蛋白质电泳的方法及显色方法
蛋白质电泳操作步骤
SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。
(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。
（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。
（4）10% SDS（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。
（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。
c．染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
蛋白质电泳与操作
3. 分离；
1
4. 染色和脱色。
2
3
应用：用于分析蛋白质的分子量，常用于蛋白质 纯度鉴定和相对定量。
案例二：2-DE分析
• 2-DE简介：2-DE即双向凝胶电泳，是一种分离复杂 蛋白质混合物的方法。通过第一向等电聚焦和第二 向SDS-PAGE分离蛋白质，可展示蛋白质的等电点和 分子量。
案例二：2-DE分析
采用自动化技术，减少人为误差，提高电泳操作的重复性和可靠性。
04 蛋白质电泳实验注意事项
安全注意事项
1 2
避免使用未经灭菌的器具
在实验过程中，应确保所有使用的器具均经过严 格的灭菌处理，以防止微生物污染。
避免直接接触缓冲液
某些缓冲液可能含有刺激性或腐蚀性成分，应避 免直接接触皮肤或眼睛。
3
正确处理废弃物
03 蛋白质电泳技术优化
优化电泳条件
01
02
03
缓冲液选择
根据蛋白质的性质选择合 适的缓冲液，以提高电泳 分离效果。
电压与电流控制
优化电泳过程中的电压和 电流，以获得更好的分辨 率和分离效果。
电泳温度
选择适当的电泳温度，以 减少热量对蛋白质的干扰， 提高分辨率。
改进样品制备方法
样品溶解与变性
采用适当的溶解和变性方法，使蛋白质充分溶解并保持其天然构 象。
琼脂糖凝胶电泳
根据蛋白质分子的电荷和分子 量进行分离，常用于基因工程 和分子生物学研究。
等电聚焦电泳
根据蛋白质分子的等电点进行 分离，常用于蛋白质组学和生
物医学研究。
蛋白质电泳的应用
蛋白质组学研究
用于鉴定、分离和比较不同组织和细胞类型的蛋 白质，有助于深入了解生命活动的分子机制。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
蛋白质印迹显色方法
蛋白质印迹显色方法
蛋白质印迹显色方法，又称为Western blotting，是一种用于检测特定蛋白质在混合蛋白质样品中的存在和数量的方法。
其基本原理是将蛋白质样品在凝胶电泳中分离，然后将其转移至膜上，并通过与特异性抗体结合来检测目标蛋白质。
蛋白质印迹显色的具体步骤包括以下几个方面：
1. 凝胶电泳：将待检测的蛋白质样品通过凝胶电泳分离，这可以将蛋白质按照大小分开。
通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2. 转膜：将分离后的蛋白质转移到硝酸纤维素或聚乙烯醇酸酯等半透膜上，这样可以将蛋白质分离出来的凝胶膜转移到膜上。
3. 阻断：在膜上阻止非特异性结合，通常采用牛血清白蛋白或者非脂类牛奶粉等阻断剂进行处理，这可以避免抗体非特异性结合。
4. 检测：将目标蛋白质进行检测，通常采用与目标蛋白质特异性的抗体进行结合，随后采用辅助抗体进行检测。
5. 显色：通过显色剂将目标蛋白质反应出来，一般采用酶标记剂如HRP和AP 等，通过产生化学反应使显色剂发色。
总的来说，蛋白质印迹显色方法是一种精确可靠的蛋白质检测方法，广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫学等领域，可以用于检测蛋白质的相对分子量、表达水平、修饰状态等。
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂（1）水。
（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。
（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。
（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。
（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。
（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。
