第十二章 核酸探针检测技术
第十二章 核酸探针检测技术
现代食品检测技术第二部分第12章核酸探针检测技术赵杰文邹小波江苏大学食品与生物工程学院第十二章核酸探针检测技术1 核酸探针的种类及其制备方法2 探针标记物与标记方法3 探针杂交与信号检测4 核酸探针在食品微生物检测中的应用1核酸探针的种类及其制备方法一、基因组DNA探针二、cDNA探针三、RNA探针四、寡核苷酸探针一、基因组DNA探针这类探针多采用分子克隆或PCR技术从基因文库筛选或扩增方法制备。
二、cDNA探针cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。
三、RNA探针mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想四、寡核苷酸探针用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响2 探针标记物与标记方法一、核酸探针标记物种类及其特点二、探针标记方法三、探针的纯化四、探针标记效率的评估一、核酸探针标记物种类及其特点 标记探针的目的是为了跟踪探针的去向，确定探针是否与相应的基因组DNA杂交一、核酸探针标记物种类及其特点 一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：1、高度灵敏性；；2、标记物与核酸探针分子的结合；；3、应不影响探针分子的主要理化特性；4、当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性(Km值)无较大的影响；5、检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性二、探针标记方法（一）探针的放射性核素标记法（二）探针的非放射性标记法（一）探针的放射性核素标记法1．缺口平移法2．随机引物法3．单链DNA探针的标记4．cDNA探针的标记5．寡核苷酸探针的标记缺口平移法（二）探针的非放射性标记法1．PCR标记法2．体外转录标记RNA探针PCR标记法体外转录标记RNA探针三、探针的纯化（一）凝胶过滤柱层析法（二）反相柱层析法（三）乙醇沉淀法四、探针标记效率的评估通过测定标记产物的量来估计每一次标记反应的效率，这可以准确了解杂交液中应加探针的量。
核酸荧光探针技术在动态细胞学中的应用
核酸荧光探针技术在动态细胞学中的应用随着科技的发展，人们对生命的了解越来越深入。
动态细胞学是研究细胞内分子在时间和空间上的变化规律以及与生命活动密切相关的过程的学科。
而核酸荧光探针技术是在细胞学研究中广泛应用的技术之一。
本文将会详细介绍核酸荧光探针技术在动态细胞学中的应用。
一、核酸荧光探针技术基础核酸荧光探针具有良好的特异性和灵敏度，是目前研究RNA 和DNA等核酸结构、性质和功能的一种重要手段。
核酸荧光探针通常是由荧光物质和一定长度的核酸序列组成。
荧光物质能够将非辐射能量转化为可见光，并且在荧光物质激发下，核酸链能够展开，形成荧光复合物。
利用核酸荧光探针，可以对目标分子进行准确、特异性的检测和定量（如实时定量PCR）。
基于核酸荧光探针技术，近年来还发展了RNA荧光原位杂交（FISH）和光学结构测序（super-resolution microscopy）等新技术。
二、 2.1 在细胞周期和凋亡中的应用细胞周期对于细胞存活和繁殖具有至关重要的作用。
通过核酸荧光探针技术可以实时追踪细胞周期中的DNA复制和细胞有丝分裂过程中染色体的构象变化，既可以帮助解析细胞周期的分子机制，也可以用于筛选细胞周期调控的药物靶点。
此外，核酸荧光探针还可以用于检测细胞凋亡信号通路中的关键基因的表达及调控，如bcl-2家族的关键因子bax、bcl-xl等，既可以揭示细胞凋亡过程的分子机制，也可以为肿瘤治疗等提供新的研究思路。
2.2 在基因表达和蛋白质翻译调控中的应用核酸荧光探针还可以用于研究基因表达及蛋白质翻译调控等相关细胞过程。
对于真核生物，核糖体合成蛋白质的过程是一个非常复杂的过程。
利用荧光标记探针可以为研究者提供细胞内蛋白质定位和共定位的信息，并通过不同通道的每个探针产生的荧光来量化底物的含量和活性。
同时，还可以通过使用超分辨成像技术来了解蛋白质的亚细胞运动和相对定位，从而了解相关功能。
2.3 在病毒和细菌感染中的应用核酸荧光探针还可以应用在病毒和细菌感染领域。
核酸探针技术
中学生物学
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核酸探针技术
岳朝宽
摘 要
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高辛， 二者都是半抗原。 生物素是一种小分子水溶性维生素， 对亲和素有 独特的亲和力， 两者能形成稳定复合物， 通过连接在 亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质（ 如酶、 荧光素 等） 进行检测。 地高辛是一种类固醇半抗原分子， 可利用其抗体 进行免疫检测， 运用原理类似于生物素的检测。地高 辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标 记的相当， 而特异性优于生物素标记， 其应用日趋广 泛。
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]^_‘Ma5b678 人工合成的寡核苷酸探针是在已知基因序列的
