核酸探针的制备
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" 安徽医科大学分子生物学中心实验室和生物化学教研 作者单位：
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安徽医科大学第一附属医院呼吸内科，合肥! #($$##
作者简介：汪 ! 渊， 男， %’ 岁， 教 授， 博 士 研 究 生 导 师。 012： $33"4
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Baidu Nhomakorabea
! ! 本实验室用地高辛4AF0G 随机引物方法标记人 内皮细胞特异性分子 （ ?=67: 1:AHI?12872 JK1B8L8B 6H4 21B=27M4" ， ?5N/4" ） BOPE 探针， 并应用于 5N/ & " 基 因在肾癌中 6CPE 转录的检测。现报道如下。 !" 材料与方法 !# !" 主要试剂 " K50#*Q4?5N/4" 重组质粒由本实
!# !" 标记探针用于原位杂交检测肾癌细胞 ,-.3$ 基因的转录 " 检测结果表明 C;DE= !I(- 在肾癌 细胞中有 较 强 表 达， 强染色主要见于颗粒细胞癌 （ 图 &） 。 4" 讨论
参考文献 地高辛 探 针 可 检 测 到 $L7 左 右 的 同 源 质 粒 ’(-， 这与$& @ 标记的探针具有相似的敏感性。但由 于核酸探针不像蛋白质含有羟基、 巯基或羧基等易 起反应的活性基团， 因此， 用非放射性检测基团对核 酸探针进行修饰要比修饰抗体或抗原更加困难。由 于地高辛是从洋地黄植物中提取出来的， 不像生物 素标记的核酸探针在体内存在内源性生物素而带来 高本底。标记的地高辛是一种类固醇半抗原， 通过 含 == 个碳原子的间臂与尿嘧啶的第五碳原子连接，
万方数据
图 !" 肾癌的 512 原位杂交分析 -M 肾癌组织的 NC 染色O AM 肾癌的原位杂交分析
杂交后， 多采用碱性磷酸酶标记的抗 ’,B 抗体来显 示靶核酸。地高辛分子量小、 渗透性好， 在原位杂交 分析中具有高敏感性、 安全性、 特异性、 低本底和快 速、 简 便 等 优 点， 它甚至能够检测出人类基因组 ’(- 中单拷贝的基因。地高辛标记的核酸探针可 以稳定地处于冰冻状态下保存数月甚至 = 年， 可以 随时使用不受时间限制， 也不受实验室条件限制， 一 般实验室都可完成。为了提高探针的特异性及敏感 性， 模板 ’(- 的纯度一定要严格要求， 标记探针的 沉淀必须彻底干燥， 否则会明显增加杂交显色的背
#$$% & $% & #’ 收稿 基金项目： 国家自然科学基金 （ 编号：()*+$(#% ） ， 国家教委优秀年 轻教师 基 金、 安徽省自然科学基金 （ 编 号：$"$%(+"’ ， ))$%("# ） ，安 徽 省 教 育 厅 教 学 研 究 项 目（ 编 号： ,-./#$$("#) ） 和安徽省人才基金资助课题
图 $" %*+ 标记的 ,-. / $ 0%12 探针的 %&’ ()&’ 鉴定
景， 如果沉淀太少， 可在加 C’P- 终止反应后， 加人 适量糖原 （ &. !7） 。对于低浓度的 ’(- 溶液 （ 少于 =. !7 8 9） 在加入乙醇之前可加入 =. !7 酵母 GI(作为载体， 以增加沉淀效率。在用于时， 要封闭好非 特异性吸附信号， 这方面不同的实验室条件不同， 需 反复试验摸索出自己的最佳方案。
安徽医科大学学报! !"#$ %&’()*+’#$#’+ ,)-’"’&$.’+ !&/0’! #$$3 e1Q； &’ （"）
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)分子生物学实验基本方法)
核酸探针的制备
# 汪! 渊" ! 张孝林" ! 张素梅" ! 任传利" ! 熊江霞" ! 卜丽佳" ! 周! 青" ! 桂淑玉"，
主题词! 核酸探针 中图分类号! C(%#D ( ； C()%D # 文献标识码 E 文章编号 "$$$ & "%)# （ #$$3 ） $" & $$)3 & $#
［ %］ ! @ $ @ & " 标记探针的应用于原位杂交 ! 用 %W 多