（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。
蛋白质电泳方法
蛋白质电泳方法一、背景介绍蛋白质是生物体内最基本的分子，具有多种功能。
蛋白质电泳是一种用于分离和检测蛋白质的方法，广泛应用于生物化学、生物医学和分子生物学等领域。
二、实验准备1. 样品制备：将待测样品加入适量的样品缓冲液中，使得样品中蛋白质浓度适宜。
2. 电泳缓冲液制备：根据实验需要配制合适的电泳缓冲液。
3. 凝胶制备：选择合适的凝胶类型，如聚丙烯酰胺凝胶或聚丙烯酰胺-SDS凝胶，并按照厂家说明书进行制备。
4. 样品加荧光染料：将待测样品加入荧光染料中，使得样品能够在紫外线下显示出明显的荧光信号。
三、电泳条件设置1. 凝胶预处理：将准备好的凝胶放入电泳槽中，注入足够量的电泳缓冲液，使得凝胶完全浸没在缓冲液中，静置20-30分钟。
2. 样品加载：将样品加入凝胶孔中，注意不要过度加载。
3. 电泳条件设置：根据凝胶类型和样品特性，设置合适的电泳条件，如电压、电流、时间等。
四、电泳操作步骤1. 加载样品：将准备好的样品加入凝胶孔中。
2. 开始电泳：将电泳槽连接至电源，开启电源，开始进行电泳。
3. 停止电泳：根据设定的时间或者运行距离停止电泳。
4. 凝胶染色：将凝胶浸入染色液中，使得蛋白质能够被染色剂染色。
5. 洗涤与成像：将凝胶洗涤干净后，在紫外线下成像或使用荧光成像仪进行成像。
五、结果分析1. 凝胶图谱分析：观察凝胶图谱上出现的蛋白质带型和大小，并与标记蛋白质对照进行比较分析。
2. 蛋白质含量计算：根据标记蛋白质对照和样品带型大小进行计算，得出样品中蛋白质的含量。
3. 蛋白质鉴定：根据凝胶图谱上出现的蛋白质带型和大小，结合其他实验结果进行蛋白质鉴定。
六、注意事项1. 样品制备时应注意避免蛋白质的降解和污染。
2. 电泳缓冲液的配制应严格按照说明书进行，避免出现电泳条件不稳定等问题。
3. 凝胶制备时应注意凝胶浓度、孔径大小等参数的选择，以及凝胶的完全固化和无气泡等问题。
4. 染色剂的选择应根据实验需要进行选择，并严格按照说明书操作。
血清蛋白电泳实验报告
一、实验目的1. 掌握电泳技术的基本原理和操作方法。
2. 学习使用醋酸纤维薄膜进行血清蛋白电泳分离。
3. 通过电泳分析，了解血清中各种蛋白质的分布情况。
4. 熟悉血清蛋白电泳在临床诊断中的应用。
二、实验原理血清蛋白电泳是一种利用蛋白质在电场中的迁移速度差异进行分离的技术。
由于血清中不同蛋白质的等电点、分子量和分子形状不同，它们在电场中的迁移速度也不相同。
通过在醋酸纤维薄膜上施加电场，蛋白质可以根据其带电性质和分子大小在薄膜上形成不同的区带。
在pH8.6的缓冲液中，血清中的蛋白质带负电荷，在电场作用下，带负电荷的蛋白质向正极移动。
分子量小、带电荷多的蛋白质迁移速度较快，而分子量大、带电荷少的蛋白质迁移速度较慢。
通过比较不同蛋白质在电泳过程中的迁移距离，可以实现对血清中蛋白质的分离和鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 血清样本- 醋酸纤维薄膜- 电泳缓冲液- 标准蛋白质溶液- 显色剂2. 实验仪器：- 电泳槽- 电源- 显微镜- 烤箱四、实验步骤1. 准备电泳缓冲液，调整pH至8.6。
2. 将血清样本和标准蛋白质溶液分别点样于醋酸纤维薄膜上。
3. 将薄膜放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，确保薄膜完全浸没。
4. 接通电源，进行电泳分离，电压设定为100V。
5. 电泳结束后，关闭电源，取出薄膜。
6. 使用显色剂对薄膜进行染色，观察并记录蛋白质区带。
7. 对电泳结果进行定量分析，计算各蛋白质区带的相对含量。
五、实验结果1. 血清蛋白电泳图谱：- 根据电泳结果，将血清蛋白分为五条主要区带：清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。
- 通过比较标准蛋白质溶液和血清样本的电泳图谱，可以初步判断血清中蛋白质的分布情况。
2. 定量分析：- 根据蛋白质区带的迁移距离，计算各蛋白质区带的相对含量。
- 结果显示，血清中清蛋白含量最高，其次是α1球蛋白和α2球蛋白。
六、实验讨论1. 电泳分离效果：- 本次实验中，血清蛋白电泳分离效果良好，五条主要区带清晰可见。
蛋白质电泳技术
蛋白质电泳技术
蛋白质电泳技术是一种分析液体或提取物中蛋白质的方法，可用于蛋白质的分离、分子量测定和纯度鉴定等。