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情况下， 由核酸合成仪来完成， 可廉价获得大量的此 类探针， 长度一般长约 !"#$" %&， 甚至可达 ’" %& 。如 果已知核酸序列可根据已知 ()* 或 +)* 序列合成 精确互补的 ()* 探针，单一已知序列寡核苷酸探针 能与它们的目的序列准确配对， 可以准确地设计杂交 条件， 以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近 的非完全配对序列杂交， 对于一些未知序列的目的片 段则无效； 如果不知道核酸序列， 可依据其蛋白质产 物 的 氨 基 酸 顺 序 推 导 出 核 酸 序 列 从 而 合 成 ()* 探 针。 人工合成的寡核苷酸片段作为核酸杂交探针应 用十分广泛， 对于检测靶基因上单个核苷酸的点突变 和小段碱基的缺失或插入尤为适用。
生物检测技术——核酸探针
3)单链DNA探针和双链DNA探针
➢ 用双链探针杂交验测另一个远缘DNA时，探针序列与 被检测序列之间有很多错配，但是，2条探针互补链之 间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果 使检测效率下降。科学上采用单链探针则可解决这一 问题。单链DNA探针的合成方法:(1)从Ml3载体衍生序 列合成单链DNA探针。(2)以RNA为模板用反转录酶合 成单链cDNA探针。
核酸探针的前景
➢ 基因芯片在环保方面、食品检测方面的研究报道比较少， 这将成为将来的研究方向。从某种意义上我们可以认为： 基因结构或种类决定物种，基因功能或表达则决定生命即 生物的生、老、病、死。基因芯片技术将为我们提供一条 认识生命本质的捷径，同时它的发展也带动了蛋白质芯片、 细胞芯片、多肽芯片、组织芯片的发展和应用。
➢ 核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱 基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定 基因片段的检测。
核酸探针的标记物
一.放射性标记
➢ 放射性同位素是最早使用、也是目前应用最广泛的 探针标记物。常用的同位素有 32P、3 H、35S。其中， 以32P应用最普遍。
➢ 放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到pg级； 缺点是易造成放射性污染，而且同位素半衰期短、 不稳定、成本高。因此，放射性标记的探针不能实 现商品化。目前，许多实验室都致力于研究非放射 性标记的探针。
➢ 在癌基因的检测和诊断、致病病原体的检测、遗传病的产 前诊断以及亲子关系鉴定等基因诊断方面以及特异性目的 基因及外源DNA的检测方面，核酸探针技术将越来越显出 其巨大的应用解脲脲原体(UU)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
➢ 双链DNA探针的合成方法：切口平移法和随机引物合 成法。双链DNA探针在与靶序列杂交前，DNA分子必 须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链 目的。解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温 度以下，可使探针保持单链状态。
特异性核酸探针技术在疾病诊断中的应用
特异性核酸探针技术在疾病诊断中的应用随着科学技术的进步与发展，人们的健康问题也日益受到重视，尤其是各种疾病的诊断，成为医学领域中不可或缺的一部分。
作为一种新兴的技术手段，特异性核酸探针技术在疾病的检测和诊断方面有着广阔的应用前景。
本文将介绍这种新技术的定义、原理、应用和不足之处。
一、特异性核酸探针技术的定义特异性核酸探针技术是一种在分子水平上检测DNA或RNA序列的技术，其主要是建立在核酸杂交原理上的。
利用一段互补于待检测的DNA或RNA分子序列的标记有色或荧光的寡核苷酸探针，通过与待检测分子进行特异性识别和杂交反应，从而使标记荧光信号的产生，并对目标分子的存在与否进行精确的检测和分析。
二、特异性核酸探针技术的原理特异性核酸探针技术的核心原理是互补配对和封口作用。
核酸探针通过与待检测的分子发生互补配对，然后再通过封口作用来做出结果。
封口指的是分子间的万有引力使探针与待检测分子的碱基配对，而双链末端的物理结构二次解旋会另探针脱离碱基配对所产生的笼合态（quencher），这就控制了PCR过程中的非特异性反应，提高PCR检测的灵敏度和特异性。
三、特异性核酸探针技术的应用特异性核酸探针技术在疾病诊断和基因检测方面具有较为广泛的应用，包括以下应用：1. 肺癌检测：特异性核酸探针技术可以在早期肺癌检测中起到很大的作用。
这需要快速检测样品中肺癌相关基因、突变或表达量的变化。
2. 微生物感染检测：该技术可以及时检测出样品中可能存在的微生物感染，进而实现对病毒、细菌和真菌等致病微生物的快速检测。
3. 常见疾病检测：特异性核酸探针技术还可以用于对乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌和结直肠癌等常见癌症进行快速检测。
4. 特定基因检测：该技术也可以用于特定基因的检验，譬如血透患者的交叉感染、染色体特定序列和基因点突变等的检测。
在这些情况下，特异性核酸探针技术可以快速、准确而有效地检测出这些基因的存在与否。
四、特异性核酸探针技术的不足之处虽然特异性核酸探针技术有着多方面的优点，但仍然存在一些不足之处：1. 特异性不高：感兴趣的区域会受到引物设计的影响，所以特异性转化率越来越小。
