荧光给体基团和荧光受体基团都处于荧光淬灭状态，当在体系中加入目标分子时，这一对分子信标同时打开，荧光给体基团与荧光受体基团头对头地与目标分子特异性结合，此时，两基团彼此挨得很近(<6 nm)，发生荧光共振能量转移，给体分子将能量传递给受体分子，受体分子获得能量发出特征荧光。
通常用来做荧光给体的是镧系元素螯合物，有机荧光团作为荧光受体。
因为镧系元素螯合物的荧光发光寿命很长(约1 ms)，发出的光的带分布很窄，在某一些波长区域，几乎不发荧光，而且还能有效地降低荧光受体基团、实验中干扰物以及池子自身的荧光，使得在某一些波长区域的背景荧光几乎接近零，大大地提高了信噪比，从而提高了检测的灵敏度，所以很适合于作为荧光给体材料。
因为常规的分子信标用于活体检测时，由于细胞内的环境比较复杂，如可能被细胞内的核酸酶降解或非特异性地与核酸结合蛋白结合，而导致假阳性信号。
但采用这种双重荧光共振能量转移(FRET)分子信标，因为只有当荧光给体基团与荧光受体基团同时发生杂交时，才能发出受体基团的特征荧光，所以能大大地减小假阳性信号。
与以前的双线型探针相比，采用这种方法能显著地降低由于光谱重叠而产生的高背景信号，提高检测灵敏度，还能区分单碱基多态性【28,29】。
因此，这种分子信标将会成为基因表达实时监测，活体细胞定量检测的有力工具【30,31】。
图3 FRET双分子信标2.2超级猝灭基团分子探针(SQ-MB)SQ-MB是一个一端具有多个猝灭基团的荧光分子探针【32,33】，如图4所示。
近年来，MB被广泛地应用于生物技术研究的各个领域。
但由于MB结构中的荧光基团不能被有效地猝灭，较高的背景噪音严重影响了实际应用过程中测试结果的准确性。
因此，通过结构的优化以降低体系的背景噪音越来越受到关注。
据报道，应用多个猝灭基团与一个荧光基团配对，可以有效地提高猝灭效率。
这是由于多个猝灭基团可以提高吸收效率、增强猝灭基团与荧光基团问的偶极一偶极配位能力，从而提高猝灭效率。
图4 包含3个淬灭基团的分子信标2.3 锁定分子信标随着分子生物学的发展，对分子信标的应用也不仅仅限于体外检测。
活体检测是目前发展的一个很重要的方向，但由于活体内的环境比体外要复杂得多，如活体内存在的核酸酶能快速地将常规的分子信标分解，造成假阳性信号。
对分子信标进行修饰【34】就是为了有效地避免核酸酶等外在物质的影响而进行的。
而锁定分子信标正是为了满足这一发展需求而设计的一类稳定性、选择性和灵敏度都非常高的核酸探针。
LNA【35,36】是将核苷酸中的核糖的2’一O和4’一C用一个亚甲基连结起来，形成一个核糖双环结构，改变了它的几何和立体性质，减小了核糖结构的柔韧性，从而显著地提高了它的稳定性。
但修饰后的核酸依然保持了双螺旋结构，对互补链的亲和度不受影响，在水中的溶解度也能保持一样，还因其带有一定的负电荷，用带正电荷的脂质体就能很容易地将其导入细胞内，且它的合成方法也与合成DNA的方法类似。
因此，鉴于LNA的上述性质，在实验室用LNA操作起来就比DNA方便，能够简化实验过程。
图5 LNA/2′-O-methyl RNA探针Irina【37】等用LNA/2′-O-methyl RNA嵌合探针用于活细胞中mRNA中的动态成像。
实验结果表明该方法与普通的分子信标相比，与mRNA的杂化率更高。
2.4 无茎分子信标在实际的检测中，荧光基团和淬灭基团仅仅只是一个辅助基团，真正起识别作用的只是分子信标的环状部分。
无茎PNA能快速地与目标链结合，减少检测时间，并且在复杂的体系中也能保持相对的稳定性。
如将其与PNA 结合使用，还可用于DNA和RNA的检测，背景信号低【38】(图6)。
图6 stemless FIT–PNA beacons in the detection of complementary nucleic acids2.5 荧光波长转移型分子信标图7 荧光波长转移型分子信标在常规的分子信标基础上，Carolin【39】等设计了另一种分子信标。
他们在分子信标茎部加入两个发色团噻唑橙和噻唑红作为人工碱基，两者间可发生能量转移，用490nm的光照射，发射峰在670nm，由绿光变为红光，然而当该分子信标与目标链结合后，荧光降为530nm，该方法的优势在于不需要淬灭剂，而且背景信号低。
3 固定化分子信标分子信标对靶序列的检测尽管十分灵敏，但早期发展起来的分子信标都是用于液相中的检测，这样就限制了分子信标在活体生物医学研究和DNA生物传感中的大规模应用。
但如果能将不同序列的多种分子信标固定在固体基片表面，并保持其原有性质不变，无疑将可用于DNA的大规模并行检测，大大提高分析效率。
而目前固定化的分子信标从检测方式上来分有基于荧光和基于电化学的两种。
3.1 基于荧光检测的固定化分子信标这一方向的固定化分子信标开展得相对较早，而且在这几年的发展中也取得了不小的进步。
谭蔚泓等【14,41】于1999年首次通过生物素一抗生物素蛋白将分子信标固定在硅片表面(图8)。
他选取靠近淬灭基团的茎干区做固定点，将生物素标记到ssDNA上，因为这样对分子信标的荧光、淬灭以及杂交影响最小，再将标记好的分子信标连接到标记有亲和素的硅胶表面。
为了尽可能地减小固定化的分子信标产生的光漂白现象，他们采用罗丹明作为荧光基团。
这种固定化的分子信标可以用于均相液态环境以及固液界面等较为复杂的环境中，其杂交能力，亲和性等性质基本不变，能检测到的靶序列浓度达纳摩尔级。
图8 固定化分子信标3.2 基于电化学检测的固定化分子信标分子信标的荧光检测方法在过去的十来年中在实验室已经取得了很大的发展, 然而，固定化分子信标用于电化学检测也有报道。