百泰派克生物科技提供基于SDS-PAGE（sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）和双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）等的蛋白质分离和分析服务。
电泳技术
电泳（electrophoresis，EP）是电泳现象的简称，指的是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。
利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离粒子的技术称为电泳技术。
电泳法可以用少量样品以多种有或没有支持介质的方式进行，例如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）、自由流电泳、
等电聚焦电泳、等速电泳、亲和电泳、免疫电泳、对流电泳和毛细管电泳。
蛋白质电泳技术。
蛋白质电泳技术
蛋白质电泳技术常用于分离和分析蛋白质。
根据支持介质的不同，蛋白质电泳技术的种类有醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和毛细管电泳等。
其中，等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合又形成二维凝胶电泳（也称双向电泳，2-DE），可用于更好的分离蛋白质。
在2-DE的基础上又发展有双向荧光差异显示凝胶电泳（Two-dimensional fluorescence difference gel
electrophoresis，2D-DIGE），可在同一块胶上同时分离多个分别由不同荧光标记的样品。
wbmarke显色原理
wbmarke显色原理wbmarke显色原理是指在生物标记实验中，利用标记物质的性质，通过特定的方法或技术使标记物质在实验中产生特定的颜色反应，从而实现对实验结果的观察和分析。
wbmarke显色原理主要应用于Western blot实验中，用于检测蛋白质的表达水平和分子量。
在Western blot实验中，wbmarke显色原理通常涉及以下步骤：1. SDS-PAGE分离：首先，待检测的蛋白样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，将蛋白质按照分子量大小分离成条带。
2. 蛋白转印：将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质转移到膜上，通常使用PVDF或NC膜。
转印后的膜上形成与凝胶相同的蛋白质条带分布。
3. 抗原抗体结合：膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，一抗通常是特异性的抗蛋白抗体，能与膜上的目标蛋白结合形成抗原抗体复合物。
4. 辅助抗体结合：加入辅助抗体，通常是HRP或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗，能与一抗结合形成复合物，从而标记出蛋白质的位置。
5. 显色：加入显色底物，通常是TMB或BCIP/NBT，经过化学反应后形成显色产物，产生可见的颜色反应，用于观察蛋白质的表达水平和分子量。
在wbmarke显色原理中，不同的显色方法会产生不同的颜色反应，常见的显色方法有TMB显色和BCIP/NBT显色。
TMB显色产生蓝色反应，而BCIP/NBT显色产生紫色反应，可以根据实验需求选择合适的显色方法。
总的来说，wbmarke显色原理是通过将蛋白质标记物质标记在膜上的蛋白质上，通过特定的显色方法产生可见的颜色反应，实现对蛋白质的定量和分析。
通过对显色原理的理解和应用，可以更准确地检测和分析蛋白质的表达水平，为生物学研究提供重要的实验数据。
蛋白质电泳技术的新方法
蛋白质电泳技术的新方法蛋白质电泳技术是一种目前应用最广泛的蛋白质分离技术。
它可以将蛋白质按照其电荷、大小、形状等特性分离出来，为后续的蛋白质研究提供了有力的工具。
然而，传统的蛋白质电泳技术存在一些问题，例如分辨率低、信号噪声比较大等。
近年来，科学家们提出了一些新的蛋白质电泳方法，以解决这些问题。
第一种新方法是“大热卡电泳”。
这种技术最初由瑞典的科学家们发明，它基于蛋白质在高温条件下的凝胶电泳。
相比于传统的凝胶电泳方法，大热卡电泳可以提高样品的分辨率和灵敏度。
这是因为在高温下，样品中的蛋白质更容易在电场的作用下展开并分离出来，从而得到更为清晰的电泳图谱。
第二种新方法是“多维蛋白质电泳”。
这种技术是将不同的分离机制结合在一起，以实现更加精细的蛋白质分离。
它通常包括两个步骤：一维电泳和二维电泳。