核酸探针技术
核酸探针技术化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。
抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。
核酸探针技术原理是碱基配对。
互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。
核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。
每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。
(一) 核酸探针的种类1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。
作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。
其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。
将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。
cDNA探针适用于RNA病毒的检测。
cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。
将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。
但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。
用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。
放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。
放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。
常用的同位素有32P、3H、35S。
其中，以32P应用最普遍。
放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。
核酸探针描述课件
斑点印迹法是一种简单快速的核酸检测方法，其基本原理是将核酸样品直接点到 膜上，然后通过与标记的探针进行杂交，检测目核酸序列。该方法具有操作简 便、快速、高通量等优点，广泛应用于基因诊断、基因表达分析等领域。
微孔板印迹法
总结词
一种将核酸结合到微孔板上的方法，用 于高通量检测多个样本中的特定核酸序 列。
等领域的研究提供了有力支持。
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核酸探针的应用领域
基因检测与诊断
用于检测基因突变、遗传病、癌症等 疾病相关的基因序列变化，为疾病的
预防、诊断和治疗提供依据。
生物多样性研究
用于检测和鉴定物种的基因组序列， 研究物种的进化、分类和系统发育等
。
食品安全与环境监测
用于检测食品和环境中存在的有害微 生物、病毒和其他病原微生物的核酸 序列，保障食品安全和环境卫生。
探针的纯化与保存
探针的纯化
通过凝胶电泳、亲和层析等方法对标记后的核酸 探针进行纯化，去除杂质和未标记的核酸分子。
探针的保存
将纯化的核酸探针进行分装，并保存在-20℃或80℃冰箱中，以延长探针的保存时间并保持其稳 定性。
03
核酸探针的检测方法
Southern印迹法
总结词
一种将DNA从凝胶转移到膜上的方法，用于检测基因组DNA中的特定序列。
农业科研与育种
用于检测和鉴定农作物及其病原微生 物的基因组序列，研究农作物的遗传 改良和抗病育种等。
02
核酸探针的制备
目的基因的获取
01 基因组DNA提取
从生物样本中提取基因组DNA，作为制备核描述课件
目录
• 核酸探针概述 • 核酸探针的制备 • 核酸探针的检测方法 • 核酸探针的实际应用 • 核酸探针的未来发展
核酸探针技术在病原微生物检测中的
简述核酸探针技术及其在微生物检测中的应用核酸探针技术及在病原细菌检测中的应用随着分子生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。
在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针（Nuclear acid probe）以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于病原微生物的检测。
核酸探针是将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子就称为核酸探针或基因探针。
根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为DNA探针或RNA 探针，一般大多选用DNA探针；根据选用基因的不同分为两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。
这类探针检测的基因相当保守，包括大部分rRNA，因为他既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。
如应用rRNA探针检测作为筛选食品污染程度的指示菌E.Coli。
选择探针的原则是只能同检测的细菌发生杂交反应，而不受非检菌存在的干扰。