冲液； OPE 上样缓冲液； 限制性内切酶 U8:A !、 限制 性内切酶 5BHC "； " 6H2 R S O00； 乙酰化 VNE； 平衡 酚 & 氯仿； 预冷 "$$W 乙醇； 预冷 +3W 乙醇； ( 6H2 R S P7EB； " T 05 缓冲液； OXY OPE S7Q128:; 7:A O1I1B4 I8H: Z8I（ VH1?M8:;1M & /7::?186 公司） ； #$ T NN[ ； ( 6H2 R S P7[2； $D ( 6H2 R S 枸橼酸三钠， 用 " 6H2 R S U[2 调 KU 至 +D $ ） ； 马来酸缓冲液 （ $D " 6H2 R S 马 来 酸 $D "3 6H2 R S P7[2 用 P7\U 调 KU 至 +D 3 ） ； ]7J?8:; Q=LL1M （ 含 马 来 酸 缓 冲 液， (W 0911:4#$ ） ； 中和液 （ "D 3 6H2 R S P7[2、 " 6H2 R S 0M8J4U[2 KU *D $ ） ； V2HB4 Z8:; JH2=I8H: （ " ; V2HBZ8:; C17;1:IJ， 在加热情况下溶 于 "$ 62 马来酸缓冲液中， 即为 "$ T V2HBZ8:; JH2=4 I8H: 用时用马来酸缓冲液稀释 "$ 倍） ； 预杂交液： 3 T NN[ ； $D "W P4十二烷基肌氨酸； 3$W 去离子甲酰 胺 （ ^ R ^） ； $D #W NON （ 9 R ^） ； 杂交液： 用预杂交液稀 释探针至 3 _ #3 #; R S； O1I1BI8H: Q=LL1M （ $D " 6H2 R S 0M8J4U[2，$D " 6H2 R S P7[2， 3$ 66H2 R S /;[2#
=O 张素梅， 王O 雪， 胡若磊 等M 内皮细胞特异性蛋白 Q = 表达载体 的构建及其在大肠杆菌中的表达M 安徽医科大学学报，&..& ； $0 （>） ： 2=6 1 R &O 卜丽佳， 张素梅， 王 O 雪 等M 质粒的制备M 安徽医科大学学报， &..$ ； $R （=） ： 0> 1 R $O 汪O 渊， 桂淑玉M 电洗脱法纯化 ’(- 片段M 安徽医科大学学报， =SS> ； $= （>） ： 6>> 1 R 2O 熊江霞， 吴O 强， 周O 青 等M 肾癌组织中内皮细胞特异性分子E= !I(- 水平及 其 蛋 白 表 达 的 关 系M 临 床 与 实 验 病 理 学 杂 志， &..2 ； &. （&） ： =R0 1 S.
万方数据 3"’""%$ ， 546782： 97:;<=7:> 7?6=@ 1A=@ B:
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!"# 以灭活内源性过氧化物酶； 切片上滴加 $% 柠檬 酸新鲜稀释的胃蛋白酶室温消化 & !"#， 加入 ’()*+ , 水解细胞中 ’(-； 每张切片 &. !/ 加预杂交液， 置 $0 1 2.3 杂交箱中预杂交 & 1 2 4； 每张切片加 &. !/ 浓度为 .5 6 1 & !7 8 9 的地高辛标记探针的杂交液； 置 $0 1 2.3 杂交箱中杂交过夜； 依次用 & : ;;< 、 .5 6 : ;;< 洗涤、 .5 & : ;;< 洗涤 =6 !"# 洗涤后滴加封闭 液， $. !"# 后滴加生物素化鼠抗地高辛置 $03 >. !"# 后， .5 6 !?/ 8 9 @A; 洗 6 !"# : 2 次。勿用其它缓 冲液和 蒸 馏 水 洗 涤； 加 ;-A< $03 &. !"# 后， .5 6 !?/ 8 9 @A; 洗 6 !"# : $ 次。勿用其它缓冲液和蒸馏 水洗涤； 滴加生物素化过氧化物酶 $03 &. !"# 后， .5 6 !?/ 8 9 @A; 洗涤； 按 ’-A 显色试剂盒说明滴加 显色剂， 镜下控制显色， 苏木精复染， 充分水洗， 酒精 脱水， 二甲苯透明， 封片。 !" 结果 !# $" %&’ ()&’ 检测标记探针 " 纯化的 ’,B 标记的 C;DE= F’(- 探针经 ’?G H/?G 鉴定， 结果表明其可与 目的 ’(- 有效互补结合 （ 图 =） ， 提示该探针可用于 组织切片的 ’(- 原位杂交、 I(- 原位杂交和 ;?JG4E +K# H/?G、 (?KG4+K# H/?G 等试验。