一维电泳是在一个方向上将蛋白质分离开来，而二维电泳则是在两个方向上将蛋白质进行分离，从而得到更为完整的蛋白质图谱。
第三种新方法是“液相蛋白质电泳”。
这是一种基于高效液相色谱技术的蛋白质电泳方法。
它将蛋白质溶于流动相中，在某些特定的条件下，通过固相柱进行分离。
相比传统的凝胶电泳方法，液相蛋白质电泳具有分辨率高、信号噪声小、重复性好等优点。
此外，由于这种方法不需要凝胶或电泳模板，因此也可以大大减少实验的操作难度和时间。
第四种新方法是“胶体金蛋白质电泳”。
这是利用胶体金颗粒来标记蛋白质，然后通过电泳分离的一种技术。
胶体金颗粒是一种具有特殊光学性质的金属颗粒，可以通过表面修饰来与蛋白质结合。
利用胶体金标记蛋白质，可以减少样品在电泳过程中的流失，并且胶体金还可以通过一些特殊的检测方法来检测蛋白质的含量和性质。
总之，以上这些新的蛋白质电泳方法，都在不同程度上提高了蛋白质分离的分辨率和信号噪声比。
这为蛋白质研究提供了更为准确、快速和方便的手段，同时也为蛋白质电泳技术的发展开辟了新的方向。
我们相信在不久的将来，这些新方法还将逐渐得到更加广泛的应用。
蛋白质双向电泳
模块五蛋白质双向电泳1. 实验目的掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。
2. 实验原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH 环境中以阳离子形式向负极移动。
如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。
蛋白质电泳分析技术的使用方法
蛋白质电泳分析技术的使用方法蛋白质电泳分析技术是一种常用且有效的方法，用于检测和分析蛋白质样品中的蛋白质分子的大小、电荷和数量。
这项技术在生物学、医学、食品科学等领域中被广泛应用，能够帮助科研人员了解蛋白质的结构和功能，以及疾病发生发展过程中的相关变化。
蛋白质电泳分析技术主要分为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶等渗析（SDS-PAGE）两种形式。
两种方法都涉及酸碱平衡和电场作用，但它们的原理和应用略有不同。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是一种常见的蛋白质电泳分析方法。
该方法通过升高样品的离子浓度，使其具有电导性，将蛋白质在电场中进行电泳分离。
根据蛋白质的不同特性（如电荷或分子大小），能够获得不同的分离效果。
导致这种分离效果的原因是蛋白质在凝胶中的迁移速率与其大小和电荷有关。
通过比较迁移距离和已知标准物质，可以确定未知样品的分子量。
聚丙烯酰胺凝胶等渗析（SDS-PAGE）则是一种通过疏水作用来分离蛋白质的方法。
这种方法在分析蛋白质样品之前，对其进行SDS处理，使蛋白质变为负电荷，并且在样品中加入还原剂，破坏蛋白质之间的二硫键。
在电泳时，经过加热和电场作用，蛋白质在SDS胶的孔中进行分离。
SDS-PAGE通过评估样品中蛋白质的迁移速度和凝胶上已知标准物质的迁移速度来确定未知样品的分子量。
在进行蛋白质电泳分析之前，首先需要准备凝胶和缓冲液。
聚丙烯酰胺凝胶的制备通常需要两种缓冲液：分离凝胶缓冲液和聚丙烯酰胺胶缓冲液。
前者用于制备凝胶的梯度浓度，后者用于凝胶的固化。
SDS-PAGE还需要特定的缓冲液配制SDS凝胶。
在准备好所需的凝胶后，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液。
将样品预处理，通常会对样品进行热变性处理和还原处理。
然后将样品加载到蛋白质电泳槽中，并施加电场。
根据需要，可以进行常规的垂直电泳或水平电泳。
在电泳过程中，蛋白质会根据其电荷和大小在凝胶上迁移。
较小的蛋白质迁移得更远，较大的蛋白质迁移得更少。
western-blot与蛋白质双向电泳的原理,方法及应用
THANKS
LOREM IPSUM
沉淀蛋白质
除杂质
溶解
IPG胶条上样与第一向等点聚焦 将样品与水化上样缓冲液混合，体积比约为1:4
混合物加入胶条槽
除去保护膜，将胶条酸性端（尖端）朝胶条槽 阳极方向放入，慢慢下压，最后放入碱性端 （平端），使溶液浸湿胶条，避免生成气泡
将胶条槽平放在电泳仪上，对好正负极， 设定等电聚焦程序
在胶条上覆盖适量矿物 油，盖上盖
western blot与蛋白质双向电泳的原理， 方法及应用
演示人：胡祺祥，张锋，余涵
目
录
Contents
1
western blot原理及方法
2
蛋白质双向电泳原理及方法
3
医学应用
第
1
western blot原理及方法
章
一.基本原理