1 核酸探针的特点：1.1探针的特异性核酸探针检测技术的最大特点是特异性，就是说一个适当组建的DNA探针能绝对特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。
对食品检测而言，就是不与样品中内源性杂菌和样品自身DNA发生非特异性反应。
以往检测方法检测的是基因的表达产物（蛋白质或其他产物）。
检测这种物质受多种因素影响。
比如食品中微生物因受应激损伤（高温、冷冻、化学制剂等）会导致基因组的变化，从而引起其表达产物的变化。
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现代食品检测技术第二部分
第12章核酸探针检测技术
赵杰文邹小波
江苏大学食品与生物工程学院
第十二章核酸探针检测技术
1 核酸探针的种类及其制备方法
2 探针标记物与标记方法
3 探针杂交与信号检测
4 核酸探针在食品微生物检测中的应用
1核酸探针的种类及其制备方法
一、基因组DNA探针
二、cDNA探针
三、RNA探针
四、寡核苷酸探针
一、基因组DNA探针
这类探针多采用分子克隆或PCR技术从基因文库筛选或扩增方法制备。
二、cDNA探针
cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。
三、RNA探针
mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想
四、寡核苷酸探针
用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响
2 探针标记物与标记方法
一、核酸探针标记物种类及其特点
二、探针标记方法
三、探针的纯化
四、探针标记效率的评估
一、核酸探针标记物种类及其特点 标记探针的目的是为了跟踪探针的去向，确定探针是否与相应的基因组DNA杂交
一、核酸探针标记物种类及其特点 一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：1、高度灵敏性；；2、标记物与核酸探针分子的结合；；3、应不影响探针分子的主要理化特性；4、当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性(Km值)无较大的影响；5、检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性
二、探针标记方法
（一）探针的放射性核素标记法（二）探针的非放射性标记法
（一）探针的放射性核素标记法
1．缺口平移法
2．随机引物法
3．单链DNA探针的标记
4．cDNA探针的标记
5．寡核苷酸探针的标记
缺口平移法
（二）探针的非放射性标记法
1．PCR标记法
2．体外转录标记RNA探针
PCR标记法
体外转录标记RNA探针
三、探针的纯化
（一）凝胶过滤柱层析法
（二）反相柱层析法
（三）乙醇沉淀法
四、探针标记效率的评估
通过测定标记产物的量来估计每一次标记反应的效率，这可以准确了解杂交液中应加探针的量。
估计探针产量的推荐方法
估计探针产量的推荐方法
3 探针杂交与信号检测
一、核酸杂交
二、杂交信号检测
一、核酸杂交
（一）Southern印迹杂交
（二）Northern印迹杂交
（三）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 （四）原位杂交
Southern印迹杂交
Northern印迹杂交
斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 （三）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting），是在Southern印迹杂交的基础上发展的两种类似的快速检测特异核酸（DNA或RNA）分子的核酸杂交技术。
原位杂交
1975年，M.Grunstein和D.Hogness根据检测重组体DNA分子的核酸杂交技术原理，对Southern印迹技术作了一些修改，发展出了一种菌落杂交技术。
二、杂交信号检测
（一）放射性核素探针的检测－放射自显影 （二）非放射性核素探针的检测
（一）放射性核素探针的检测－放射
自显影
利用放射线在×线片上的成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。
（二）非放射性核素探针的检测
1．偶联反应
2．显色反应
1．偶联反应
大多数非放射性标记物是半抗原，因此可以通过抗原—抗体免疫反应系统与显色体系偶联。
另一类非放射性标记物如生物素，作为抗生物素蛋白(avidin)的配体，则可通过亲合法进行检测。
2．显色反应
通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行杂交信号的检测。
4 核酸探针在食品微生物检测中的应
用
一、大肠杆菌
二、金黄色葡萄球菌
三、李斯特氏菌
四、存在的问题及展望
一、大肠杆菌
放射性同位素标记的核酸探针正越来越多地用于ETEC的快速检测
二、金黄色葡萄球菌
法国生物梅里埃公司的GEN—PROBE系统，采用杂交保护分析法(HPA)研制成金黄色葡萄球菌检验和鉴定试剂盒，已成功应用于检测食品中的金黄色葡萄球菌。
三、李斯特氏菌
生物梅里埃公司的“Accuprobe Listeria monocytogenes”和GENE-TRAK的“GENE-TRAK Listeria”。
四、存在的问题及展望
核酸探针技术虽为一种快速、敏感、特异的检测新技术，但其在实际应用中仍存在不少问题。
放射性同位素标记的核酸探针具有半衰期短、对人体有危害等缺点，作为常规诊断，特别是在食品检验实验室很不适用。