［ "］ 验室构建和保存 ； "$ ; R S 溴化乙锭； 3$ T 0E5 缓
?5N/ & " 重 组 质 粒。用 限 制 性 内 切 酶 5BHC " 和 U8:A !酶切重组质粒后电泳， 对含 5N/4" 的片段进
［ (］ 。测吸光度 E#’$ 计算浓度。 行回收和纯化
! @ $ @ $ ! 探针的 OXY 标记 ! 根据试剂盒操作， 取纯 化产物 （ 约 ( #;） ， "$$‘ 煮沸变性 "$ 68:， 迅速放于 冰上冷却， 然后加入： 随机六核苷酸 （ ?1a7:=B21HI8A1） 引物 68aI=M1 # #2， AP0G 68aI=M1 # #2， b21:H9 1:c<61 " #2 混匀， (+‘ 水浴过夜 （ 也有用 (#‘ 保温 # ?， 太 长时间的保温将导致模板非依赖物质的合成和杂交 特异性的丧失） 后加入 # #2 $D # 6H2 R S 5O0E 终止 反应， N1K?7A1a4#3 分离纯化。 ! @ $ @ % ! 标记探针的纯化 ! 加 #$ #2 % 6H2 R S S8[2， 3$$ #2 & #$‘ 预 冷 的 无 水 乙 醇， 充分混合 （ 由于 AP0G 的锂 盐 在 含 水 乙 醇 中 有 较 大 的 溶 解 度） ，& #$‘ 放置过夜， "# $$$ 转 R 68:， 离心 "$ 68:， 用 +$W 和 "$$W 乙醇各洗涤一次沉淀， 真空干燥， 沉淀重新 溶解于 #$ #2 水中， 分装并 & #$‘ 保存。 ［ %］ ! @ $ @ & ! 标记探针的检测 ! 取重组 KVbMJ^4/S[b 质粒点 P[ 膜， 并以 " #2 蒸馏水作为空白对照， *$‘ 干烤约 # ?， 加入到含有预杂交液 （ 3 62 ） 的管中， 使 膜贴在管壁上， 在杂交仪中 %#‘ 旋转 ($ 68:， 加入 " （ 煮 沸 3 68: ） 后的地高辛标记探针 （ 杂交 #2 变性 液） ， %#‘ 旋转过夜， 将 P[ 膜在含 $D "W NON 的 # T NN[ 中洗涤 # 次， 每次 3 68:， 在含 $D "W NON 的 $D " T NN[ 中 ’*‘ 在杂交仪中旋转洗涤 # 次， 每次 "3 68:， 在 97J?8:; Q=LL1M 中洗涤 3 68:， 在 " T V2HBZ8:; JH2=I8H: 中浸泡 ($ 68:， 用 " T 封闭液 " d "$ $$$ 稀释 7:I84OXY4EG 偶联物， 将膜在上述抗体溶液中孵育 ($ 68:， 用 97J?8:; Q=LL1M 洗 # 次， 每次 "3 68:， 在中和 液中中和 3 68: 在显色液中避光显色， 时间可以为 3 68: _ "’ ?， 显色后用双蒸水浸泡 3 68:， 终止反应。
室， 安徽省基因研究重点实验室，合肥! #($$(#
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图 !" 肾癌的 512 原位杂交分析 -M 肾癌组织的 NC 染色O AM 肾癌的原位杂交分析
杂交后， 多采用碱性磷酸酶标记的抗 ’,B 抗体来显 示靶核酸。地高辛分子量小、 渗透性好， 在原位杂交 分析中具有高敏感性、 安全性、 特异性、 低本底和快 速、 简 便 等 优 点， 它甚至能够检测出人类基因组 ’(- 中单拷贝的基因。地高辛标记的核酸探针可 以稳定地处于冰冻状态下保存数月甚至 = 年， 可以 随时使用不受时间限制， 也不受实验室条件限制， 一 般实验室都可完成。为了提高探针的特异性及敏感 性， 模板 ’(- 的纯度一定要严格要求， 标记探针的 沉淀必须彻底干燥， 否则会明显增加杂交显色的背
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安徽医科大学学报! !"#$ %&’()*+’#$#’+ ,)-’"’&$.’+ !&/0’! #$$3 e1Q； &’ （"）
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