PAGE分离蛋白质 印迹转移
通过PAGE（聚丙烯
一抗，二抗杂交
第
3
医学应用
章
western blot的临床应用
01
过敏原检测 及方法建立
02
诊断寄生虫 病
03
检测基因产 物表达及水 平
04
检测病毒感 染
过敏原检测及方法建立
由于许多过敏原是来着生物体的机体，尤其表现在蛋白质上。 例如鱼类。鱼类是最常见的易引起过敏反应的食物，而小清蛋白是最常见的过敏原。在建立鱼小清蛋 白检测及方法建立过程中利用western blot法完成免疫鉴定，为低免疫产品研制生产提供理论依据。
底物显色或者放射自显影
酰胺凝胶电泳）分 离的蛋白质样品， 转移到固相载体上， 以固相载体上的这 些蛋白质或者多肽 作为抗原与对应的 抗体起免疫反应再 与酶或者同位素标 记的第二抗体起作 用，通过底物显色 或者放射自显影来 检测特定基因表达 的蛋白质
Western-Blot原理、显色分类及操作步骤
Western-Blot原理(yuánlǐ)、显色分类及操作步骤Western-Blot原理、显色(xiǎn sè)分类及操作步骤Western Blot原理、显色(xiǎn sè)分类及操作步骤(2008-08-14 23:07:59) 标签：western blot显色教育一、原理与Southern或Northern杂交方法(fāngfǎ)类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫(miǎnyì)反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便(fāngbiàn)也是最通用的方法。
western显色的方法(fāngfǎ)主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
二、操作步骤：(一) 配胶1、注意(zhù yì)一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光(bì ɡuānɡ)存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离(fēnlí)胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
蛋白质电泳的方法及显色方法-精选文档
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2:染色方法
（3）金属离子结合类
银染：基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合的原 理，主要实验步骤：固定，敏化，银液注入，显色，终止反映和图像 固定。 GelCode磷蛋白染色 这种方法依赖于在钙离子存在时，用0.5mol/L氢氧化钠水解磷酸 化蛋白质磷酸酯的连接。然后用钼酸铵在稀释的硝酸溶液中处理含有 新生成的不可溶磷酸钙的凝胶，最后用甲基氯染所形成不可溶的硝基 -钼酸盐复合物，脱色之后，磷蛋白被染成绿色。
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1: 一维蛋白质电泳方法——酸-尿素连续PAGE
简介：
非常适合研究同一蛋白的微小结构变体（有细微的 电荷差别）或修饰后的 形式（例如磷酸化，乙酰化 等）。而SDS-PAGE难以将大小相似而电荷不同的两种蛋 白分开。
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2:染色方法
（1）有机染料类： 1: 传统考马斯亮蓝R250(Commassie Blue R-250, CBR-250)染色 CBR-250是一种有机染料，它通常能通过范德华力与NH3+的静电引力， 与蛋白质形成紧密而非共价结合的复合物。与精氨酸和赖氨酸残基结合紧 密，而与芳香族侧链亲和性稍低。 2：快速考马斯亮蓝染色 通过使用微波炉加速了CBR-250染色和脱色的过程，同时提高了灵敏 度。 3：InstaStain Blue凝胶纸染色 通过使用一种含有考马斯亮蓝染料的纸将染料加到凝胶上去，这样就 避免了操作液体染料时产生的问题，而且可以减少染色背景。
一维蛋白质电泳的方法及显色方法
实验报告蛋白质电泳分析
实验报告蛋白质电泳分析实验报告：蛋白质电泳分析简介：蛋白质电泳分析是一种常用的生物化学实验方法，它通过电泳的原理实现对蛋白质的分离与检测。
本实验旨在通过蛋白质电泳分析技术，探究蛋白质在电泳过程中的迁移速度与电场强度、凝胶浓度之间的关系，并利用该方法鉴定混合蛋白质样品。
实验目的：1. 理解蛋白质电泳的基本原理及应用；2. 探究电场强度、凝胶浓度对蛋白质的迁移速度的影响；3. 利用蛋白质电泳分析方法鉴定混合蛋白质样品。
实验材料与方法：1. 实验仪器：蛋白质电泳仪、电源、冷却系统、相机等；2. 实验试剂：蛋白质样品、SDS-PAGE凝胶、电泳缓冲液、染色剂等。
实验步骤：1. 准备工作：- 酚酞染色溶液配制：将酚酞溶解于75%乙醇中，配制成2 g/L的酚酞溶液；- 凝胶制备：按照不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶试剂的说明书制备SDS-PAGE凝胶。
2. 凝胶电泳装置组装：- 将电泳槽填充至适当的高度，加入足够的电泳缓冲液；- 安装电泳仓盖，确认密封性。
3. 凝胶制备：- 预热凝胶：将SDS-PAGE凝胶预热至适当温度，倒入预制的凝胶模板中；- 安装梳子：固定两侧梳子，保证梳子与凝胶的紧密贴合；- 凝胶聚合：将预制的凝胶模板浸入电泳槽中，待凝胶完全聚合后取出。
4. 样品制备：- 蛋白质样品处理：样品加入SDS-PAGE凝胶样品缓冲液，并在水浴中加热至100℃，使其变性；- 样品负载：将处理后的样品负载至凝胶孔中。
5. 电泳条件设定：- 电场强度设置：按照实验要求，设定适当的电场强度；- 电泳时间设置：根据样品大小和电泳结果，设定合适的电泳时间。
6. 电泳过程：- 将装有样品的凝胶放入电泳槽中，连接电源；- 打开电源，开始进行电泳。
7. 凝胶染色与分析：- 电泳结束后，取出凝胶，进行酚酞染色；- 将染色的凝胶放入染色剂中浸泡一段时间，待蛋白质带出现后取出；- 实验结果记录与分析。
实验结果与分析：根据实验所得数据，我们绘制了蛋白质迁移距离与电场强度、凝胶浓度之间的关系曲线。
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一维蛋白质电泳方法—骏生物： 辉骏生物：/
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一维蛋白质电泳方法——CTAB——CTAB 1: 一维蛋白质电泳方法——CTAB-PAGE
简介： 简介： SDS属于阴离子去垢剂，在低温下会结晶，某些情况 下还会使蛋白质聚集或沉淀，而其有些蛋白质在SDS凝 胶中不能很好的溶解或者出现异常的迁移现象。 而CTAB属于阳离子去垢剂，可以很好的避免上述问 题，如果样品没有经过煮沸和外加还原剂，一些经CTAB 电泳系统分离的蛋白质仍然保持其酶活性。
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2:染色方法 2:染色方法
通常用来与蛋白质非共价结合并使之显色的标记物大致分为几类： ）：有机燃料类 有机燃料类。 （1）：有机燃料类。如考马斯亮蓝，利用吸光度检测。 ）：荧光探针类 荧光探针类。 （2）：荧光探针类。如Sypro染料和尼罗河红，通过荧光检测。 ）：金属离子结合类 金属离子结合类。该类又可分为两类。 （3）：金属离子结合类 一类是通过与不同盐结合而显色（如使用锌-咪唑染料进行复染或反 响染色） 另一类是利用金属离子的还原反映而被检测到，如银染。
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2:染色方法 2:染色方法
（1）有机染料类： 有机染料类： 1: 传统考马斯亮蓝R250(Commassie Blue R-250, CBR-250)染色 CBR-250是一种有机染料，它通常能通过范德华力与NH3+的静电引力， 与蛋白质形成紧密而非共价结合的复合物。与精氨酸和赖氨酸残基结合紧 密，而与芳香族侧链亲和性稍低。 2：快速考马斯亮蓝染色 通过使用微波炉加速了CBR-250染色和脱色的过程，同时提高了灵敏 度。 3：InstaStain Blue凝胶纸染色 通过使用一种含有考马斯亮蓝染料的纸将染料加到凝胶上去，这样就 避免了操作液体染料时产生的问题，而且可以减少染色背景。
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一维蛋白质电泳的方法及显色方法
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一维蛋白质电泳的方法及显色方法
1: 一维蛋白质电泳方法的分类 SDS（1）: SDS-PAGE CTAB（2）: CTAB-PAGE 尿素连续PAGE （3）: 酸-尿素连续PAGE Tricine-SDS（4）: Tricine-SDS-PAGE （5）: Native PAGE 2：凝胶染色方法
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2:染色方法 2:染色方法
（3）金属离子结合类 银染：基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合的原 理，主要实验步骤：固定，敏化，银液注入，显色，终止反映和图像 固定。 GelCode磷蛋白染色 这种方法依赖于在钙离子存在时，用0.5mol/L氢氧化钠水解磷酸 化蛋白质磷酸酯的连接。然后用钼酸铵在稀释的硝酸溶液中处理含有 新生成的不可溶磷酸钙的凝胶，最后用甲基氯染所形成不可溶的硝基 -钼酸盐复合物，脱色之后，磷蛋白被染成绿色。
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一维蛋白质电泳方法—— ——酸 尿素连续PAGE 1: 一维蛋白质电泳方法——酸-尿素连续PAGE
简介： 简介： 非常适合研究同一蛋白的微小结构变体（有细微的 电荷差别）或修饰后的 形式（例如磷酸化，乙酰化 等）。而SDS-PAGE难以将大小相似而电荷不同的两种蛋 白分开。
简介： 简介： SDS 是一种阴离子表面活性剂.当 SDS 与蛋白质混 合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋 白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数 蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位), 而蛋白质结合固定比例之 SDS后,由于 SDS 带强负价, 使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白 质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的 泳动速率就只剩下分子大小一项因素。
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一维蛋白质电泳方法——Tricine-SDS——Tricine 1: 一维蛋白质电泳方法——Tricine-SDS-PAGE
简介： 简介： Tricine-SDS-PAGE Tricine-SDS-PAGE适用与肽类的电泳，用tricine代 替了甘氨酸可以分离小到500Da的肽类，适合SDS-PAGE 肽图谱以及制备氨基末端，羧基末端测序的样品。
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2:染色方法 2:染色方法
（2）荧光探针类 有机染料在水溶液中不发荧光，单在非极性溶液中或者SDS-蛋 白质复合物相连时,就会发处很强的荧光，通过荧光扫描仪检测。 1：SYPRO Ruby 荧光染色， SYPRO Ruby 是一种过度金属有机 复合物，直接通过静电作用与碱性氨基酸相互作用。 2：SYPRO Orange荧光染色。
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一维蛋白质电泳方法——Native——Native 1: 一维蛋白质电泳方法——Native-PAGE
（5）: Native PAGE ） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入 SDS 和疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行 聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。 未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳 过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁 移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率， 尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物 活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上 进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于 活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所 有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。